高海霞，劉紅芹，石琳，屈浩

·論著·

基于人CD105分子的酵母展示系統(tǒng)的構(gòu)建

高海霞，劉紅芹，石琳，屈浩

目的構(gòu)建基于人 CD105 分子的酵母表面展示系統(tǒng)。

方法以人 CD105 cDNA 為模板，擴(kuò)增 CD105 基因片段，轉(zhuǎn)化到酵母表面展示載體 pYDs，構(gòu)建 pYDs-CD105 重組質(zhì)粒；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，測(cè)序鑒定，并通過流式細(xì)胞儀分析 CD105 的表達(dá)。

結(jié)果測(cè)序表明 CD105 基因片段轉(zhuǎn)入 pYDs 質(zhì)粒，流式細(xì)胞儀檢測(cè)到酵母細(xì)胞表面有 CD105 分子的表達(dá)。

結(jié)論成功構(gòu)建了基于人 CD105 分子的酵母表面展示系統(tǒng)，為本實(shí)驗(yàn)室獲得 CD105 單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株提供了新的篩選平臺(tái)。

聚合酶鏈反應(yīng)；膜糖蛋白類；CD105；誘導(dǎo)；酵母表面展示

www.cmbp.net.cn中國醫(yī)藥生物技術(shù)， 2016， 11（4）：329-332

表面展示技術(shù)（surface display techniques，SDT）是一種基因表達(dá)產(chǎn)物和親和選擇相結(jié)合的技術(shù)，不僅可以展示小肽，還可以展示較大的蛋白［1］。展示文庫常用于確定單克隆抗體的抗原表位，其中大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的噬菌體展示系統(tǒng)應(yīng)用最為廣泛，但受其自身加工能力的限制，缺乏對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的翻譯后修飾功能，從而降低了獲得高親和力單克隆抗體的可能性。酵母表面展示系統(tǒng)是繼噬菌體展示技術(shù)創(chuàng)立后發(fā)展起來的真核展示系統(tǒng)，酵母的蛋白質(zhì)折疊和分泌機(jī)制與哺乳動(dòng)物細(xì)胞非常相似，對(duì)人的蛋白質(zhì)表達(dá)和展示更具優(yōu)越性［2］。

CD105 是一種分子量為 180 kD 的存在于細(xì)胞表面的同源二聚體跨膜糖蛋白，其胞膜外部分含有 561 個(gè)氨基酸殘基，跨膜區(qū)域含有 25 個(gè)氨基酸殘基，胞膜內(nèi)部分含有 47 個(gè)氨基酸殘基。CD105 主要表達(dá)在血管內(nèi)皮細(xì)胞及相關(guān)組織上，在造血細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞弱表達(dá)。CD105 參與血管生成，與腫瘤的轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)，在惡性腫瘤的診斷、預(yù)后、治療中發(fā)揮重要作用［3］。將 CD105 分子展示在酵母表面，是利用流式細(xì)胞儀快速、準(zhǔn)確篩選 CD105 單克隆抗體的有效方法。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株釀酒酵母 EBY100 和大腸桿菌DH5α 由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2主要試劑pYDs-CD105-ring 引物和 pYDs引物由美國 Invitrogen 公司合成；M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶購自美國 Invitrogen 公司；DNA 純化試劑盒、高保真 Pyrobest DNA 聚合酶購自大連 Takara 公司；酵母轉(zhuǎn)化及誘導(dǎo)試劑盒購自北京偉侖欣創(chuàng)生物公司；酵母質(zhì)粒提取試劑盒和 anti-V5 抗體購自天根生物公司；anti-CD105-PE 單克隆抗體購自美國Beckman Coulter 公司；goat anti-mouse-IgG-FITC購自美國 Biotech 公司。

1.2方法

1.2.1引物根據(jù)已知 human CD105 cDNA 序列，設(shè)計(jì)并合成一對(duì)引物，上游引物：pYDs-CD105-ring-1：5' CCAGGATCCAGTGTGGT GGAATTCGAAACAGTCCATTGTGACCTTCAGC CT 3'，下游引物：pYDs-CD105-ring-2：5' GCCCTC TAGACTCGAGGGCGGCCGCATCGAGATCCCCG GGTGCGCA 3'；此外，合成另一對(duì)酵母轉(zhuǎn)化同源區(qū)引物，上游引物：pYDs01：5' GATCTGTACGACG ATGACGATAAGGTACCAGGATCCAGTGTGGTG GAATTC 3'，下游引物：pYDs02：5' GTTAGGGAT AGGCTTACCTTCGAAGGGCCCTCTAGACTCGA GGGCGGCCGC 3'。

1.2.2總 RNA 提取和 RT-PCR從 U937 細(xì)胞系中提取總 RNA，以總 RNA 為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈。從合成的 human CD105 cDNA 中取1 μl 為模板，以 pYDs-CD105-ring-1，pYDs-CD105-ring-2 為上下游引物，高保真聚合酶 Pyrobest 擴(kuò)增CD105 片段。反應(yīng)條件為：94 ℃ 預(yù)變性 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共 30 個(gè)循環(huán)；之后 72 ℃ 延伸 5 min。

1.2.3在 CD105 兩端加上酵母轉(zhuǎn)化同源區(qū)序列以上面 PCR 擴(kuò)增的 CD105 片段為模板，以pYDs01、pYDs02 酵母轉(zhuǎn)化同源區(qū)為上下游引物，PCR 擴(kuò)增帶同源區(qū)序列的 CD105 片段。反應(yīng)條件為：94 ℃ 預(yù)變性 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共 30 個(gè)循環(huán)；之后 72 ℃ 延伸 5 min。1.2.4酵母轉(zhuǎn)化根據(jù)膠回收試劑盒說明書步驟純化回收用酵母同源區(qū)引物擴(kuò)增的 CD105 片段，與 EcoR I 和 Not I 雙酶切的 pYDs 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化EBY100 酵母。

轉(zhuǎn)化前 2 天從 -80 ℃ 冰箱取出 EBY100，劃線接種到 YPD 平板上，30 ℃ 培養(yǎng)至長出單克隆菌落。將 EBY100 接種于 5 ml YPD 培養(yǎng)基，30 ℃200 r/min 過夜。次日測(cè) A600= 0.935，用 50 ml YPD培養(yǎng)液稀釋菌液至 A 值為 0.05，30 ℃ 200 r/min培養(yǎng)至 A 為 0.5，在 3000 × g 條件下，離心 5 min收集菌體，用 20 ml 雙蒸水洗菌體，離心同上，棄上清。用 1 ml 100 mmol/L LiAc 懸浮菌體，30 ℃ 溫浴 10 min，最高速度離心 10 s，棄上清，用 500 μl 100 mmol/L LiAc 重懸菌體。取 50 μl 細(xì)胞懸液于新的離心管，15 s 高速離心，移去上清，加入下列成分：240 μl PEG，36 μl LiAc（100 mmol/L），50 μl SS-DNA（carrier），1 μl Plasmic DNA Vector，20 μl PCR 產(chǎn)物，4 μl ddH2O。混勻細(xì)胞懸液，30 ℃ 溫浴 30 min，然后加入 40 μl DMSO，混勻。熱擊轉(zhuǎn)化液，42 ℃ 25 min，高速離心 30 s 收集細(xì)胞，去除上清，用 1 ml ddH2O 重懸，細(xì)胞懸液涂布 SD板，30 ℃ 培養(yǎng) 2 ～ 4 d，獲得轉(zhuǎn)化子。

1.2.5測(cè)序轉(zhuǎn)化后從 SD 平板上挑取單克隆菌落接種到 SD 培養(yǎng)基中，30 ℃ 培養(yǎng) 24 h，按照酵母質(zhì)粒提取試劑盒說明書步驟提取酵母質(zhì)粒，熱擊法轉(zhuǎn)化 DH5α，涂在 LB Amp+平板上，37 ℃ 培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，挑單克隆測(cè)序。

1.2.6酵母誘導(dǎo)得到正確的展示 CD105 酵母克隆后，SG 培養(yǎng)基誘導(dǎo)。從 SD 平板上挑單克隆接種到 2 ml SD 培養(yǎng)基（加 2% 葡萄糖）中，30 ℃ 搖床培養(yǎng)到 OD 值至 2.0 時(shí)，取 1 ml 菌液，5000 r/min 離心 5 min，棄上清。用 1 ml SG 培養(yǎng)基（加 2% 半乳糖）懸浮菌體，5000 r/min 離心5 min，棄上清，然后用 2 ml SG 培養(yǎng)基懸浮菌體，轉(zhuǎn)入試管，20 ℃ 搖床誘導(dǎo) 36 ～ 48 h。

1.2.7流式細(xì)胞儀檢測(cè)取 SG 誘導(dǎo)的酵母 1 × 106個(gè)，用 1 ml FACS buffer（PBS + 1% BSA）洗1 次，5000 r/min 離心 5 min，棄上清，按 1：1000加入 anti-V5 抗體，4 ℃ 避光孵育 1 h，1 ml FACS buffer 洗 3 次，按 1∶100 加入二抗 goat anti-mouse-IgG-FITC，流式細(xì)胞儀 FACS Calibur檢測(cè) V5 信號(hào)。同時(shí)，用 20 μl anti-CD105-PE 單克隆抗體標(biāo)記酵母 1 × 106個(gè)，4 ℃ 避光孵育 1 h，隨后流式細(xì)胞儀檢測(cè) CD105 信號(hào)。

2　結(jié)果

2.1PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定

以 CD105 cDNA 為模板，以兩側(cè)引物擴(kuò)增CD105 分子的一個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)域。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果顯示成功地?cái)U(kuò)增出 717 bp 的目的 DNA條帶（圖 1）。以此為模板，在 CD105 兩端加上酵母（pYDs）轉(zhuǎn)化同源區(qū)序列，成功地?cái)U(kuò)增出 767 bp 的 pYDs-CD105 DNA 目的條帶（圖 2）。

圖1　CD105 基因片段擴(kuò)增的瓊脂糖電泳分析Figure 1　Analysis of CD105 gene by agarose gel electrophoresis

圖2　pYDs-CD105 基因擴(kuò)增的瓊脂糖電泳分析Figure 2　Analysis of pYDs-CD105 gene by agarose gel electrophoresis

2.2酵母轉(zhuǎn)化及測(cè)序

根據(jù)膠回收試劑盒說明書步驟純化回收用酵母同源區(qū)引物擴(kuò)增的 CD105 片段，與 EcoR I 和Not I 雙酶切的 pYDs 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 EBY100 酵母，30 ℃ 培養(yǎng) 2 d 后 SD 平板長出數(shù)十個(gè)單菌落。

從 SD 平板上挑取單克隆菌落提取酵母質(zhì)粒，熱擊法轉(zhuǎn)化 DH5α，涂在 LB Amp+平板上，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，挑單克隆 pYDs-CD105-ring-1 和pYDs-CD105-ring-2 去測(cè)序，最終獲得了序列完全正確的 pYDs-CD105 質(zhì)粒。

2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)酵母表面 CD105 的表達(dá)

PCR 擴(kuò)增 CD105 一個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)域的片段，表達(dá)在酵母表面后，先用 anti-V5-FITC 標(biāo)記，檢測(cè)酵母展示的效率。結(jié)果顯示 V5 信號(hào)陽性（圖 3），然后用 anti-CD105 抗體標(biāo)記，流式細(xì)胞儀檢測(cè)抗體結(jié)合。結(jié)果表明，CD105 片段與 anti-CD105 抗體結(jié)合（圖 4）。

圖3　FACS 檢測(cè) V5 表達(dá)Figure 3　The expression of V5 was determined by FACS

圖4　FACS 檢測(cè) CD105 表達(dá)Figure 4　The expression of CD105 was determined by FACS

3　討論

酵母展示系統(tǒng)是研究可溶性蛋白間相互作用的有效系統(tǒng)，利用此系統(tǒng)可以簡單快速地研究抗原與抗體的相互作用，確定與抗體相對(duì)應(yīng)的空間構(gòu)象性的抗原決定簇。

自絲狀噬菌體表面展示技術(shù)創(chuàng)立以來，短短幾年，又分別發(fā)展了 λ 噬菌體、T4 噬菌體、T7 噬菌體、大腸桿菌、桿狀病毒以及酵母等多種表面展示系統(tǒng)。酵母表面展示系統(tǒng)是一種真核展示系統(tǒng)，含有與哺乳動(dòng)物相似的蛋白折疊機(jī)制，這樣酵母比原核細(xì)胞更有可能正確地表達(dá)和展示人的蛋白［4］。另外，在回收稀有克隆，區(qū)分親和力微弱差別的克隆方面也優(yōu)于噬菌體、大腸桿菌等原核展示系統(tǒng)。更具優(yōu)勢(shì)的是將目的片段連入載體，經(jīng)過誘導(dǎo)，目的蛋白就展示在酵母表面，不需要進(jìn)行蛋白純化，且酵母細(xì)胞顆粒大，可用流式細(xì)胞儀進(jìn)行篩選和分離，比 Western blot 和 ELISA 方法要方便、快速［5-6］。

本實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用酵母展示技術(shù)成功將人 CD105分子片段展示在細(xì)胞表面，建立了篩選 CD105 單克隆抗體的新技術(shù)平臺(tái)。但是，CD105 全長基因較大（2000 bp 左右），將全長基因轉(zhuǎn)化至酵母載體不易形成正確的空間構(gòu)象，故計(jì)劃將其拆分為幾個(gè)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行克隆，構(gòu)建不同抗原決定簇的酵母展示載體，相關(guān)實(shí)驗(yàn)還在進(jìn)行中。

本次構(gòu)建的酵母表面展示 CD105 片段與anti-CD105 抗體結(jié)合，但是信號(hào)較 V5 弱?？赡苁菧y(cè)試所用的 anti-CD105 抗體對(duì)應(yīng)的抗原結(jié)合位點(diǎn)與本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的抗原部分交叉，而不是完全一致，導(dǎo)致信號(hào)不強(qiáng)。另一個(gè)原因，anti-CD105 抗體不是與 CD105 抗原的某一段線性片段結(jié)合，而是與 CD105 抗原空間構(gòu)象位點(diǎn)結(jié)合，抗體結(jié)合需要CD105 的正確折疊。

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【Abstract】

ObjectiveConstruction of the yeast display system on human CD105.

MethodsIn the present study， the cDNA of human CD105 was used as a template， and human CD105 gene was amplified by PCR with primer we designed. The PCR products were cloned into yeast surface display vector pYDs， and the recombinant vector CD105-pYDs was thus constructed. This recombinant vector was then transfected into yeast cells. The expression of CD105 on the surface of yeast cells was determined by flow cytometery.

ResultsThe CD105 gene was successfully transfected into pYDs， and CD105 was detected on the surface of yeast cells by flow cytometery.

ConclusionThe yeast display system on human CD105 is successfully constructed in the present study， and this might provide a favorable basis of further study.

Author Affiliations： Tianjin AllianStemcell Biotech Co.， Ltd.， Tianjin 300304， China （GAO Hai-xia）； Union Stem Cell & Gene Engineering Co.， Ltd.， Tianjin 300384， China （LIU Hong-qin， SHI Lin， QU Hao）

www.cmbp.net.cnChin Med Biotechnol， 2016， 11（4）：329-332

Construction and identification of human CD105 based yeast display system

GAO Hai-xia， LIU Hong-qin， SHI Lin， QU Hao

Polymerase chain reaction；Membrane glycoproteins；CD105；Introduce；Yeast display

GAO Hai-xia， Email： gaohaixia2005@aliyun.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2016.04.008

天津市科技創(chuàng)新專項(xiàng)資金（08FDZDSH03000）

300304 天津和澤干細(xì)胞科技有限公司（高海霞）；300384 天津，協(xié)和干細(xì)胞基因工程有限公司（劉紅芹、石琳、屈浩）

高海霞，Email：gaohaixia2005@aliyun.com

2016-04-08