譚姣章，石　雕（湖南中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校附屬第一醫(yī)院，湖南株洲412000）

高效液相色譜法測定骨傷復(fù)元合劑中羥基紅花黃色素A的含量*

譚姣章，石雕
（湖南中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校附屬第一醫(yī)院，湖南株洲412000）

目的建立高效液相色譜法測定骨傷復(fù)元合劑中羥基紅花黃色素A含量的方法。方法采用色譜柱為Agilent 300StableBond-C18柱（250.0 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液（26∶2∶72）；流速1.0 mL/min；柱溫25℃；檢測波長403 nm；進(jìn)樣量10 μL。結(jié)果羥基紅花黃色素A在4.8～48.0 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程Y= 3 148X-34.2，r=0.999 8（n=6）；平均加樣回收率為98.51%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.53%（n=6）。結(jié)論高效液相色譜法簡便快速、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于測定骨傷復(fù)元合劑中羥基紅花黃色素A的含量。

紅花；色素類；色譜法，高壓液相；骨傷復(fù)元合劑

骨傷復(fù)元合劑為本院自制制劑，由紅花、土鱉蟲、當(dāng)歸、三七、丹參等藥組成，其主要功效為化淤止血、活血止痛、解毒消腫，臨床用于跌打損傷、創(chuàng)傷出血等證，具有良好的療效。方中紅花為君藥，具有活血通經(jīng)，散淤止痛的功效，其主要有效活性成分為羥基紅花黃色素A。為了有效地控制骨傷復(fù)元合劑的質(zhì)量，本研究采用高效液相色譜法測定羥基紅花黃色素A含量，以建立該藥品的含量測定方法。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器Agilent 1200高效液相色譜儀（G1354A四元梯度泵、G1328B手動進(jìn)樣器、G1314B紫外檢測器、G2170BA色譜工作站，美國Agilent公司）；KQ-1000DE型超聲波清洗器（江蘇省昆山超聲儀器有限公司）；FA1004N電子分析天平（上海精密儀器儀表有限公司）。

1.1.2試藥羥基紅花黃色素A對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111637-201106）；甲醇和乙腈溶液為色譜純；水為雙蒸水；其余實(shí)驗(yàn)中試劑均為分析純；骨傷復(fù)元合劑（規(guī)格：100 mL/瓶，為本院自制，批號：130701、130702、130703）。

1.2方法

1.2.1色譜條件色譜柱：Agilent 300StableBond-C18柱（250.0 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液（26∶2∶72）；流速1.0 mL/min；柱溫25℃；檢測波長403 nm；進(jìn)樣量10 μL，按羥基紅花黃色素A色譜峰計(jì)算理論塔板數(shù)應(yīng)大于或等于3 000。

1.2.2溶液的制備

1.2.2.1對照品溶液的制備取干燥至恒重的羥基紅花黃色素A對照品1.20 mg，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加25%甲醇至刻度，搖勻，即得含羥基紅花黃色素A 48.0 μg/mL的溶液。該溶液作為線性關(guān)系考察和加樣回收試驗(yàn)中的貯備液使用。

1.2.2.2樣品溶液的制備精密量取骨傷復(fù)元合劑1.0mL，置25 mL量瓶中，加25%甲醇定容，超聲器中處理15 min，3 000 r/min高速離心5 min，取上清液，用0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，加25%甲醇稀釋至刻度，搖勻即得。

1.2.2.3陰性樣品溶液的制備按骨傷復(fù)元合劑制備工藝制備缺紅花的陰性樣品合劑，依照“1.2.2.2”項(xiàng)下方法制得陰性樣品溶液。

1.2.3線性關(guān)系考察取“1.2.2.1”項(xiàng)下的貯備液，精密吸取1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，分別置10 mL量瓶中，加25%甲醇至刻度，搖勻。依次精密吸取各溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄測得的羥基紅花黃色素A色譜峰面積，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X，μg）、以峰面積為縱坐標(biāo)（Y，mAU）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4精密度試驗(yàn)吸取“1.2.2.1”項(xiàng)下的羥基紅花黃色素A對照品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄羥基紅花黃色素A對照品色譜峰面積，連續(xù)進(jìn)樣6次。

1.2.5重復(fù)性試驗(yàn)取骨傷復(fù)元合劑（批號：130701）適量，按照“1.2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份樣品溶液，進(jìn)樣10μL，記錄供試品中羥基紅花黃色素A色譜峰面積。

1.2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)取骨傷復(fù)元合劑（批號：130701）供試品溶液，分別于0、1、2、4、8、24 h測定供試品中羥基紅花黃色素A的含量。

1.2.7加樣回收試驗(yàn)吸取已知含量的骨傷復(fù)元合劑樣品（批號：130701）6份，每份約0.5 mL，置于25 mL容量瓶中，各份精密加入一定量羥基紅花黃色素A對照品溶液，按“1.2.2.2”項(xiàng)下方法制得供試品溶液，依法測定羥基紅花黃色素A的含量，計(jì)算回收率。

1.2.8樣品含量測定取骨傷復(fù)元合劑樣品3批，根據(jù)測得的羥基紅花黃色素A峰面積計(jì)算樣品中羥基紅花黃色素A的含量。

2　結(jié)　果

2.1干擾性試驗(yàn)在“1.2.1”色譜條件下，羥基紅花黃色素A色譜峰與其他組分色譜峰達(dá)基線分離，且分離度大于1.5；陰性對照品測定無干擾，方法專屬性好。對照品、樣品及陰性樣品色譜圖見圖1。

圖1　羥基紅花黃色素A色譜圖

2.2線性關(guān)系考察回歸方程為Y=3 148X-34.2，r= 0.999 8（n=6），結(jié)果表明羥基紅花黃色素A含量在4.8～48.0 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3精密度試驗(yàn)峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.67%，結(jié)果表明儀器具有良好的精密度。

2.4重復(fù)性試驗(yàn)羥基紅花黃色素A的平均含量為0.5648mg/g，其RSD為1.12%，表明本方法的重復(fù)性良好。

2.5穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD為0.85%，表明骨傷復(fù)元合劑供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6加樣回收率試驗(yàn)平均回收率為98.51%，RSD為0.53%，見表1。

表1　加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.7樣品含量測定樣品批號130701、130702、130703的羥基紅花黃色素A平均含量分別為：0.272 8、0.2707、0.266 4 mg/g，見表2。

表2　3批樣品中羥基紅花黃色素A含量測定結(jié)果

3　討　論

羥基紅花黃色素A是紅花藥理功效最有效的水溶性部位，藥理實(shí)驗(yàn)表明，其可抑制血小板激活因子誘發(fā)的血小板聚集與釋放，可競爭性地抑制血小板激活因子與血小板受體的結(jié)合，是紅花黃色素活血化瘀的有效成分。紅花是骨傷復(fù)元合劑的處方主藥，因此羥基紅花黃色素A的含量可正面反映該制劑質(zhì)量的優(yōu)劣。

本試驗(yàn)在流動相選取過程中，比較了甲醇-乙腈-磷酸溶液系統(tǒng)［1-5］、甲醇-水-冰醋酸溶液系統(tǒng)［6-7］、乙腈-磷酸溶液系統(tǒng)［8-12］，并試驗(yàn)了不同配比的流動相，最后選定甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液為流動相，既有適宜的保留時(shí)間，也得到較高的塔板數(shù)和分離度。

本試驗(yàn)建立了高效液相色譜法測定骨傷復(fù)元合劑中羥基紅花黃色素A的方法，該方法快速簡便、分離效果好、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可有效控制骨傷復(fù)元合劑中羥基紅花黃色素A的含量。

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Content determination of hydroxysafflor yellow A in Gushang Fuyuan Mixture by HPLC*

Tan Jiaozhang，Shi Diao（FirstAffiliated Hospital of Hunan Traditional Chinese Medical College，Zhuzhou，Hunan 412000，China）

ObjectiveTo establish a HPLC method for the determination of hydroxysafflor yellow A content in Gushang Fuyuan Mixture.MethodsThe chromatographic column Agilent 300StableBond-C18column（250.0 mm×4.6 mm，5 μm）was used and the mobile phase was methanol-acetonitrile-0.7%phosphoric acid solution（26∶2∶72）.The flow rate was 1.0 mL/min.The column temperature was 25℃and the detection wavelength was 403 nm.The injection volume was 10 μL.ResultsHydroxysafflor yellow A had good linear relation over the range of 4.8-48.0 μg/mL.The regression equation Y=3 148X-34.2，r=0.999 8（n=6）. The average recovery rate was 98.51%with RSD 0.53%（n=6）.ConclusionThe method is rapid and simple with accurate result and good reproducibility，and can be used for the content determination of hydroxysafflor yellow A in Gushang Fuyuan Mixture.

Carthamus tinctorius；Pigments；Chromatography，high pressure liquid；Gushang fuyuan mirture

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.05.006

A

1009-5519（2016）05-0654-02

湖南中醫(yī)藥管理局資助項(xiàng)目（201498）。

譚姣章（1972-），本科，副主任藥師，主要從事中藥新制劑研究與開發(fā)方面的研究。

（2015-11-11）