宋唯唯　劉芬芬　劉彩紅

(泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東泰安　271016)

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銀杏葉提取物與其黃酮類物質(zhì)抗氧化作用的比較*

宋唯唯劉芬芬劉彩紅

(泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東泰安271016)

目的比較銀杏葉提取物與其總黃酮的抗氧化能力。方法用流動注射化學(xué)發(fā)光法和紫外分光光度法檢測銀杏葉提取物及其總黃酮清除O2-·、·OH和DPPH·的能力。結(jié)果銀杏葉提取物及其總黃酮對O2-·、·OH和DPPH·三種自由基均有一定的清除作用，且清除作用隨濃度的增加而增加；當(dāng)二者總黃酮醇苷濃度相同時，銀杏葉提取物對三種自由基的清除能力均高于其總黃酮。結(jié)論銀杏葉提取物的抗氧能力強于銀杏葉提取物總黃酮。

銀杏葉提取物；銀杏葉黃酮；抗氧化

銀杏葉提取物(Ginkgo biloba extracts，EGB)是銀杏的干燥葉經(jīng)提取純化后得到的淺黃色粉末，具有抗腫瘤、清除自由基、抗氧化等藥理作用[1-2]。研究表明EGB能夠有效清除活超氧陰離子自由基、過氧自由基及NO自由基，具有抗氧化損傷作用[3-4]。EGB中主要活性成分為黃酮醇苷類和萜內(nèi)酯類化合物，且標(biāo)準(zhǔn)EGB中銀杏總黃酮含量不少于24%。眾所周知，黃酮類物質(zhì)具有很好的抗氧化作用，如果能夠明確EGB與其總黃酮抗氧化能力的強弱，必將對EGB進一步的臨床應(yīng)用及EGB產(chǎn)品的開發(fā)提供幫助。為更好地開發(fā)和利用EGB這一藥用資源，本研究采用流動注射化學(xué)發(fā)光法和紫外分光光度法，比較了EGB與其黃酮類物質(zhì)對活性氧自由基(O2-·，·OH)和對DPPH自由基的清除能力。

1　儀器與試劑

1.1試劑對照品槲皮素、山柰素和異鼠李素購自中國藥品生物制品檢定所；銀杏葉提取物購自西安昌岳植物化工有限公司；魯米諾(Sigma公司)；DPPH(北京中生瑞泰科技有限公司)；鄰苯三酚、維生素C、鐵氰化鉀、過氧化氫、磷酸、無水乙醇等試劑均為分析純；甲醇為色譜純；實驗用水均為二次蒸水。

1.2儀器IFFM-D型流動注射化學(xué)發(fā)光分析儀(西安瑞邁科技有限公司)；大連依利特EC2006高效液相色譜儀，包括UV230II紫外-可見檢測器。

2　方法

2.1溶液的配制用甲醇配制槲皮素、山奈素、異鼠李素對照品儲備液，置于棕色容量瓶中，4℃保存，備用。鄰苯三酚溶液用1 mmol·L-1的HCl配制，使用前用水稀釋至所需濃度；魯米諾用0.1 mol·L-1NaHCO3-Na2CO3緩沖溶液配制成所需濃度；亞鐵氰化鉀、H2O2用KH2PO4-NaOH(pH=7.20)緩沖溶液配制，臨用前配制。精密稱取4 mg DPPH試劑，置于250 ml棕色容量瓶中，用無水乙醇定容，4℃保存，備用。

2.2銀杏葉提取物總黃酮的制備稱取6 g銀杏葉提取物于300 ml、60℃的熱水中溶解，并快速冷卻至室溫，用150 ml正丁醇萃取，重復(fù)操作共四次，收集正丁醇層，然后60℃下減壓濃縮干燥即得EGB黃酮。

2.3黃酮醇苷含量測定用HPLC法測定總黃酮醇苷的含量。采用Hypersil ODS2色譜柱(4.6×250 mm，5 μm)，流動相甲醇-0.4%磷酸溶液(55∶45)，檢測波長360 nm，流速1.0 ml/min。用外標(biāo)法計算樣品中槲皮素、山奈素、異鼠李素的含量，按總黃酮醇苷含量=(槲皮素含量+山柰素含量+異鼠李素含量)×2.51計算。EGB中總黃酮醇苷含量為24.76%，EGB黃酮中總黃酮醇苷含量為32.5%。

2.4抗氧化能力的檢測

2.4.1O2-·清除能力檢測 鄰苯三酚在堿性條件下自氧化產(chǎn)生O2-·，O2-·與魯米諾反應(yīng)，可發(fā)出化學(xué)冷光，用發(fā)光檢測裝置可測定發(fā)光強度。采用我們在文獻中[5]所述的測定條件及流動注射化學(xué)發(fā)光流路(圖1)進行測定。流路中a、b、c分別為鄰苯三酚溶液、魯米諾-碳酸鹽緩沖液和H2O。當(dāng)蠕泵中進的是空白溶液時，發(fā)光信號為空白值I0，當(dāng)進的是樣品溶液時，發(fā)光信號記為IT。

O2-·清除率=[(I0-IT)/I0]×100%

圖1　流動注射化學(xué)發(fā)光示意圖

P蠕動泵；V進樣閥；E流通池；W廢液；PMT光電倍增管；HV負高壓；R記錄儀

2.4.2·OH清除能力檢測采用亞鐵氰化鉀-魯米諾- H2O2體系測定，由Fenton體系產(chǎn)生·OH，魯米諾為發(fā)光增效劑。采用的流動注射化學(xué)發(fā)光流路與2.4.1相同，流路中a、b、c分別為魯米諾、亞鐵氰化鉀溶液和H2O2溶液。當(dāng)蠕泵中進的是空白溶液時，發(fā)光信號為空白值I0，當(dāng)進樣品溶液時，發(fā)光信號記為IT。

·OH清除率=[(I0-IT)/I0]×100%

2.4.3DPPH·清除能力檢測將2 ml樣品溶液及 1 ml DPPH溶液加入到同一試管中，搖勻，室溫下暗處靜置 30 min后測定其吸光度A1,同時測定 1 ml DPPH溶液與 2 ml蒸餾水混合后的吸光度 A0，以及2 ml測試樣品溶液與1 ml無水乙醇混合后的吸光度A2，且以無水乙醇作為參比溶液。

DPPH·清除率 = 1-(A1-A2)/A0

3　結(jié)　果

3.1對O2-·的清除作用分別對EGB溶液和EGB總黃酮溶液及空白溶液進行測定，每個體系重復(fù)測定3次，取發(fā)光強度的平均值計算清除率，結(jié)果見表1。

表1所示為不同濃度的EGB和EGB黃酮對O2-·的清除作用。由表1可知，在實驗濃度范圍內(nèi)，EGB和EGB黃酮對O2-·均具有一定的抑制作用，且清除率隨濃度增大而增大，呈量效關(guān)系。但在二者總黃酮醇苷濃度相同的情況下，EGB的清除效果好于EGB黃酮。由于EGB黃酮中已經(jīng)不含銀杏內(nèi)酯，因此，我們推測EGB中的銀杏內(nèi)酯在清除O2-·的過程中，可能起到了協(xié)同作用，增強了EGB黃酮清除O2-·的能力。

表1　銀杏葉提取物對O2-·的清除作用

3.2對·OH 的清除作用由表2可知，在實驗濃度范圍內(nèi)，EGB和EGB黃酮對·OH均具有一定的抑制作用，且清除率隨濃度增大而增大。但對比EGB與EGB黃酮對·OH的清除能力發(fā)現(xiàn)：當(dāng)二者總黃酮醇苷濃度相同時，EGB對·OH的清除能力高于EGB黃酮。這提示EGB中的銀杏內(nèi)酯在清除·OH的過程中，可能起到了協(xié)同作用。

表2　銀杏葉提取物對·OH的清除作用

3.3對DPPH·的清除作用由表3可知，在實驗濃度范圍內(nèi)，EGB和EGB黃酮對DPPH·均具有一定的抑制作用，且清除率隨濃度增大而增大。當(dāng)二者總黃酮醇苷濃度相同時，EGB對DPPH·的清除能力優(yōu)于EGB黃酮。

表3　銀杏葉提取物對DPPH·的清除作用

4　討　論

本實驗通過將銀杏葉提取物與銀杏葉提取物總黃酮抗氧化能力進行對比可知：二者對O2-·、·OH和DPPH·均具有一定的清除能力，且對三種自由基的清除作用呈量效關(guān)系。但當(dāng)二者所含總黃酮醇苷濃度相同時，前者對三種自由基的清除能力均大于后者。

[1]LM Goh,PJ Barlow,CS Yong.Examination of antioxidant activity of Ginkgo biloba leaf infusions[J].Food Chemistry,2003，82(2): 275-378.

[2]TMA Elattar,A Svirji.The inhibitory effects of curcumin,genistein,quercetin and cisplatin on the growth of oral cancer cells in vitro[J].Anticancer Research,2000,2: 1733-1746.

[3]張偉，張煥新，施洋，等.銀杏葉中黃酮類物質(zhì)提取及其抗氧化活性[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,41(3):230-234.

[4]L Marcocci,JJ Maguire,MT Lefaix,et al.The nitric oxide-scavenging properties of Ginkgo biloba extract EGb761[J].Biochem Biophys Res Commun,1994,201(2):7482-7512.

[5]劉彩紅,王愛玲,李玉琴，等.款冬花多糖抗氧化能力測定[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué),2011,28 (10):886-889.

Comparison of the antioxidant activity between Gingko biloba extract and its total flavonoids

SONG Wei-wei LIU Fen-fen LIU Cai-hong

(College of Pharmacy,Taishan Medical University,Taian 271016,China)

Objective: To compare the antioxidant activity between Gingko biloba extract and its total flavonoids.Methods: The effects of Gingko biloba extract and its total flavonoids on O2-·,·OH and DPPH were detected by methods of flow injection chemiluminescence and ultraviolet spectrophotometry.Results: Gingko biloba extract and its total flavonoids could inhibit O2-·,·OH and DPPH effectively.The antioxidant activities of Gingko biloba extract was stronger than those of its total flavonoids when the dose of flavonoids was similar.Conclusion: Gingko biloba extract has stronger antioxidant activities than its flavonoids.

Gingko biloba extract; total flavonoids; antioxidant activities

泰安市科技發(fā)展計劃(2015NS2118)，國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃(201410439028)。

宋唯唯(1993—)，女，2012級制藥工程本科。

劉彩紅，女，主要從事中藥活性成分的研究，E-mail: chliu@tsmc.edu.cn。

R965

A

1004-7115(2016)05-0484-03

10.3969/j.issn.1004-7115.2016.05.002

2016-02-01)