梁新軍，魏少忠

(湖北省腫瘤醫(yī)院，武漢430079)

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Shh信號通路阻斷對人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29增殖、侵襲的影響及機(jī)制探討

梁新軍，魏少忠

(湖北省腫瘤醫(yī)院，武漢430079)

目的觀察阻斷Sonic Hedgehog(Shh)信號通路對人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29增殖和侵襲的影響，并探討其機(jī)制。方法取對數(shù)生長期HT-29細(xì)胞分為A、B、C、D組，分別置于含0、5、10、20 μmol/L Shh信號通路特異性抑制劑Cyclopamine的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。采用MTT法檢測各組干預(yù)24、48、72 h時(shí)細(xì)胞增殖抑制率，采用Transwell法檢測各組干預(yù)48 h時(shí)體外侵襲能力，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測各組細(xì)胞Shh、下游轉(zhuǎn)錄因子GLI1 mRNA。結(jié)果干預(yù)24、48、72 h時(shí)各組細(xì)胞增殖抑制率為B組B組>C組>D組，P均<0.05。結(jié)論阻斷Shh信號通路可抑制HT-29細(xì)胞增殖、降低體外侵襲能力，可能與其降低Shh、GLI1表達(dá)有關(guān)。

結(jié)腸癌；Shh信號通路；下游轉(zhuǎn)錄因子；細(xì)胞增殖；細(xì)胞侵襲

結(jié)腸癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率已躍居全球惡性腫瘤的第3位，其發(fā)病機(jī)制目前尚不明確[1]?；蛲蛔兒捅碛^遺傳學(xué)改變等參與了結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程[2]。Sonic Hedgehog(Shh)信號通路是調(diào)控胚胎發(fā)育及細(xì)胞分化的重要通路，GLI1是其下游轉(zhuǎn)錄因子。研究發(fā)現(xiàn)，Shh信號通路在肺癌、乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤中呈激活狀態(tài)，且與腫瘤的惡性程度和患者預(yù)后密切相關(guān)[3～5]。目前Shh信號通路在結(jié)腸癌中的具體作用機(jī)制的研究報(bào)道較少。2015年1～12月，我們觀察了阻斷Shh信號通路對人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29增殖和侵襲的影響，并探討其在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展中的意義?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1材料HT-29購自美國ATCC公司，置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基及TRIzol為美國Gibco公司產(chǎn)品；胰酶、DMSO、MTT、Shh信號通路特異性抑制劑Cyclopamine等購自Sigma公司；SYBR Premix EX Taq試劑盒購自Invitrogen公司；引物由上海吉瑪公司合成；Transwell小室購自Corning公司；Bio-Rad iQ5實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自Bio-Rad公司；Multiskan MK3全自動酶標(biāo)儀購自Thermo公司。

1.2細(xì)胞分組及處理取對數(shù)生長期HT-29細(xì)胞，胰酶消化、重懸后分為A、B、C、D組，分別置于含0、5、10、20 μmol/L Cyclopamine的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每組6個(gè)復(fù)孔，均置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3HT-29增殖情況觀察采用MTT法。分別于干預(yù)24、48、72 h取對數(shù)生長期各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度5×104/mL。每孔200 μL接種于96孔板，每組6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h，加入20 μL的MTT(5 g/L)行MTT檢測，所有操作均嚴(yán)格按照使用說明書進(jìn)行。采用酶標(biāo)儀檢測各組490 nm波長處的吸光度值，計(jì)算增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=(對照組吸光度值-實(shí)驗(yàn)組吸光度值)/對照組吸光度值×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4HT-29侵襲能力觀察采用Transwell法。干預(yù)48 h時(shí)取對數(shù)生長期各組細(xì)胞，1×105/mL培養(yǎng)在無血清的PRMI 1640培養(yǎng)基中，置于Transwell小室上室，下室每孔加入0.5 mL含10%胎牛血清的PRMI 1640培養(yǎng)基。置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h。拭去上室表面剩余細(xì)胞，將遷移到下室的細(xì)胞用多聚甲醛固定30 min，Giemsa染色15 min；顯微鏡下計(jì)數(shù)，以穿膜細(xì)胞數(shù)表示細(xì)胞的侵襲能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5細(xì)胞Shh、GLI1 mRNA檢測采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。干預(yù)48 h時(shí)取對數(shù)生長期各組細(xì)胞，照TRIzol試劑盒說明提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按照SYBR試劑盒說明進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，對Shh、GLI1的mRNA進(jìn)行定量檢測。引物采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)，具體如下：Shh上游引物5′-CCAACGTAGCCGAGAAGACC-3′，下游引物5′-TCC-CGTGTTTCCTCATCCT-3′；Gli1上游引物5′-TGAGGTGGGCAGGTTAGGA-3′，下游引物5′-CAGAGGGAGATGGGGTGTTTT-3′。內(nèi)參GAPDH上游引物5′-TGTCCCCACCCCCAATGTATC-3′，下游引物5′-CTCCGATGC CTGCTTCACACCTT-3′。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃、30 s，58 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共35個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。

2　結(jié)果

2.1各組細(xì)胞增殖抑制率比較見表1。

表1　干預(yù)24、48、72 h時(shí)各組細(xì)胞增殖抑制率比較

注：與B組同時(shí)點(diǎn)比較，#P<0.05；與C組同時(shí)點(diǎn)比較，*P<0.05；與本組前一時(shí)點(diǎn)比較，△P<0.05。

2.2各組穿膜細(xì)胞數(shù)比較干預(yù)48 h時(shí)，A、B、C、D組的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(55.670±6.506)、(35.330±7.371)、(28.330±4.041)、(23.330±2.309)個(gè)。B、C、D組穿膜細(xì)胞數(shù)均低于A組(P均<0.05)，但B、C、D組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3各組Shh、GLI1 mRNA表達(dá)比較各組Shh、GLI1 mRNA的相對表達(dá)量均為A組>B組>C組>D組，P均<0.05。見表2。

表2　各組HT-29組織Shh、GLI1 mRNA相對表達(dá)量比較

注：與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05；與C組比較，ΔP<0.05。

3　討論

目前認(rèn)為結(jié)腸癌的發(fā)生是多因素、多步驟的復(fù)雜過程，基因突變和表觀遺傳學(xué)改變等均參與了結(jié)腸癌的侵襲與轉(zhuǎn)移過程，但其確切機(jī)制尚不明確[6～8]。國內(nèi)外學(xué)者已發(fā)現(xiàn)多個(gè)與結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因，如VEGF、MMP-9等，并針對這些因子采取了包括藥物、基因轉(zhuǎn)染等多種方法進(jìn)行調(diào)控，雖能取得部分抑制轉(zhuǎn)移的效果，但結(jié)果尚不滿意[9～11]。

Shh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路不僅在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，也參與了組織修復(fù)和細(xì)胞再生以及腫瘤發(fā)生和發(fā)展的過程。目前認(rèn)為，Shh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要由Hh信號肽、跨膜受體以及下游轉(zhuǎn)錄分子組成，通過復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程將上游信號傳遞到核內(nèi)，進(jìn)一步促進(jìn)下游基因的表達(dá)而參與細(xì)胞的各項(xiàng)調(diào)控過程[12,13]。研究表明，Shh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵信號分子主要有Shh、跨膜蛋白受體Ptch、Smo及下游的轉(zhuǎn)錄因子Gli等。在Shh信號被激活后，Shh與跨膜蛋白受體Ptch(Ptch1、Ptch2)相結(jié)合，解除了其對Smo的抑制作用，繼而傳遞信號至下游的Gli(Gli1、Gli2、Gli3)，Gli蛋白進(jìn)入核內(nèi)后進(jìn)一步激活下游NF-κB、Bmi-1等因子的表達(dá)，從而參與調(diào)控細(xì)胞的增殖與凋亡過程。Shh信號可能通過多種機(jī)制參與調(diào)控惡性腫瘤細(xì)胞的增殖與侵襲[14，15]。Sharma等[16]研究發(fā)現(xiàn)，Shh信號可能與PI3K/Akt/mTOR信號共同參與了胰腺癌干細(xì)胞增殖和分化的調(diào)控過程，繼而參與了胰腺癌的侵襲與轉(zhuǎn)移。Giakoustidis等[17]研究認(rèn)為，Shh信號、WNT/β-catenin信號及Notch信號等可能共同參與了肝癌侵襲與轉(zhuǎn)移的過程。本研究前期研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌中Shh信號通路呈異常激活狀態(tài)，本研究發(fā)現(xiàn)，干預(yù)24、48、72 h時(shí)各組細(xì)胞增殖抑制率均為B組B組>C組>D組，說明阻斷Shh信號通路可抑制HT-29細(xì)胞增殖，降低細(xì)胞體外侵襲能力，可能與其降低Shh、GLI1表達(dá)有關(guān)。今后應(yīng)進(jìn)一步深入探究Shh信號通路相關(guān)分子在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展中的具體作用機(jī)制。

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Effects of blocking Shh signaling pathway on proliferation and invasion of colon cancer cell line HT-29

LIANGXinjun,WEIShaozhong

(HubeiCancerHospital,Wuhan430079,China)

ObjectiveTo observe the effects of blocking Sonic Hedgehog (Shh) signaling pathway on the proliferation and invasion of colon cancer cell line HT-29 and to investigate the mechanism. MethodsHT-29 cells in the logarithmic phase were divided into groups A, B, C, and D and were cultured in the culture medium containing 0, 5, 10 and 20 mol/L Shh signaling pathway specific inhibitor Cyclopamine, respectively. The inhibitory rate of cell proliferation was detected by MTT method at 24, 48 and 72 h after the treatment of Cyclopamine. Transwell method was used to detect the invasive ability of each group at 48 h. The Shh and downstream transcription factor GLI1 mRNA in HT-29 cells was detected by real-time fluorescence quantitative PCR. ResultsThe proliferation inhibition rate at 24 h, 48 h and 72 h: group Bgroup B>group C>group D, allP<0.05. ConclusionBlocking Shh signaling pathway can inhibit the proliferation of HT-29 cells and decrease the invasion ability in vitro, which may be related to the decreased expression of Shh and GLI1.

colon carcinoma; Sonic Hedgehog signaling pathway; downstream transcription factor; cell proliferation; cell invasion

湖北省武漢市科技局科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013062301010813)；湖北省武漢市晨光計(jì)劃(2015070404010204)。

梁新軍(1976-)，男，博士，副主任醫(yī)師，主要研究方向?yàn)槟[瘤免疫。E-mail： doctorlxj@163.com。

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.18.004

R735.3

A

1002-266X(2016)18-0012-03

2016-01-11)