趙素斌，張小芳，李守霞

射頻消融術(shù)治療原發(fā)性肝癌患者外周血淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞的變化

趙素斌，張小芳，李守霞

目的觀察肝癌患者經(jīng)射頻消融（RFA）治療后外周血淋巴細(xì)胞亞群和NK細(xì)胞的變化，探討射頻消融術(shù)對(duì)肝癌患者免疫功能的影響。方法采用射頻消融治療儀治療原發(fā)性肝癌患者66例，采用流式細(xì)胞術(shù)分析外周血淋巴細(xì)胞亞群和NK細(xì)胞的變化。結(jié)果在RFA治療4 w后，患者外周血CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比值和CD16+CD56+細(xì)胞百分比分別為（73.3±11.3）%、（41.3±12.5）%、（1.8±0.5）和（18.9±6.1）%，較RFA治療前的（60.3±9.7）%、（31.5±10.6）%、（1.5±0.6）和（10.1±5.0）%均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；CD8+和CD19+細(xì)胞百分比略升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論原發(fā)性肝癌患者細(xì)胞免疫功能處于抑制狀態(tài)，RFA治療可以激發(fā)機(jī)體細(xì)胞免疫功能，調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞亞群，升高NK細(xì)胞，從而改善患者的免疫抑制狀態(tài)。

原發(fā)性肝癌；射頻消融；淋巴細(xì)胞亞群；流式細(xì)胞術(shù)；NK細(xì)胞

【Key words】Hepatocellular carcinoma；Radiofrequency ablation；Flow cytometry；Lymphocyte subsets；NK cells

肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是目前國(guó)內(nèi)外最常見(jiàn)的惡性腫瘤，其死亡率位居各種惡性腫瘤的前列[1]。射頻消融術(shù)（Radiofrequency ablation，RFA）是近年來(lái)治療原發(fā)性肝癌的一種微創(chuàng)技術(shù)，具有療效確切、操作簡(jiǎn)便、安全性高、組織損傷小、術(shù)后并發(fā)癥少、可重復(fù)操作等優(yōu)點(diǎn)[2]。射頻消融術(shù)在治療腫瘤的同時(shí)可以促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生抗腫瘤免疫，提高腫瘤患者的生存期[3，4]。本研究回顧性分析了66例接受RFA治療的原發(fā)性肝癌患者在RFA治療前后外周血淋巴細(xì)胞亞群和NK細(xì)胞的變化，現(xiàn)報(bào)告如下：

1　資料與方法

1.1病例來(lái)源2012年6月～2014年12月在邯鄲市中心醫(yī)院和河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院診治的原發(fā)性肝癌患者66例，男40例，女26例；年齡30～79歲，平均年齡（52.6±7.9）歲。符合原發(fā)性肝癌的診斷及臨床分期標(biāo)準(zhǔn)[5]。入選標(biāo)準(zhǔn)：腫瘤直徑2～6 cm，腫瘤數(shù)目1～4個(gè)，無(wú)門(mén)靜脈或下腔靜脈癌栓，無(wú)肝外轉(zhuǎn)移灶，肝功能Child A級(jí)36例，B級(jí)30例[6]。所有患者簽署知情同意書(shū)。

1.2儀器和試劑使用西門(mén)子Acuson Sequoia 512彩色多普勒超聲診斷儀，探頭頻率為2～10 MHz，配備有探頭穿刺架；使用北京博萊德光電技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司生產(chǎn)的多極射頻腫瘤消融系統(tǒng)（RFA-Ⅱ型)；使用美國(guó)BD Biosciences公司生產(chǎn)的FACS Cabibur雙激光四色流式細(xì)胞儀和Calibrite四色校準(zhǔn)微球試劑盒（NO:340486/NO:340487）；鼠抗人CD3+/APC、CD4+/FITC、CD8+/PE、CD16+/PE、CD56+/PE和CD19+/FITC單克隆抗體、溶血素均購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司。

1.3 RFA治療根據(jù)患者病變部位的不同，分別采取仰臥位或者俯臥位，在B超引導(dǎo)下向癌灶內(nèi)插入針形電極，彩色多普勒超聲觀察腫瘤與周邊臟器關(guān)系，確定穿刺部位。建立靜脈通路，肌肉注射度冷丁和安定。根據(jù)患者腫塊大小及部位，選擇適當(dāng)?shù)腞FA電極（RFA-1312或RFA-1315），消毒、鋪巾，用無(wú)菌袖套包扎穿刺探頭及連接線，尋找最合適的進(jìn)針線路。將RFA電極針刺入肝臟，到達(dá)腫瘤組織內(nèi)，觀察周?chē)袩o(wú)需要避讓的大血管或者膽管、膽囊等，明確針尖位置，將RFA裝置輸入功率調(diào)為650 w，最大輸出功率200 w，射頻工作頻率330 kHz，負(fù)載阻抗無(wú)感電阻50 Ω，負(fù)載功率200 w，凝血輸出的最大功率150 w，消融溫度自動(dòng)控制為（90±2）℃，消融時(shí)間為12～20 min，消融范圍≥R（腫塊直徑）+1.5 cm，打開(kāi)微電極，接通射頻電流后，消融腫瘤。直徑<5 cm的靶腫瘤將全部被強(qiáng)回聲掩蓋，將3～5 cm靶腫瘤及其周邊血管行微波硬化處理。

1.4 T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)空腹抽取外周血2～3ml，EDTA-K2抗凝，加入熒光抗體10μl至流式細(xì)胞儀專(zhuān)用試管底部，再加入抗凝血100μl，低速混勻3 s，室溫避光靜置15～20 min；加入溶血素2 ml，低速混勻，室溫避光靜置10～12 min，待紅細(xì)胞完全裂解后，300 g離心5 min，棄上清液；加入PBS 2 ml洗滌，低速混勻，300 g離心5 min，棄上清液；加入含1%多聚甲醛的PBS 250μl，低速混勻，上機(jī)檢測(cè)CD3+、CD4+、CD8+、CD16+、CD56+和CD19+細(xì)胞百分比。在檢測(cè)時(shí)設(shè)同型對(duì)照。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1臨床效果66例患者接受RFA治療后，隨訪3～10個(gè)月，完全緩解6例（9.09%），部分緩解30例（45.5%），病情穩(wěn)定17例（25.7%）。13例（19.7%）術(shù)后相繼出現(xiàn)肝內(nèi)新發(fā)病灶。2.2 RFA治療前后外周血淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞的變化治療后患者外周血CD3+、CD4+、CD4+/CD8+和CD16+CD56+細(xì)胞百分比較RFA治療前均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；CD8+和CD19+細(xì)胞略升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表1）。

表1　66例患者RFA治療前后外周血淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞(%，x±s)的變化

3　討論

HCC的發(fā)生發(fā)展與機(jī)體的免疫功能失調(diào)密切相關(guān)。肝癌患者細(xì)胞免疫功能低下，處于免疫抑制狀態(tài)，正常的免疫功能遭到破壞[7，8]。近年來(lái)，RFA應(yīng)用廣泛，技術(shù)發(fā)展迅速，國(guó)內(nèi)外報(bào)道明顯增多[9，10]。有研究顯示[11，12]，與手術(shù)切除相比，RFA術(shù)后腫瘤壞死組織吸收進(jìn)入血液后，可作為內(nèi)源性抗原激發(fā)機(jī)體的抗腫瘤免疫，提高機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答。HCC經(jīng)RFA治療后，可影響淋巴細(xì)胞亞群分布，使患者免疫功能得到改善。有報(bào)道表明[13]，RFA術(shù)后聯(lián)合應(yīng)用干擾素治療，可進(jìn)一步提高生存率，明顯降低腫瘤轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)率。RFA主要通過(guò)3種途徑發(fā)揮抗癌作用:①直接殺傷惡性腫瘤細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的產(chǎn)生，增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能；②經(jīng)熱療后暴露腫瘤細(xì)胞表面抗原或增強(qiáng)腫瘤抗原性，參與腫瘤抗原呈遞，激發(fā)細(xì)胞免疫；③熱療致使局部產(chǎn)生免疫反應(yīng)。T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫是體內(nèi)免疫系統(tǒng)中主要的抗腫瘤免疫。CD3+細(xì)胞為成熟T淋巴細(xì)胞表面的膜分子，基本可以反映外周血T淋巴細(xì)胞的總量。CD4+細(xì)胞為輔助性T淋巴細(xì)胞，通過(guò)釋放細(xì)胞因子激活巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞，參與抗腫瘤免疫效應(yīng)。CD8+為細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞裂解和細(xì)胞凋亡直接殺死腫瘤細(xì)胞，而保持CD4+/CD8+比值平衡對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫和維持機(jī)體的免疫功能有著重要作用。因此，通過(guò)檢測(cè)淋巴細(xì)胞亞群和NK細(xì)胞水平，可在很大程度上反映機(jī)體的免疫功能。

本研究結(jié)果表明，原發(fā)性肝癌患者在RFA治療后，CD3+、CD4+、CD4+/CD8+和NK細(xì)胞水平與治療前比較均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；CD8+、CD19+水平略升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與有關(guān)報(bào)道結(jié)果基本一致。

RFA治療原發(fā)性肝癌，不僅可以消除局部腫塊活性，還可以改善機(jī)體免疫抑制狀態(tài)，增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè)對(duì)于指導(dǎo)腫瘤綜合治療、觀察療效、判斷預(yù)后具有重要的臨床意義。

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（收稿：2015-03-30）

（本文編輯：陳宗炳）

Effect of radiofrequency ablation on peripheral blood lymphocytes and NK cells in patients with hepatocellular carcinoma

Zhao Subin，Zhang Xiaogfang，Li Shouxia.Third
DepartmentofSurgery，AffiliatedHospital，HebeiUniversity of

Engineering，Handan 056001，Hebei Province

10.3969/j.issn.1672－5069.2016.01.028

056001河北省邯鄲市河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院普外三科（趙素斌）；邯鄲市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科（張小芳，李守霞）

趙素斌，男，主任醫(yī)師。主要從事肝膽外科學(xué)研究。E-mail:laopoaini777@sina.com

李守霞，E-mail:xiaofang1118@126.com