張義敏，田明濤，李萍，唐承

(1 山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南250355；2 威海市胸科醫(yī)院)

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·基礎(chǔ)研究·

β-欖香烯對人肝癌細(xì)胞HepG2增殖的影響及機(jī)制探討

張義敏1，2，田明濤2，李萍2，唐承2

(1 山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南250355；2 威海市胸科醫(yī)院)

目的觀察β-欖香烯對人肝癌細(xì)胞株HepG2增殖的影響，并探討其作用機(jī)制。方法取對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞分為A、B、C、D組，分別置于含10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基、5 μg/mL β-欖香烯+10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基、10 μg/mL β-欖香烯+10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基、20 μg/mL β-欖香烯+10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。采用MTT法檢測培養(yǎng)0、24、48、72 h時(shí)細(xì)胞增殖抑制率，采用RT-PCR法檢測各組培養(yǎng)24 h時(shí)細(xì)胞軸蛋白(Axin)、結(jié)腸腺瘤息肉易感基因(APC)蛋白和β-連環(huán)蛋白(β-catenin) mRNA 。結(jié)果培養(yǎng)0、24、48、72 h各組細(xì)胞增殖抑制率均B組B組>C組>D組，各組細(xì)胞Axin、APC mRNA相對表達(dá)量為A組

肝癌；β-欖香烯；Wnt/β-catenin信號通路；軸蛋白；結(jié)腸腺瘤息肉易感基因；β-連環(huán)蛋白

原發(fā)性肝癌是我國常見的惡性腫瘤，病死率居惡性腫瘤的第3位[1]。肝癌的發(fā)生與病毒感染、肝硬化、攝入黃曲霉素、環(huán)境污染等有關(guān)，目前尚無有效治療方法[2]。近年研究發(fā)現(xiàn),多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與原發(fā)性肝癌的發(fā)生密切相關(guān)。Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(經(jīng)典Wnt通路)在生物發(fā)育、細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)、凋亡等過程中發(fā)揮重要作用[3]，其異?；罨c腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[4]。軸蛋白(Axin)、結(jié)腸腺瘤息肉易感基因(APC)蛋白和β-catenin是Wnt信號通路中的重要組成因子。莪術(shù)是我國姜科植物蓬莪術(shù)或溫郁金、廣西莪術(shù)的根莖，具有行氣破血、消積止痛的功效，以往常用于治療癥瘕痞塊、瘀血經(jīng)閉、胸痹心痛、食積脹痛[5]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，莪術(shù)具有抗腫瘤作用[6]。莪術(shù)根莖提取物β-欖香烯是莪術(shù)抗腫瘤的3種有效成分之一，可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，但其具體作用機(jī)制目前尚不明確。2014年8月～2015年11月，我們觀察了β-欖香烯對體外培養(yǎng)的人肝癌細(xì)胞HepG2增殖的影響，并探討其可能機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1材料HepG2購自中國科學(xué)院上海生化所細(xì)胞庫，RPMI 1640培養(yǎng)基與胎牛血清均購自Gibco公司，β-欖香烯購自中國藥品生物制品檢定所(NICPBP)，兔抗β-catenin、Axin、APC多克隆抗體購自Santa Cruz Biotech公司；鼠抗β-catenin、Axin、APC購自Beyotime公司。Tris、DTT、SDS、Nuclease Mix等購自美國Sigma公司，Immobiline Drystrip Cover Fluid、Immobiline Drystrip PH3-10NL等購自美國GE公司，Temed、CHAPS、 Electrophoresis Regent(T9281)購自美國Simga公司，CCK-8試劑盒購自江蘇碧云天公司。

1.2細(xì)胞分組及干預(yù)取對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞，置于含10%胎牛血清的RPMI 1640體外培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2、飽和濕度無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將細(xì)胞分為A、B、C、D組，分別置于含10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基、5 μg/mL β-欖香烯+10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基、10 μg/mL β-欖香烯+10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基、20 μg/mL β-欖香烯+10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.3HepG2細(xì)胞增殖觀察采用MTT 法。取各組對數(shù)生長期細(xì)胞接種于96孔板，3×103/孔，每組6個復(fù)孔。分別于培養(yǎng)0、24、48、72 h后加入10 μL CCK-8，2 h后用酶標(biāo)儀檢測波長450 nm處光密度(OD)值。以A組為對照，計(jì)算各組細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=(OD對照-OD觀察)/OD對照×100%。實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次。

1.4HepG2細(xì)胞β-catenin、Axin、APC mRNA檢測采用RT-PCR法。取各組培養(yǎng)24 h時(shí)對數(shù)生長期細(xì)胞，TRIzol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用sybr染色相對定量目標(biāo)基因的表達(dá)，具體實(shí)驗(yàn)步驟與條件參考文獻(xiàn)進(jìn)行[7]，引物購自克勞寧生物科技有限公司，以β-actin為內(nèi)參。β-catenin上游引物5′-ATGACTCGAGCTCAGAGGGT-3′，下游引物5′- ATTGCACGTGTGGCAAGTTC -3′；Axin上游引物5′-ACCGAAAGTACATTCTTGATAAC-3′，下游引物5′-TCCATACCTGAACTCTCTGC-3′；APC上游引物5′-GGATGGAGAAGGCGAAAGTGAG-3′，下游引物5′-TTGCCAAAGGGTAGGGAAATG-3′。以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，分別擴(kuò)增Axin、APC和β-catenin，復(fù)性溫度分別為52 ℃、52 ℃、55 ℃，循環(huán)數(shù)均為30次。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳(100 V、30 min)后，用BioImaging system觀察成像。用NIH image software分析產(chǎn)物帶灰度，以產(chǎn)物帶與β-actin條帶的灰度比值表示該基因的相對表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2　結(jié)果

2.1各組細(xì)胞增殖抑制率比較見表1。

表1　各組細(xì)胞增殖抑制率比較

注：與B組比較，*P<0.05；與C組比較，#P<0.05；與同組前一時(shí)點(diǎn)比較，☆P<0.05。

2.2各組細(xì)胞β-catenin、Axin、APC mRNA表達(dá)比較見表2。

表2　培養(yǎng)24 h時(shí)各組細(xì)胞β-catenin、Axin、APC mRNA相對表達(dá)量比較

注：與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05；與C組比較，△P<0.05。

3　討論

中藥單體或復(fù)方抗腫瘤的確切療效已得到國際公認(rèn)，是近年來研究熱點(diǎn)。中藥可作用于腫瘤發(fā)生、發(fā)展的多個環(huán)節(jié)，具有多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)、多效應(yīng)的特點(diǎn)。其在抑制、殺傷腫瘤細(xì)胞、改善癥狀與體征，以及減輕放化療不良反應(yīng)、延長患者生存期等方面發(fā)揮重要作用；同時(shí)，具有不良反應(yīng)少，能提高機(jī)體免疫力，不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)。β-欖香烯是莪術(shù)主要成分之一，是臨床用于治療惡性漿膜腔積液、肺癌、消化道腫瘤、腦瘤以及其他淺表性腫瘤的潛在新藥，具有很強(qiáng)殺滅腫瘤細(xì)胞及抑制腫瘤生長作用[8]。研究發(fā)現(xiàn)，欖香烯聯(lián)合TACE治療肝癌可增加腫瘤反應(yīng)率，延長腫瘤進(jìn)展時(shí)間，并能夠有效改善肝癌患者的生存質(zhì)量[9，10]，但其具體機(jī)制尚有待探討。

Wnt/β-catenin信號通路在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中起著重要的作用，針對Wnt/β-catenin信號通路中的關(guān)鍵分子靶向治療肝癌，已成為肝癌治療的新方向[11]。β-catenin/T細(xì)胞可調(diào)節(jié)Wnt靶基因的表達(dá)，其中β-catenin是正向調(diào)節(jié)因子，APC、Axin在Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起負(fù)向調(diào)節(jié)作用[12，13]。研究認(rèn)為，β-catenin基因是一種原癌基因，其表達(dá)產(chǎn)物β-catenin主要位于細(xì)胞膜，是Wnt信號通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，決定著Wnt信號的開放或關(guān)閉。正常情況下，β-catenin介導(dǎo)Wnt信號從細(xì)胞膜到細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核的傳遞，從而使Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路得以啟動激活并順利進(jìn)行[14]。在異常Wnt信號通路中，β-catenin降解障礙致使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)游離的β-catenin積聚并進(jìn)入細(xì)胞核，并最終導(dǎo)致癌變的發(fā)生[15]。APC蛋白是一個多功能蛋白，可作為一個多種蛋白質(zhì)復(fù)合物相互連接的骨架，在細(xì)胞周期、運(yùn)動、黏附以及信號傳導(dǎo)過程中發(fā)揮著重要作用，是Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要組成分子[16]。APC蛋白可控制β-catenin在細(xì)胞內(nèi)的含量,在正常細(xì)胞內(nèi)通過與Axin、GSK-3β蛋白結(jié)合，促進(jìn)β-catenin在細(xì)胞內(nèi)的降解[17]。APC基因突變或蛋白異常可使Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常激活，引起多種原癌基因持續(xù)轉(zhuǎn)錄而最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[18]。Axin與APC一樣，是一種重要的骨架蛋白，是支架蛋白復(fù)合體的構(gòu)建基礎(chǔ)，同時(shí)通過Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與一系列生物學(xué)效應(yīng)的調(diào)控,如體軸發(fā)育、細(xì)胞死亡、神經(jīng)元的分化等，是一個新發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制因子[19]。Axin在各種腫瘤組織中存在不同情況的突變，其無法發(fā)揮在Wnt信號傳導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)作用，使細(xì)胞正常凋亡無法繼續(xù)進(jìn)行，引起腫瘤細(xì)胞異常增殖。

本研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)0、24、48、72 h,各組細(xì)胞增殖抑制率均為B組B組>C組>D組，β-catenin、Axin、APC mRNA相對表達(dá)量為A組

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唐承(E-mail: tangcheng968@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.18.009

R735.7

A

1002-266X(2016)18-0029-03

2016-03-18)