張　杰， 馬小惠， 吳　軍， 馬　艷， 黃志超， 于亞鷺， 鄭玉建， 王彥茹

(新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院， 烏魯木齊　830011)

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氟、砷染毒大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞損傷的實(shí)驗(yàn)研究

張杰， 馬小惠， 吳軍， 馬艷， 黃志超， 于亞鷺， 鄭玉建， 王彥茹

(新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院， 烏魯木齊830011)

目的探討氟、砷對大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及大腦組織神經(jīng)細(xì)胞損傷的影響。方法90只初斷乳清潔級SD大鼠隨機(jī)分為9組，每組10只，雌雄各半，分別為對照(蒸餾水)組、低劑量砷(NaAsO20.75 mg/kg體質(zhì)量)染毒組、高劑量砷(NaAsO21.5 mg/kg體質(zhì)量)染毒組、低劑量氟(NaF 25 mg/kg體質(zhì)量)染毒組、高劑量氟(NaF 50 mg/kg體質(zhì)量)染毒組、低劑量砷(NaAsO20.75 mg/kg體質(zhì)量)與低劑量氟(NaF 25 mg/kg體質(zhì)量)聯(lián)合染毒組、低劑量砷(NaAsO20.75 mg/kg體質(zhì)量)與高劑量氟(NaF 50 mg/kg體質(zhì)量)聯(lián)合染毒組、高劑量砷(NaAsO21.5 mg/kg體質(zhì)量)與低劑量氟(NaF 25 mg/kg體質(zhì)量)聯(lián)合染毒組及高劑量砷(NaAsO21.5 mg/kg體質(zhì)量)與高劑量氟(NaF 50 mg/kg體質(zhì)量)聯(lián)合染毒組。自由飲水方式進(jìn)行染毒，連續(xù)染毒6個(gè)月。采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)評價(jià)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力；透射電鏡觀察腦組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變；單細(xì)胞凝膠電泳法檢測細(xì)胞DNA損傷情況。結(jié)果與對照組相比，高劑量砷、高劑量氟及高劑量氟砷聯(lián)合染毒組大鼠逃避潛伏期明顯延長；大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、細(xì)胞核明顯變形、核內(nèi)染色質(zhì)分布不均勻、胞漿內(nèi)部分線粒體腫脹、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張等結(jié)構(gòu)改變；并且腦組織神經(jīng)細(xì)胞Olive尾矩值明顯增高。結(jié)論氟、砷可透過血腦屏障在大鼠腦組織中蓄積，引起腦組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化及神經(jīng)細(xì)胞DNA損傷，這可能是氟、砷對動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力產(chǎn)生影響的重要原因。

亞砷酸鈉； 氟化鈉； 學(xué)習(xí)記憶能力； DNA損傷

地方性氟中毒、砷中毒是由于一定地區(qū)的環(huán)境中氟、砷元素過多，而致長期生活在該環(huán)境中的居民經(jīng)飲水、食物和空氣等途徑攝入過量氟、砷所引起慢性全身性疾病。有調(diào)查資料顯示，在我國山西、貴州以及新疆某些地區(qū)的地質(zhì)環(huán)境中氟、砷元素同時(shí)異常增高，而導(dǎo)致長期生活在該地的人群發(fā)生地方性氟、砷聯(lián)合中毒[1-2]。地方性氟、砷中毒對人體的危害是多方面的，可引起機(jī)體多系統(tǒng)、多器官的損傷。近年來隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，特別是腦組織對氟、砷元素較為敏感。因此，氟、砷對學(xué)習(xí)記憶及腦損傷的相關(guān)研究日益受到研究者們的關(guān)注。本研究旨在探討氟、砷染毒對大鼠學(xué)習(xí)記憶及腦組織細(xì)胞損傷的影響，為進(jìn)一步闡明氟、砷對動(dòng)物腦損傷的機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

1.1.1儀器Morris圓形水迷宮(上海藥物研究所)，JES-100SX電子顯微鏡(日本)，氫化物發(fā)生-雙道原子熒光光譜儀(北京吉天儀器設(shè)備有限公司)，792型離子色譜儀(瑞士萬通公司)，IX71型倒置顯微鏡(OLYMPUS公司)，PowerPacTMBasic型水平電泳槽(美國BIO-RAD公司)。

1.1.2試劑氟化鈉(NaF，分析純，北京化學(xué)試劑三廠)，亞砷酸鈉(NaAsO2，分析純，美國Fluka公司)，氟、砷標(biāo)準(zhǔn)溶液(中國標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心)，單細(xì)胞凝膠電泳DNA損傷檢測試劑盒(南寧高新生物公司)。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物染毒選擇健康初斷乳的清潔級SD大鼠90只，雌雄各半，體質(zhì)量為60～80 g，由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號為：SYXK(新)2003-0004。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，將大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為9組，每組10只，雌雄各半。分別為低劑量砷(NaAsO20.75 mg/kg體質(zhì)量)染毒組、高劑量砷(NaAsO21.5 mg/kg體質(zhì)量)染毒組、低劑量氟(NaF 25 mg/kg體質(zhì)量)染毒組、高劑量氟(NaF 50 mg/kg體質(zhì)量)染毒組、低劑量砷(NaAsO20.75 mg/kg體質(zhì)量)與低劑量氟(NaF 25 mg/kg體質(zhì)量)聯(lián)合染毒組、低劑量砷(NaAsO20.75 mg/kg體質(zhì)量)與高劑量氟(NaF 50 mg/kg體質(zhì)量)聯(lián)合染毒組、高劑量砷(NaAsO21.5 mg/kg體質(zhì)量)與低劑量氟(NaF 25 mg/kg體質(zhì)量)聯(lián)合染毒組、高劑量砷(NaAsO21.5 mg/kg體質(zhì)量)與高劑量氟(NaF 50 mg/kg體質(zhì)量)聯(lián)合染毒組、對照(蒸餾水)組。采用自由飲水方式對動(dòng)物進(jìn)行染毒，染毒時(shí)間為6個(gè)月。

1.2.2Morris圓形水迷宮試驗(yàn)采用定位導(dǎo)航實(shí)驗(yàn)對各實(shí)驗(yàn)組大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行測試。動(dòng)物6個(gè)月染毒結(jié)束后，將大鼠面向池壁放入水中，記錄大鼠從入水到找到平臺(tái)并站立于其上所需時(shí)間(逃避潛伏期)，若大鼠在水池中游泳120 s內(nèi)仍未成功找到平臺(tái)，則引導(dǎo)大鼠至平臺(tái)站立15 s，并記錄逃避潛伏期為120 s，實(shí)驗(yàn)連續(xù)進(jìn)行5 d。

1.2.3大鼠腦組織中氟、砷含量測定稱取腦組織(0.2±0.05)g剪碎，加入10 mL硝酸和高氯酸(HNO3∶HClO4=4∶1)混合消化液，在通風(fēng)柜內(nèi)用控溫電熱板進(jìn)行加熱消解，當(dāng)瓶底消化產(chǎn)物變?yōu)榘咨?，冷卻后加入5 mL超純水，繼續(xù)加熱至水分蒸干，再用超純水定容至5.0 mL。消化后的樣品采用離子色譜法測定氟含量，采用氫化物原子熒光光度法檢測砷含量。

1.2.4大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞電鏡觀察每組隨機(jī)選取2只大鼠，經(jīng)乙醚吸入麻醉后斷頭處死，在冰上快速分離大腦皮質(zhì)，切取組織塊放入4%戊二醛溶液中，4℃固定過夜，1% 四氧化鋨后固定2 h。用環(huán)氧樹脂進(jìn)行包埋，用超薄切片機(jī)進(jìn)行超薄切片，采用醋酸鈾枸櫞酸鉛對切片染色。采用透射電子顯微電鏡觀察各組大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)。

1.2.5單細(xì)胞凝膠電泳法檢測DNA損傷各實(shí)驗(yàn)組大鼠處死后，冰浴下取腦組織，0.125% 胰蛋白酶37℃消化10 min，1 500 r/min離心5 min，棄上清液，加入含10%小牛血清DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基終止消化，用PBS洗2次，200目不銹鋼篩過篩后用PBS重新懸浮細(xì)胞，再按照彗星實(shí)驗(yàn)試劑盒方法要求檢測腦組織細(xì)胞DNA損傷情況。每組隨機(jī)抽取4只大鼠，每只動(dòng)物觀察25個(gè)細(xì)胞，共觀察100個(gè)細(xì)胞。采用CASP彗星分析軟件進(jìn)行分析，選擇Olive尾矩作為DNA損傷的指標(biāo)。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠腦組織氟、砷含量與對照組比較，低劑量氟染毒組、高劑量氟染毒組、低劑量砷與低劑量氟聯(lián)合染毒組、低劑量砷與高劑量氟聯(lián)合染毒組、高劑量砷與低劑量氟聯(lián)合染毒組、高劑量砷與高劑量氟聯(lián)合染毒組大鼠腦組織中氟含量較高，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=23.482，P<0.05)；與對照組比較，低劑量砷染毒組、高劑量砷染毒組、低劑量砷與低劑量氟聯(lián)合染毒組、低劑量砷與高劑量氟聯(lián)合染毒組、高劑量砷與低劑量氟聯(lián)合染毒組、高劑量砷與高劑量氟聯(lián)合染毒組大鼠腦組織中砷含量較高，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=72.216，P<0.05)，見表1。

2.2Morris圓形水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果Morris圓形水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在連續(xù)5 d定位導(dǎo)航訓(xùn)實(shí)驗(yàn)間，各實(shí)驗(yàn)組大鼠隨實(shí)驗(yàn)天數(shù)的增加，到達(dá)終點(diǎn)平臺(tái)逃避潛伏期均逐漸縮短(表2)。采用重復(fù)測量資料方差分析綜合評價(jià)5 d的測試結(jié)果，與對照組相比，高劑量砷染毒組、高劑量氟染毒組、高劑量砷與低劑量氟聯(lián)合染毒組、低劑量砷與高劑量氟聯(lián)合染毒組及高劑量砷與高劑量氟聯(lián)合染毒組大鼠逃避潛伏期均延長，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7.131，P<0.05)。交互分析結(jié)果顯示，氟、砷聯(lián)合染毒對大鼠逃避潛伏期的影響不呈現(xiàn)交互作用(P>0.05)。

表1　各組大鼠腦組織中氟、砷含量測定結(jié)果(±s， n=10)

注：與對照組相比，*P<0.05。

表2　Morris圓形水迷宮實(shí)驗(yàn)中大鼠逃避潛伏期比較(s, ±s， n=10)

注：與對照組相比，*P<0.05。

2.3大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞電鏡觀察結(jié)果透射電鏡下可見對照組大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元形態(tài)完整，核膜清晰完整，細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)分布正常，胞漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、高爾基體及核糖體形態(tài)正常(圖1)。高劑量砷染毒組、高劑量氟染毒組、低劑量砷與高劑量氟聯(lián)合染毒組、高劑量砷與低劑量氟聯(lián)合染毒組、高劑量砷與高劑量氟聯(lián)合染毒組可見大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞皺縮，細(xì)胞核明顯變形，核內(nèi)染色質(zhì)分布不均勻，核膜下可見大量異染色質(zhì)聚集，胞漿內(nèi)部分線粒體腫脹、呈空泡樣改變及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張等結(jié)構(gòu)改變，見圖2、3、4。

圖1對照組大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元(TEM，×6000)

圖2高劑量砷染毒組大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元(TEM，×6000)

圖3高劑量氟染毒組大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元(TEM，×6000)

圖4高劑量砷與高劑量氟聯(lián)合染毒組大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元(TEM，×6000)

2.4各實(shí)驗(yàn)組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞DNA損傷檢測結(jié)果單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組對比，高劑量砷染毒組、高劑量氟染毒組、低劑量砷與高劑量氟聯(lián)合組、高劑量砷與低劑量氟聯(lián)合組、高劑量砷與高劑量氟聯(lián)合組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞Olive尾矩值明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=29.375，P<0.05)，見表3。交互分析結(jié)果顯示，氟、砷聯(lián)合染毒對大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞Olive尾矩值的影響未呈現(xiàn)交互作用(P>0.05)。

實(shí)驗(yàn)分組Olive尾矩值對照組0.85±0.21低劑量砷染毒組0.90±0.15高劑量砷染毒組1.31±0.32*低劑量氟染毒組1.01±0.30高劑量氟染毒組1.21±0.28*低劑量砷與低劑量氟聯(lián)合染毒組0.94±0.23低劑量砷與高劑量氟聯(lián)合染毒組1.31±0.22*高劑量砷與低劑量氟聯(lián)合染毒組1.25±0.19*高劑量砷與高劑量氟聯(lián)合染毒組1.42±0.31*

注：與對照組相比，*P<0.05。

3　討論

作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的大腦是人體重要的器官，對調(diào)控人體的生命活動(dòng)至關(guān)重要。有研究表明，過多的氟進(jìn)入機(jī)體可通過血腦屏障并在腦組織蓄積[3-4]；而長期高砷暴露不僅可使砷在肝、腎、皮膚等器官蓄積，同樣使腦組織中砷含量有所增加[5-6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述研究結(jié)果相一致，染毒6個(gè)月后各染毒組腦組織中的氟、砷含量均明顯高于對照組。水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，高劑量砷染毒組、高劑量氟染毒組、低劑量砷與高劑量氟、高劑量砷與低劑量氟、高劑量砷與高劑量氟聯(lián)合染毒組大鼠逃避潛伏期均有所延長。表明蓄積在腦組織中的氟、砷可對大腦正常生理功能產(chǎn)生負(fù)面影響。為進(jìn)一步證明氟、砷對腦組織神經(jīng)細(xì)胞的損傷作用，本研究利用透射電鏡觀察了氟、砷暴露后大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)果顯示各高劑量氟砷單獨(dú)及聯(lián)合染毒組大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)皺縮，細(xì)胞核明顯變形，核內(nèi)染色質(zhì)分布不均勻，核膜下可見大量異染色質(zhì)聚集、胞漿內(nèi)部分線粒體腫脹、呈空泡樣改變、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張等結(jié)構(gòu)改變。說明蓄積在腦組織中的氟、砷可破壞神經(jīng)元的正常結(jié)構(gòu)，而腦組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化可能是氟、砷造成大腦生理功能受損的病理基礎(chǔ)。單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦表明，與對照組相比，各高劑量氟、砷單獨(dú)及聯(lián)合染毒組大鼠Olive尾矩值明顯升高，說明蓄積在腦組織中的氟、砷還可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞DNA的損傷。此外，本研究未發(fā)現(xiàn)氟、砷對腦神經(jīng)功能及神經(jīng)細(xì)胞損傷存在聯(lián)合毒效應(yīng)。目前，氟砷造成腦損傷的機(jī)制尚不清楚，有必要更加深入和系統(tǒng)的進(jìn)行研究。

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(本文編輯張巧蓮)

A research on damage of the brain nerve cells of rat caused by fluoride-arsenic exposure

ZHANG Jie, MA Xiaohui, WU Jun, MA Yan, HUANG Zhichao, YU Yalu, ZHENG Yujian, WANG Yanru

(CollegeofPublicHealth,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

ObjectiveTo observe the toxic effects of fluoride, arsenic and co-exposure on learning and Memory ability, ultrastructural changes and DNA damage in cerebral coaex in rats. MethodsA total of 90 SD rats were randomly divided into 9 groups by two-factors and three-levels factorial experiment design, 10 rats in each group, control group (distilled water), low dose NaAsO2(0.75 mg/kg) group, high dose NaAsO2(1.5 mg/kg) group, low dose NaF (25 mg/kg) group, high dose NaF (50 mg/kg) group, low dose NaAsO2(0.75 mg/kg) and low dose NaF (25 mg/kg) combined group, low dose NaAsO2(0.75 mg/kg) and high dose NaF (50 mg/kg) combined group, high dose NaAsO2(1.5 mg/kg) and low dose NaF (25 mg/kg) combined group, high dose NaAsO2(1.5 mg/kg) and high dose NaF (50 mg/kg) combined group. After 6 months of exposure, learning ability was tested by the Morris water maze; ultrastructural changes of neurons in the cerebral cortex were observed by transmission electron microscope; DNA damage was detected by single cell gel electrophoresis (SCGE). ResultsCompared with the control group, the escape latency periods of rats exposed to high-dose NaAsO2group, high-dose NaF group，high-dose NaAsO2and high-dose NaF combined group were significantly prolonged in water maze test; The ultrastructure of cortex neurons also had pathological changes; and the olive tail moment in those groups were remarkably elevated. ConclusionsFluoride and arsenic could pass blood-brain barrier and cumulate in cerebral cortex of rats. Chronic fluoride, arsenic and fluoride-arsenic combined exposure may affect learning and memory abilities through cell pathological changes and DNA damage of brain nerve cells.

Sodium arsenite; sodium fluoride; learning and Memory ability; DNA damage

國家自然科學(xué)基金(81260410); 教育部博士點(diǎn)基金(20126517110002)

張杰(1974-)，男，高級實(shí)驗(yàn)師，博士，研究方向：微量元素與健康。

鄭玉建，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師,研究方向：環(huán)境與健康，E-mail：zhyujian6@hotmail.com。

R-33; R34

A

1009-5551(2016)06-0678-04

10.3969/j.issn.1009-5551.2016.06.004

2016-03-12]