王劍鋒，李平

(安徽醫(yī)科大學附屬安徽省立醫(yī)院，合肥230001)

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E盒鋅指蛋白1反轉錄本1對人膀胱癌細胞增殖、遷移及凋亡的影響

王劍鋒，李平

(安徽醫(yī)科大學附屬安徽省立醫(yī)院，合肥230001)

目的研究E盒鋅指蛋白1反轉錄本1(ZEB1-AS1)對人膀胱癌細胞5637增殖、遷移、凋亡的影響。方法取適量對數(shù)生長期5637細胞分為觀察組和對照組，分別用特異性的陽性對照小干擾RNA ZEB1-AS1、特異的陰性對照小干擾RNA轉染細胞，采用實時熒光定量qRT-PCR法觀察轉染48 h兩組細胞ZEB1-AS1 mRNA；采用MTT法觀察轉染24、48、72 h細胞增殖情況，采用細胞劃痕實驗觀察轉染48 h細胞遷移情況，采用流式細胞儀檢測轉染48 h細胞凋亡情況。結果轉染48 h觀察組和對照組ZEB1-AS1 mRNA的相對表達量分別為0.525 3±0.043 2、1.000 0±0.020 2，P<0.05；觀察組轉染24、48、72 h細胞增殖的OD值分別為0.316 4±0.007 8、0.595 4±0.032 5、0.770 3±0.030 7，對照組分別為0.452 9±0.016 1、0.732 6±0.037 0、0.920 4±0.018 9，組間比較P均<0.05；轉染48 h時觀察組和對照組的細胞遷移距離分別為(0.435±0.005)、(0.680±0.020)cm，P<0.05。轉染后48 h觀察組和對照組的細胞凋亡指數(shù)分別為 15.70±0.94、14.53±0.69，P<0.05。結論ZEB1-AS1可促進人膀胱癌細胞增殖、遷移，抑制細胞凋亡，可能在膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。

膀胱癌；長鏈非編碼RNA；E盒鋅指蛋白1反轉錄本1；細胞增殖；細胞凋亡；細胞遷移

膀胱癌發(fā)病率居泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)病率首位，復發(fā)率和晚期病死率均較高，目前尚無有效治療方法[1～3]，研究其發(fā)生機制具有重要臨床治療意義。長鏈非編碼RNA (LncRNA)是一類不翻譯和不編碼蛋白質的長鏈RNA[4～6]，可在轉錄、轉錄后及表觀遺傳等階段調控基因表達，參與物種進化、細胞分化、器官形成、胚胎發(fā)育、物質代謝等基礎生命活動，在胃癌、乳腺癌和食管癌等人類腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[7～12]。E盒鋅指蛋白1反轉錄本1(ZEB1-AS1)是最新發(fā)現(xiàn)的一種LncRNA，其異常表達在食管鱗狀細胞癌和肝癌中起重要作用[13，14]，但其在膀胱癌中的作用機制尚不明確。2014年4月～2016年1月，我們觀察了ZEB1-AS1對人膀胱癌細胞5637增殖、遷移、凋亡的影響。現(xiàn)報告如下。

1　材料與方法

1.1材料5637由安徽省立醫(yī)院中心實驗室惠贈。Lipofectamine2000、TRIzol試劑購自美國Invitrogen 公司，RPMI-1640培養(yǎng)基、谷氨酰氨、青霉素-鏈霉素混合液胎牛血清(FBS)購自美國Gibco 公司，四甲基偶氮唑鹽(MTT) 、二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma Aldrich 公司，高速冷凍離心機購自美國Sigma 公司，NanoDrop2000 超微量分光光度計購自美國Thermo Scientific 公司，Thermal Cycler C1000 PCR 儀購自美國Bio-Rad公司，Light Cycler 480Ⅱ 實時熒光定量PCR 儀購自瑞士Roche公司，THZD 型臺式恒溫振蕩器購自江蘇省太倉市實驗設備廠，DTX880 熒光檢測儀購自美國Beckman Coulter 公司。

1.2 細胞分組及轉染取適量5637細胞于含10%FBS、1%谷氨酰胺、1%青霉素-鏈霉素混合液的完全RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞，接種于96孔板中，分為觀察組和對照組，每組6個復孔。待細胞貼壁且融合度達到40%～60%時，觀察組和對照組分別用特異性的陽性對照小干擾RNA ZEB1-AS1(si-ZEB1-AS1,5′-CCAUGAAUUCCUUCCUAAA-3′,蘇州吉瑪基因股份有限公司)、特異的陰性對照小干擾RNA(si-NC,5′-UUUAGGAAGGAAUUCAUGG-3′ ,蘇州吉瑪基因股份有限公司)，37 ℃孵育6 h，棄轉染液，置于10% FBS的正常RPMI-1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)備用。

1.3細胞ZEB1-AS1 mRNA檢測采用實時熒光定量qRT-PCR法。取轉染48 h 的兩組細胞，按照TRIzol 試劑說明書提取總RNA,逆轉錄合成cDNA，所有操作嚴格按照使用說明書進行。上下游引物序列均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，ZEB1-AS1上游引物：5′-ATTGTTAGGAAAGGTTATAAAATTT-3′，下游引物：5′-ACCCAAACTATATAAAAAATTACAC-3′[13]；GAPDH上游引物：5′-CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3′，下游引物：5′-ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC-3′。 反應條件:94 ℃預變性反應30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

1.4細胞增殖觀察采用MTT法。分別取轉染24、48、72 h的兩組細胞，接種于96 孔中， 每組5個復孔。加入10 μL /孔MTT 溶液，培養(yǎng)4 h后棄培養(yǎng)液；加入DMSO 150 μL/孔，震蕩10 min 后，在酶標儀波長490 nm 處檢測各孔光密度(OD)值。重復3次，取平均值，以各組OD值代表細胞的增殖情況。

1.5細胞遷移情況觀察采用細胞劃痕實驗。收集轉染48 h兩組細胞,接種于6孔板，每組6個復孔。細胞融合度90%以上時，轉染并繼續(xù)放置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。用200 μL無菌移液槍頭劃線,立即在光學顯微鏡下拍照；更換新鮮的培養(yǎng)基，放置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h后再次拍照。取5個視野，測量劃痕兩側細胞間距，取平均值，重復3次，以劃痕兩側細胞間距平均值代表細胞遷移情況。

1.6細胞凋亡觀察采用流式細胞儀。取轉染后48 h對數(shù)生長期細胞，消化收集細胞并洗滌，然后重懸于200 μL的結合緩沖液。加入10 μL AnnexinV-FTC 和5 μL PI后輕輕混勻，避光并室溫反應15 min；加入300 μL結合緩沖液，用流式細胞儀檢測細胞凋亡數(shù)目，計算細胞凋亡指數(shù)。凋亡指數(shù)=凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100。

2　結果

2.1兩組細胞ZEB1-AS1 mRNA相對表達量比較轉染48 h觀察組和對照組ZEB1-AS1 mRNA相對表達量分別為0.525 3±0.043 2、1.000 0±0.020 2，P<0.05。

2.2兩組細胞增殖情況比較見表1。

2.3兩組細胞遷移情況比較轉染48 h時觀察組和對照組的細胞遷移距離分別為(0.435±0.005)、(0.680±0.020)cm，P<0.05。

2.4兩組細胞凋亡指數(shù)比較轉染48 h觀察組和

表1　轉染24、48、72 h兩組細胞增殖情況比較

注：與對照組比較，#P<0.05。

對照組的細胞凋亡指數(shù)分別為15.70±0.94、14.53±0.69，P<0.05。

3　討論

膀胱癌的發(fā)生是多種內(nèi)外因相互影響導致的復雜病理過程。最新研究發(fā)現(xiàn)，膀胱細胞DNA改變的緩慢過程與C-myc、Bcl-2、H-Ras等癌基因的激活和p53、p21、Rb等抑癌基因的失活密切相關[15]，但具體發(fā)病機制至今仍不明確。近年研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA的異常表達與腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展以及預后密切相關[4～7],對于這種在癌癥中異常表達的LncRNA的功能和機制仍有待進一步研究探索。文獻報道，許多LncRNA在在腫瘤發(fā)生發(fā)展起著癌基因調控作用[7,9,12]，因此異常表達的LncRNA將有助于腫瘤的診斷治療以及預后指導。研究發(fā)現(xiàn),PVT1、UCA 以及SPRY4-IT1等LncRNA在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中起著癌基因的作用[7,16]。

ZEB1-AS1是LncRNA家族中的一員,其是胚胎發(fā)育、細胞分化、腫瘤的發(fā)生發(fā)展等生理病理過程必不可少的轉錄因子。ZEB1-AS1的表達水平與食管癌的發(fā)生、發(fā)展及預測患者預后密切相關[9]；過表達的ZEB1-AS1可促進肝癌的轉移，預測患者預后。因此，推測ZEB1-AS1可能對膀胱惡性腫瘤有類似的作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，膀胱癌組織中ZEB1-AS1表達高于癌旁正常組織。本研究發(fā)現(xiàn)，轉染48 h觀察組ZEB1-AS1 mRNA的相對表達量低于對照組，轉染24、48、72 h觀察組細胞增殖的OD值均低于對照組，轉染48 h時觀察組的細胞遷移距離低于對照組，細胞凋亡指數(shù)高于對照組，說明ZEB1-AS1可促進5637細胞增殖、遷移，抑制細胞凋亡，推測其可能作用機制為：①ZEB1-AS1可作為膀胱癌癌基因直接參與膀胱癌的基因調控，促進膀胱癌細胞的增殖；②ZEB1-AS1可通過調節(jié)上皮細胞間質轉型參與膀胱癌的發(fā)生，促進膀胱癌細胞增殖、遷移，抑制凋亡[13]；③通過激活癌基因或者抑制抑癌癌基因，間接促進膀胱癌的增殖、遷移以及抑制凋亡[14]。

綜上所述，ZEB1-AS1的表達與人膀胱癌細胞的增殖、遷移、凋亡密切相關，其可能是一種發(fā)揮正調控作用的癌基因。本研究對提高膀胱癌的早期診斷及基因靶向治療有重要的指導意義。后續(xù)將進一步研究ZEB1-AS1在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展中的具體作用機制。

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Effects of ZEB1-AS1 on proliferation, migration and apoptosis of bladder cancer cells

WANGJianfeng,LIPing

(AnhuiProvincialHospital,Hefei230001,China)

ObjectiveTo study the effects of zinc E box 1 antisense 1 (ZEB1-AS1) on proliferation, migration and apoptosis of human bladder cancer 5637 cell line (5637 for short as follow). MethodsWe took suitable amount of 5637 cells in logarithmic phase and divided them into the observation group and control group, which were respectively transfected with the specific positive control small interference RNA ZEB1-AS1 (si-ZEB1-AS1) and the specific negative control small interference RNA (si-NC). The real-time qRT-PCR was used to detect ZEB1-AS1 mRNA after 48-hour transfection. MTT assay was used to detect the cell proliferation at 24, 48, 72 h after transfection, scratch assay was used to detect the cell migration at 48 h after transfection, and flow cytometry was used to detect the apoptosis at 48 h after transfection. ResultsAfter 48-hour transfection, the relative expression of ZEB1-AS1 mRNA in the observation group and control group was respectively 0.525 3±0.043 2 and 1.000 0±0.020 2,P<0.05; the OD values of the observation group at 24, 48 and 72 h after transfection were respectively 0.316 4±0.007 8, 0.595 4±0.032 5 and 0.770 3±0.030 7, and those in the control group were respectively 0.452 9±0.016 1, 0.732 6±0.037 0 and 0.920 4±0.018 9, allP<0.05. The cell migration distance after 48-hour transfection in the observation group and control group were respectively (0.435±0.005) and (0.680±0.020) cm,P<0.05. After 48-hour transfection, the cell apoptosis index in the observation group and control group were respectively 15.70± 0.94 and 14.53±0.69,P<0.05.ConclusionZEB1-AS1 can promote the cell proliferation, migration, and inhibit apoptosis of human urinary bladder cancer cells, which may play an important role in the occurrence and development of bladder cancer.

urinary bladder carcinoma; long non-coding RNA; zinc E box 1 antisense 1; cell proliferation; apoptosis; cell migration

國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)腫瘤病學重點學科經(jīng)費資助[國中醫(yī)藥發(fā)(2009)30號]。

王劍鋒(1987-)，男，碩士研究生在讀，主要研究方向為老年腫瘤的中西醫(yī)結合治療。E-mail： 754559269@qq.com

簡介：李平(1964-)，男，教授，主任醫(yī)師，碩士生導師，主要研究方向為老年腫瘤的中西醫(yī)結合治療。E-mail： 754559269@qq.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.18.005

R737.14

A

1002-266X(2016)18-0015-03

2016-01-22)