謝巧靈，叢慶偉，吳凌虹，朱　英

·肝硬化·

耐核苷（酸）類藥物慢性乙型肝炎和肝硬化患者血清HBV基因型和P區(qū)耐藥突變位點分析*

謝巧靈，叢慶偉，吳凌虹，朱英

目的了解慢性乙型肝炎和肝硬化患者HBV基因型分布和P區(qū)耐藥突變位點的變異模式。方法選擇39例經(jīng)核苷（酸）類似物（NAs）治療后存在耐藥或疑似耐藥的慢性乙型肝炎和肝硬化患者為研究對象，采用實時熒光定量PCR法測定血清HBV DNA，將PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，鑒定和回收純化后，交由上海生工生物工程（北京）有限公司進行測序，與HBVseq數(shù)據(jù)庫比對，觀察HBV基因型分布和耐藥位點變化情況。結(jié)果34例（87.2%）患者能檢出HBV基因型，其中C基因型有32例（82.1%），B基因型有2例（5.1%）；27例（69.2%）患者存在RT區(qū)序列突變，其中點變異12例（30.8%），rtM204I/V/S、rtA181V/T、rtI169T突變分別占15.4%、5.1%、10.3%，組合變異15例（38.4%）；23例患者存在對NAs耐藥，其中8例患者對阿德福韋酯耐藥（1例為B基因型，7例為C基因型），耐藥位點為rtA181V/T/S、rtV214A/E和rtN236T；11例患者對拉米夫定和替比夫定同時耐藥，均為C基因型，其共同耐藥位點為rtM204I/V/S和rtL180M；3例患者存在對LAM、LDT和恩替卡韋同時耐藥，均為C基因型；1例C基因型患者對LAM、LDT和ADV同時耐藥，其變異模式為rtM204I/V/S＋rtA181V/T/S＋rtL180M。結(jié)論多數(shù)對NAs耐藥患者可在HBV P區(qū)檢出基因突變，且突變形式多樣，其中以rtM204I/V/S突變?yōu)橹?，不同核苷（酸）類似物中存在共同耐藥位點。

乙型肝炎；HBV基因型；核苷（酸）類似物；突變

【Abstract】ObjectiveTo investigate the distribution characteristics of hepatitis B virus genotypes in patients with CHB or hepatitis B cirrhosis，and to explore the mutants patterns in HBV P gene sequences during nucleos（t）ide analogue（NAs）treatment.Methods39 patients with CHB or hepatitis B cirrhosis observed drug resistance or suspected drug resistance were enrolled.Serum HBV DNA levels was detected by real time PCR，and then sequenced and compared with standard sequence in HBVseq datebase.ResultsThe genotypes of HBV in 34（87.2%）patients were observed，and the genotype C was found in 32（82.1%），and genotype B in 2（5.1%）. 27（69.2%）of 39 patients were observed carrying mutation in RT gene sequence;point mutations accounted for 30.8%，including 6 harboring rtM204I/V/（15.4%），2 harboring rtA181V/T（5.1%），and 4 harboring rtI169T（10.3%），and combination mutations were 38.4%;there were 23 patients detected to be resistant to NAs.8 patients were resistant to adefovir dipivoxil（ADV），and among them，one was genotype B，and the other 7 were genotype C，harboring rtA181V/T/S，rtV214A/E or rtN236T；11 patients were resistant to both lamivudine（LAM）and telbivudine（LDT）with genotype C，harboring rtM204I/V/S or rtL180M；3 patients were resistant to LAM，LDT and entecavir（ETV），and they were all with genotype C；1 patient with type C was resistant to LAM，LDT and ADV，and the mutation pattern was rtM204I/V/S+rtA181V/T/S+rtL180M.ConclusionHBV P mutations exist in most patients with chronic hepatitis B；the rtM204I/V/S mutations is the dominate mutation pattern，and different NAs may share the common mutations.

【Key words】Hepatitis B；HBV genotypes；Nucleos（t）ide analogues；Mutation

與乙型肝炎相關的肝臟疾病仍然是全球人類健康的重要威脅。目前約有3.5億人為慢性HBV感染者，每年約有100萬人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝癌[1]?？共《局委熑匀皇怯行У闹委熞倚透窝祝A防和延緩肝硬化和肝癌發(fā)生的有效方法[2～4]。由于核苷（酸）類似物[Nucleos（t）ide analogues，NAs]相對于干擾素類具有強效的抑制病毒復制、用法方便、副作用少等特點常作為大部分病人優(yōu)先選擇的治療方案[5～7]。然而，耐藥一直是選擇NAs抗病毒治療不可回避的問題，并且隨著治療時間的延長，耐藥率逐年上升。本文通過對39例慢性乙型肝炎和乙型肝炎肝硬化患者感染HBV基因型及P區(qū)耐藥突變位點的檢測，旨在研究HBV基因型分布及耐藥基因突變的特點，為臨床病情分析及選擇治療藥物提供理論依據(jù)。

1　資料與方法

1.1病例來源選取2013年3月至10月就診于我科的慢性乙型肝炎和乙型肝炎肝硬化患者39例，男性29例，女性10例；年齡27～66歲，平均年齡（49±9.9）歲。符合2010年發(fā)布的慢性乙型肝炎防治指南中慢性乙型肝炎和乙型肝炎肝硬化的診斷標準[8]，其中慢性乙型肝炎患者31例（79.5%），肝硬化患者8例（20.5%）。所有納入患者均經(jīng)過拉米夫定（Lamivudine，LAM）、阿德福韋酯（Adefovir dipivoxil，ADV）、替比夫定（Telbivudine，LDT）、恩替卡韋（Entecavir，ETV）或者替諾福韋（Tenofovir，

TDF）單獨或聯(lián)合治療半年以上，因出現(xiàn)病毒學突破或反復肝功能異常而被臨床認定為耐藥或疑似耐藥。排除合并甲、丙、丁、戊型肝炎病毒、柯薩奇病毒、EB病毒等其他非嗜肝病毒感染以及藥物性肝損傷、酒精性肝病、自身免疫性肝病。

1.2儀器和試劑LightCycle R 96實時熒光定量PCR儀購自瑞士Roche公司；血清HBV DNA檢測試劑盒購于深圳凱杰生物有限公司。

1.3血清HBV DNA提取和擴增對符合納入標準的患者采集肘靜脈血5 ml，留取血清，-30℃集中保存，使用前于室溫下溶解。取血清50 μl，加入裂解液50 μl，100℃保溫10 mins，13000 r/m離心5 mins。使用Lightcycle熒光PCR擴增儀進行HBV DNA擴增，設定反應條件：93℃，2 min，然后，93℃，30 s，55℃，45 s，循環(huán)40次。

1.4 DNA測序?qū)CR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，鑒定和回收純化后，交由上海生工生物工程（北京）有限公司進行測序。

1.5 RT區(qū)基因突變分析將測序所得的核苷酸序列與HBVseq數(shù)據(jù)庫中序列[9]比對，主要對rt204、rt181、rt236耐藥位點進行分析。同時對rt173、rt 180、rt207、rt213、rt214、rt215、rt236、rt237、rt238、rt18 4、rt202、rt250等次級耐藥位點及補償耐藥位點進行分析，得到相應變異位點和基因分型結(jié)果。

2　結(jié)果

2.1基因分型情況在39例患者中，34例（87.2%）能檢測出基因型，其中C基因型32例（82.1%），B基因型2例（5.1%）。5例（12.8%）因病毒載量低，無法進行基因分析及耐藥位點檢測，未檢測到A、D、E、F基因型。

2.2基因型與耐藥位點分析在39例患者中，發(fā)現(xiàn)27例（69.2%）存在HBV RT區(qū)序列突變，12例（30.8%）未檢測到HBV RT區(qū)序列變異。C基因型26例（66.7%），B基因型1例（2.6%）；點變異12例（30.8%），組合變異15例（38.4%）。39例患者RT區(qū)序列突變情況見表1。

表1　 39例乙型肝炎和肝硬化患者HBV RT區(qū)序列突變情況

2.3核苷酸類似物應用與耐藥位點分析檢測到8例患者對ADV耐藥，其中1例為B基因型，其余為C基因型。耐藥位點分別為：rtA181V/T/S、rtV214A/ E、rtN236T，變異模式為rtA181V/T/S或rtN236T單位點變異和rtA181V/T/S+rtN236T、rtA181V/T/S+ rtV214A/E、rtA181V/T/S+rtV214A/E+rtN236T聯(lián)合變異；其中rtA181V/T/S和rtN236T為主要耐藥位點，rtV214A/E為可能耐藥位點；11例患者對LAM耐藥，均為C基因型，發(fā)現(xiàn)對LAM耐藥的患者都對LDT耐藥，其共同主要耐藥位點為rtM204I/V/S，代償耐藥位點為rtL180M；3例患者存在LAM、LDT、ETV共同耐藥，均為C基因型；ETV耐藥位點為rtL180M、rtM204I/V/S、rtT184S/A/G/I/L、rtI169T、rtM 250V/I/L，其中rtL180M、rtM204I/V/S為LAM和LDT共同耐藥位點；1例C基因型患者對LAM、ADV、LDT同時耐藥，其變異模式為rtM204I/V/S+ rtA181V/T/S和+rtL180M。rtA181V/T/S和rtV214A/ E是ADV主要的耐藥位點，而rtA181V/T/S和rtV214A/E可能是LAM潛在的耐藥位點。未發(fā)現(xiàn)對TDF耐藥患者。

3　討論

HBV基因組由不完全的環(huán)狀雙鏈DNA組成，有S區(qū)、C區(qū)、P區(qū)和X區(qū)4個開放閱讀框，均位于長鏈，其中P區(qū)是最長的讀碼框，編碼多種功能蛋白，包括DNA聚合酶[10]。此酶既有以RNA為模板合成DNA的逆轉(zhuǎn)錄酶功能，又有催化合成DNA的多聚酶功能。目前，NAs均以HBV逆轉(zhuǎn)錄酶作為靶點，通過取代病毒復制過程中延長聚合酶鏈所需的結(jié)構(gòu)相似的核苷，發(fā)揮抑制病毒復制的作用。所以，NAs并不能清除肝細胞內(nèi)的HBV cccDNA，需要長期服用才能獲得持久的病毒學、生化學以及血清學應答。在持久的藥物選擇壓力作用下，催生了耐藥的發(fā)生。當然，NAs選擇出變異株的可能性主要取決于其抑制病毒復制的強度，即越能強效的抑制病毒復制，其耐藥的概率越小。本研究總結(jié)了39例慢性乙型肝炎和肝硬化患者HBV基因型分布特點和不同種類NAs的耐藥變異模式。

1988年，日本學者Okamoto根據(jù)HBV DNA全基因序列異質(zhì)性≥8%的標準首次提出HBV基因型的概念，并通過比較18珠不同的血清HBV DNA全序列，將HBV分為A、B、C、D基因型[11]。至今HBV可分為A～J 10種基因型[12]。HBV基因型具有明顯的地理分布特點，在東亞地區(qū)如中國、韓國、日本，慢性乙型肝炎患者以B型和C型為主。我國南方以B型多見，北方以C型為主，少數(shù)民族地區(qū)可見到一定比例的A型和D型。周莉等報道在北京地區(qū)297例CHB患者中，B型占12.18%，C型占87.21%，未發(fā)現(xiàn)其它基因型[13]。本研究發(fā)現(xiàn)的乙型肝炎和肝硬化患者感染HBV基因型分布特點與上述結(jié)論基本一致。

既往報道表明，HBV基因型不僅與臨床轉(zhuǎn)歸有關，與不同類型的藥物治療效果也有關系。B基因型患者臨床病變多較輕，C基因型往往與較重的病情有關[14，15]。李潔萍報道了C基因型引起的肝組織炎癥壞死及肝纖維化的進展程度較B基因型明顯加重，有顯著的統(tǒng)計學差異（x2=8.82、x2=10.67，均P＜0.05）[16]。研究表明B基因型對干擾素治療應答效果較C基因型好，而B、C兩種基因型對NAs的治療應答效果無明顯差異。對于基因型與HBV耐藥檢出率的相關性，目前的報道并不一致。林菲等報道在153例CHB患者，B、C基因型耐藥檢出率無統(tǒng)計學差異[17]；閔曉春等研究的結(jié)果顯示基因B型比基因C型更易檢出耐藥位點[18]。本研究中，在32例（82.1%）C基因型和2例（5.1%）B基因型患者，檢測到27例RT區(qū)序列突變，只有1例（6.6%）是B基因型感染者，其余耐藥患者均為C基因型，可以看出檢出的耐藥患者C基因型所占比例更大，與之前報道不一致，也許與本研究納入對象均為臨床疑似耐藥或者觀察到耐藥的患者，且樣本量較小有關。

由于NAs在抗病毒過程中具有療程不確切的特點，隨著治療時間的延長，NAs耐藥不可避免。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)LAM耐藥相關位點為rtM204I/V/S、rtA181V/T/S、rtV173L、rtL180M，其中M204V/I/S（YMDD變異及酪氨酸-蛋氨酸-天門冬氨酸區(qū)域）位點被稱為主要耐藥突變，它的出現(xiàn)顯著地降低了病毒對LAM的敏感性，其他的變異常與YMDD變異同時出現(xiàn)，一定程度上能夠恢復YMDD變異病毒的復制能力[19]。LDT主要耐藥位點為：rtM204I/V/S，代償耐藥位點是rtV173L和rtL180M，LDT和LAM具有相同的耐藥位點，即rtM204I/V/S。因此，對LAM耐藥的患者往往對LDT有交叉耐藥。在本研究中發(fā)現(xiàn)11例LAM耐藥患者都對LDT耐藥，變異模式為rtM204I/V/S單位點或者rtM204I/V/S+rtL180M組合變異，支持既往的研究結(jié)論。同屬于核苷類似物的ETV主要耐藥位點為rtL180M、rtM204I/V/S、rtI169T、rtT184S/A/G/I/L、rtS202G/C/I、rtM250V/I/L，在本研究中共檢測到rtL180M、rtM204I/V/S、rtI169T、rtT184S/A/G/I/L位點變異，均為組合變異模式，3例ETV耐藥患者對LAM、LDT同時耐藥，說明NAs之間存在交叉耐藥，在LAM耐藥基礎上出現(xiàn)的ETV耐藥稱為二次打擊模式[20]，提示當核苷類似物中出現(xiàn)變異時應換用或者加用無環(huán)核苷酸類類似物。ADV存在rtA181V/T/S、rtN236T主要耐藥位點，rtV214A/E、rtQ215S、rtI233V、rtP237H、rtN/H238T/D可能耐藥位點。本文中檢測到的ADV耐藥變異模式為rtA181V/T/S或rtN236T單位點變異及rtA181 V/T/S+rtN236T、rtA181V/T/S+rtV214A/E、rtA181V/T/ S+rtV214A/E+rtN236T組合變異。當患者耐藥位點為rtA181V/T/S時，研究發(fā)現(xiàn)其對LAM敏感性降低，說明LAM與ADV可能存在交叉耐藥。TDF的耐藥位點為rtA194T。本研究中未檢測到TDF耐藥。目前未發(fā)現(xiàn)ETV與ADV有共同耐藥位點。當出現(xiàn)任何一種NAs耐藥時，都可以換用ADV聯(lián)合ETV抗病毒。本研究未發(fā)現(xiàn)TDF與其他NAs存在共同耐藥位點，TDF仍可作為耐藥后的補救選擇。但是，TDF對ADV耐藥患者的治療效果仍然值得關注。

由于NAs仍然是大部分CHB患者首選的治療方案，耐藥變異是每一個臨床醫(yī)生及病人都必須正視的問題。根據(jù)目前的研究已經(jīng)明確了NAs藥物的部分耐藥位點，在治療基線時檢測患者HBV耐藥位點可能會取得更好的抗病毒效果，并節(jié)約衛(wèi)生經(jīng)濟資源，但是需要注意的是肝細胞內(nèi)的HBV具有很高的復制率，且HBV聚合酶缺乏校正功能，治療開始時根據(jù)耐藥位點選擇的抗病毒藥物仍然有可能再產(chǎn)生新的變異。因此，在治療基線時檢測患者HBV耐藥位點并不能取得一勞永逸的效果。隨著新的抗病毒藥物的面世，新的耐藥位點將不斷涌現(xiàn)，更大樣本、更全新的研究抗病毒藥物的耐藥仍然是必須的。

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（收稿：2015-04-17）

（本文編輯：陳從新）

HBV genotypes and P gene resistant mutants in hepatitis B patients duringnucleos（t）ide analogues

Xie Qiaoling，Cong Qingwei，Wu Linghong，et al.Department of Infectious Diseases.First Affiliated Hospital，
Dalian Medical University，Dalian 116000，Liaoning Province，China

10.3969/j.issn.1672-5069.2016.01.015treatment

國家自然科學基金資助項目（編號：81273925）

116000遼寧省大連市大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院感染病科第一作者：謝巧靈，女，24歲，碩士研究生。E-mail：13354282583@163.com

朱英，E-mail：zhuyingsh52@126.com