楊名慧，趙學(xué)發(fā)，葛正龍△（.遵義醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，貴州遵義563003；.黔南州人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，貴州都勻558000）

重組質(zhì)粒pαACP-HSP70的特異性表達(dá)研究*

楊名慧1，趙學(xué)發(fā)2，葛正龍1△
（1.遵義醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，貴州遵義563003；2.黔南州人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，貴州都勻558000）

目的觀察重組質(zhì)粒pαACP-HSP70在晶狀體組織和非晶狀體組織中的表達(dá)情況，探討重組質(zhì)粒pαACPHSP70的特異性表達(dá)。方法以晶狀體組織作為A組，肺小細(xì)胞癌細(xì)胞A549、肝癌細(xì)胞7402等非晶狀體組織作為B組，采用陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pCMV-HSP70質(zhì)粒、pαACP-HSP70質(zhì)粒導(dǎo)入A、B組后，通過熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況。結(jié)果轉(zhuǎn)染pCMV-HSP70質(zhì)粒到A、B組24 h后發(fā)現(xiàn)，兩組均有綠色熒光；另外，轉(zhuǎn)染pαACP-HSP70質(zhì)粒24 h后僅在A組能觀察到綠色熒光。結(jié)論重組質(zhì)粒pαACP-HSP70不能在非晶狀體組織表達(dá)，僅能在晶狀體上皮細(xì)胞表達(dá)，具有組織特異性。

晶體；α晶體蛋白A鏈；HSP70熱休克蛋白質(zhì)類；綠色熒光蛋白質(zhì)類；特異性

白內(nèi)障作為首位致盲疾病，其導(dǎo)致視力障礙給白內(nèi)障患者的生活質(zhì)量帶來極大的影響。手術(shù)治療為白內(nèi)障患者提供了最終治療的有效手段，但手術(shù)治療會(huì)給患者帶來巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和風(fēng)險(xiǎn)及發(fā)生術(shù)后并發(fā)癥［1］。因此，研究和發(fā)現(xiàn)新的預(yù)防、延緩白內(nèi)障的非手術(shù)方法和措施具有顯著意義。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基因治療疾病引起人們的重視，通過導(dǎo)入外源基因來防治白內(nèi)障的可行性處在研究階段。目前，外源基因表達(dá)主要應(yīng)用巨細(xì)胞病毒（CMV）啟動(dòng)子，CMV啟動(dòng)子雖然高效，但外源基因表達(dá)沒有細(xì)胞特異性［2］?；蛑委熕杞鉀Q的首要問題是外源基因的特異性表達(dá)，一方面增強(qiáng)對(duì)特定靶點(diǎn)的調(diào)控，另一方面減少對(duì)非特定靶點(diǎn)的干擾。組織特異性啟動(dòng)子的引入能夠增強(qiáng)外源基因的特異性表達(dá)。本課題組前期成功構(gòu)建特異性啟動(dòng)子αA晶體蛋白基因與熱休克蛋白70（HSP70）基因片段重組質(zhì)粒［3］，本研究繼續(xù)深入研究重組質(zhì)粒pαACP-HSP70是否具有組織特異性，為在白內(nèi)障的基因防治中提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為6～8周SD大鼠，購于第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證：SCXK（渝2012-0005）；肝癌7402細(xì)胞、肺小細(xì)胞癌A549細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；pαACP-HSP70質(zhì)粒、pCMVHSP70質(zhì)粒（由本教研室構(gòu)建）；多價(jià)陽離子脂質(zhì)體（LipofectamineTM2000，美國Invitrogen公司）；D-（+）-半乳糖（美國Sigma公司）。

1.2方法

1.2.1晶狀體組織（A組）培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染將SD大鼠以頸椎脫臼法處死，立即取出眼球，無菌操作暴露完整晶狀體，將其取出放入DMEM低糖培養(yǎng)基中（含100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素和20%胎牛血清），37℃5% CO2條件下培養(yǎng)8 h后，觀察晶狀體組織的情況，選取未受傷保持透明的晶狀體組織納入實(shí)驗(yàn)。換用DMEM低糖培養(yǎng)基（無抗生素?zé)o血清），各組分別加入pCMVHSP70質(zhì)粒、pαACP-HSP70質(zhì)粒（用LipofectamineTM2000包裹，質(zhì)粒質(zhì)量為4 μg，混合質(zhì)粒，混合物體積為100 μL），轉(zhuǎn)染過程按操作說明書進(jìn)行，37℃5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后行冰凍切片，在熒光顯微鏡下觀察有無綠色熒光蛋白（EGFP）表達(dá)。

1.2.2非晶狀體組織（B組）培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染將肺小細(xì)胞癌 A549細(xì)胞（B1組）、肝癌7402細(xì)胞（B2組）在10% FBS 1640培養(yǎng)基，37℃5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞以1×106mL-1接種于六孔板中，待細(xì)胞生長接近80%～90%融合時(shí)，用 LipofectamineTM2000包裹pCMV-HSP70質(zhì)粒、pαACP-HSP70質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染過程按操作說明書進(jìn)行，于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24 h，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞有無綠色熒光。

2　結(jié)　果

2.1A組轉(zhuǎn)染pCMV-HSP70、pαACP-HSP70質(zhì)粒24 h后冰凍切片熒光顯微鏡觀察熒光顯微鏡下觀察A組晶狀體組織轉(zhuǎn)染后冰凍切片的熒光變化如圖1所示。pCMV-HSP70質(zhì)粒組和pαACP-HSP70質(zhì)粒組均觀察到明顯EGFP表達(dá)（圖1a、b）；各組明場(chǎng)下均可見清晰晶狀體上皮結(jié)構(gòu)（圖1c、d）。

圖1　A組轉(zhuǎn)染pCMV-HSP70、pαACP-HSP70質(zhì)粒24 h后冰凍切片熒光顯微圖（100×）

2.2B組轉(zhuǎn)染質(zhì)粒24 h后熒光顯微鏡觀察

2.2.1熒光顯微鏡下觀察pCMV-HSP70質(zhì)粒轉(zhuǎn)染B1、B2組24 h后可見綠色熒光，如圖2所示。

圖2　B組轉(zhuǎn)染pCMV-HSP70質(zhì)粒24 h后熒光顯微圖（100×）

2.2.2熒光顯微鏡下觀察pαACP-HSP70質(zhì)粒轉(zhuǎn)染B1、B2組24 h后均無綠色熒光，如圖3所示。

圖3　B組轉(zhuǎn)染pαACP-HSP70質(zhì)粒24 h后熒光顯微圖（100×）

3　討　論

基因治療是將外源基因?qū)氚屑?xì)胞并在靶細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生所需要的產(chǎn)物，對(duì)特定的靶點(diǎn)進(jìn)行調(diào)控，從而達(dá)到治療疾病的目的?；虮磉_(dá)的組織特異性是受基因表達(dá)調(diào)控元件和細(xì)胞內(nèi)調(diào)控蛋白所決定，因此，可以利用組織特異性啟動(dòng)子在一定器官或組織部位增加區(qū)域目的基因的表達(dá)量，減少目的基因?qū)Π型饨M織產(chǎn)生毒性反應(yīng)。有研究結(jié)果顯示，利用可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子能夠調(diào)節(jié)基因治療中目的基因的表達(dá)［4］。楊加偉等［5-6］利用馬鈴薯塊莖特異性啟動(dòng)子、馬鈴薯葉片特異性啟動(dòng)子在塊莖、葉片等組織獲得高表達(dá)重組蛋白。

Massey等［7］研究表明，外源基因?qū)胙蹆?nèi)后，可檢測(cè)到晶狀體內(nèi)有相應(yīng)蛋白表達(dá)。本課題組在前期的研究中，已成功將特異性啟動(dòng)子αA晶體蛋白基因與HSP70基因片段成功構(gòu)建為融合質(zhì)粒［3］。有研究發(fā)現(xiàn)，HSP對(duì)細(xì)胞上皮的完整性有保護(hù)作用，可避免應(yīng)激因子的損傷［8］。HSP70為熱休克蛋白家族重要成員，晶狀體中HSP70的表達(dá)水平升高有利于穩(wěn)定晶狀體蛋白質(zhì)的正確構(gòu)象及晶狀體的透明性，從而延緩和減輕白內(nèi)障的發(fā)生［9-10］。αA晶體蛋白是晶狀體細(xì)胞質(zhì)中重要結(jié)構(gòu)蛋白，已有研究證實(shí)，αA晶體蛋白僅局限在晶狀體內(nèi)表達(dá)，其他組織僅有少量被發(fā)現(xiàn)［11］。本課題組前期研究中，將pαACPHSP70質(zhì)粒導(dǎo)入晶狀體組織中，利用晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi)的基因調(diào)控蛋白進(jìn)行表達(dá)，能夠定向使晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi)的HSP70含量增高，起到防治白內(nèi)障的作用［12］，但該重組質(zhì)粒是否具有組織特異性還未知，因此進(jìn)行以上研究。

pαACP-HSP70質(zhì)粒與pCMV-HSP70質(zhì)粒結(jié)構(gòu)相同的是均含有內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列（IRES）［13-14］和增強(qiáng)型EGFP基因編碼區(qū)，IRES能夠增強(qiáng)目的基因翻譯水平的表達(dá)，使外源基因和EGFP基因同步表達(dá)，EGFP基因編碼區(qū)可表達(dá)EGFP，可以通過熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率。pαACP-HSP70質(zhì)粒與pCMV-HSP70質(zhì)粒結(jié)構(gòu)不同的是pCMV-HSP70質(zhì)粒啟動(dòng)子為廣譜啟動(dòng)子CMV，可表達(dá)于廣泛的組織，而pαACP-HSP70質(zhì)粒啟動(dòng)子為特異性啟動(dòng)子——αA晶體蛋白基因啟動(dòng)子，僅表達(dá)于晶狀體上皮細(xì)胞。因此，本實(shí)驗(yàn)用熒光顯微鏡定性觀察到轉(zhuǎn)染pαACP-HSP70質(zhì)粒24 h后晶狀體上皮有綠色熒光，肺小細(xì)胞癌A549細(xì)胞、肝癌7402細(xì)胞觀察無綠色熒光；轉(zhuǎn)染pCMV-HSP70質(zhì)粒24 h后晶狀體上皮、肺小細(xì)胞癌A549細(xì)胞、肝癌7402細(xì)胞均有綠色熒光。提示重組pαACP-HSP70質(zhì)粒具有組織特異性，能特異性表達(dá)于晶狀體組織，不表達(dá)于非晶狀體組織。但該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率、目的基因在靶器官內(nèi)表達(dá)水平等問題有待進(jìn)一步研究。

［1］黃家林，劉斌，朱增欽，等.發(fā)展中國家白內(nèi)障手術(shù)的現(xiàn)狀［J］.國際眼科雜志，2013，13（6）：1142-1146.

［2］Harms JS，Eakle KA，Kuo LS，et al.Comparison of bovine leukemia virus （BLV）and CMV promoter-driven reporter gene expression in BLV-infected and non-infected cells［J］.Genet Vaccines Ther，2004，2（1）：11.

［3］姜婧怡，葛正龍.αA晶體蛋白基因啟動(dòng)子與-HSP70融合基因表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定［J］.遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，36（1）：13-20.

［4］ Arancibia-Cárcamo CV，Oral HB，Haskard DO，et al.Lipoadenofectionmediated gene delivery to the corneal endothelium：prospects for modulating graft rejection［J］.Transplantation，1998，65（1）：62-67.

［5］楊加偉，李偉，葛正龍.馬鈴薯塊莖特異性啟動(dòng)子克隆及其驅(qū)動(dòng)的hIL12表達(dá)載體構(gòu)建［J］.遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，37（4）：387-392.

［6］楊加偉，程小玲，葛正龍.馬鈴薯葉片特異性啟動(dòng)子克隆分析及其驅(qū)動(dòng)的人白細(xì)胞介素-12表達(dá)載體構(gòu)建［J］.基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2014，33（4）：875-881.

［7］Massey AJ，Williamson DS，Browne H，et al.A novel，small molecule inhibitor of Hsc70/Hsp70 potentiates Hsp90 inhibitor induced apoptosis in HCT116 colon carcinoma cells［J］.Cancer Chemother Pharmacol，2010，66（3）：535-545.

［8］Horowitz M，Robinson SD.Heat shock proteins and the heat shock response during hyperthermia and its modulation by altered physiological conditions［J］.Prog Brain Res，2007，162：433-446.

［9］周浩，褚仁遠(yuǎn)，周行濤，等.晶狀體囊膜HSP70的表達(dá)與年齡相關(guān)性白內(nèi)障［J］.眼科研究，2007，25（1）：37-39.

［10］李桂榮，周鴻雁，張文松.熱休克蛋白HSP27和HSP70在老年性白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞中表達(dá)及其意義［J］.中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2011，15（6）：1048-1050.

［11］Kato K，Shinohara H，Kurobe N，et al.Immunoreactive alpha A crystallin in rat non-lenticular tissues detected with a sensitiveimmunoassay method［J］. Biochim Biophys Acta，1991，1080（2）：173-180.

［12］張子萍，葛正龍.αA晶體蛋白基因啟動(dòng)子與HSP70融合基因?qū)Υ笫蟀肴樘切园變?nèi)障的抑制作用［J］.遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，37（3）：290-294.

［13］安懷杰，俞煒源，孫志偉.內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)及其研究進(jìn)展［J］.生物技術(shù)通訊，2007，18（4）：663-666.

［14］盧杰，張珈敏，林美娟，等.RNA病毒翻譯調(diào)控元件——內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES）［J］.中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2007，23（7）：513-518.

Research on specific expression of recombinant plasmid pαACP-HSP70*

Yang Minghui1，Zhao Xuefa2，Ge Zhenglong1△（1.Teaching and Researching Section of Biochemistry and Molecular Biology，Zunyi Medical College，Zunyi，Guizhou 563003，China；2.Department of Clinical Laboratory，Qiannan Prefecture People′s Hospital，Duyun，Guizhou 558000，China）

ObjectiveTo observe the expression of recombinant plasmid pαACP-HSP70 in the lens and non-lens tissues for investigating its specific expression.MethodsThe lens tissue was taken as the group A and the non-lens tissue of small cell lung cancer A549 cells and liver cancer 7402 cells as the group B.pCMV-HSP70 and pαACP-HSP70 plasmids were transfected into the group A and B by adopting the cationic lipofectin transfection method.The expression of enhanced green fluorescent protein produced in the two groups was observed by fluorescence microscope.ResultsAfter 24 h of pCMV-HSP70 plasmid transfection into the group A and B，the green fluorescence could be found in the two groups，however，after transfecting pαACPHSP70 plasmid，the green fluorescence could be found only in the group A.ConclusionThe pαACP-HSP70 recombination plasmid can not be expressed in non-lens tissue and only expressed in the lens epithelial cells with the tissue specificity.

Lens，crystalline；Alpha-crystallin A chain；HSP70 heat-shock proteins；Green fluorescent proteins；Specificity

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.05.005

A

1009-5519（2016）05-0651-03

貴州省優(yōu)秀科技教育人才省長專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目（黔省專合字［2009］47號(hào)）。

楊名慧（1986-），在讀碩士研究生，主要從事生物技術(shù)應(yīng)用方面的研究。

△，E-mail：zlongge@hotmail.com。

（2015-12-01）