李樹義，鮑承賢，張　敬

(1.河北省唐山市第九醫(yī)院檢驗科，河北 唐山 063000；2.河北省承德市雙橋區(qū)疾病預(yù)防控制中心計免科，河北 承德 067000；3.河北省唐山市中心血站檢驗科，河北 唐山 063000)

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·論著·

呼吸道感染細(xì)菌聯(lián)合疫苗體內(nèi)實驗研究

李樹義1，鮑承賢2，張敬3

(1.河北省唐山市第九醫(yī)院檢驗科，河北 唐山 063000；2.河北省承德市雙橋區(qū)疾病預(yù)防控制中心計免科，河北 承德 067000；3.河北省唐山市中心血站檢驗科，河北 唐山 063000)

目的通過小鼠體內(nèi)實驗進(jìn)行免疫學(xué)指標(biāo)檢測，觀察其對機體免疫功能的影響，為研制我國呼吸道感染細(xì)菌聯(lián)合疫苗提供理論依據(jù)。方法①分離培養(yǎng)我國小兒呼吸道感染常見6種細(xì)菌，按洗滌、超聲波破碎、沉淀、透析、分光光度計測定等過程制備細(xì)菌蛋白，等量混合配成一定濃度作為實驗用聯(lián)合疫苗。②取無特定病原體級小鼠40只，隨機分成4組，每組10只。全部實驗小鼠飼喂基礎(chǔ)日糧，適應(yīng)性喂養(yǎng)10 d后，實驗組分別用濃度為0.1、0.2、0.4 g/L聯(lián)合疫苗免疫，每天上午灌服0.2 mL。對照組每天灌服0.2 mL生理鹽水。免疫10 d。處死小鼠，分別測定聯(lián)合疫苗組小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能、細(xì)胞免疫功能、血清中溶血素含量以及胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響。結(jié)果聯(lián)合疫苗組的巨噬細(xì)胞吞噬率和吞噬指數(shù)、左右后足質(zhì)量差、溶血素吸光度值、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著高于對照組(P<0.05),在實驗設(shè)計疫苗濃度范圍各組中，不同組間檢測值隨疫苗濃度的增加而加大，且各實驗組間也均存在明顯差異(P<0.05)。結(jié)論制備的聯(lián)合疫苗可提高機體免疫功能，不僅能提高細(xì)胞免疫功能，對體液免疫功能也具有明顯影響，在實驗濃度范圍內(nèi)，疫苗濃度越高對機體免疫功能影響越明顯。

呼吸道感染；疫苗；免疫

10.3969/j.issn.1007-3205.2016.06.020

細(xì)菌和病毒均可引起呼吸道感染，病毒感染后可繼發(fā)細(xì)菌感染，臨床治療多應(yīng)用抗生素，因藥物品種的選擇和劑量問題，可導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性或菌群失調(diào)。利用免疫制劑預(yù)防或治療呼吸道感染，增強機體免疫力，是需要深入研究的課題[1-2]。蘭菌凈、泛福舒、必思添等制劑是將引起呼吸道感染的常見細(xì)菌經(jīng)過特殊處理，制成的聯(lián)合細(xì)菌混懸液。蘭菌凈由溶血性鏈球菌、肺炎克雷伯菌、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、流感嗜血桿菌B型制成，具有很好的抗原性，但由于地域、種族和不同的生活習(xí)慣，且制備蘭菌凈的細(xì)菌均來自英國菌株中心，其可能更適合歐洲白人應(yīng)用；另外，進(jìn)口疫苗價格昂貴，國內(nèi)需自費接種，影響了此類疫苗的普及。所以，研制和生產(chǎn)一種針對我國預(yù)防和治療呼吸道感染疾病的價格合理、效果更佳的疫苗勢在必行。本研究以此為理論基礎(chǔ)，制備呼吸道感染細(xì)菌聯(lián)合疫苗，并通過體內(nèi)實驗，對聯(lián)合疫苗的免疫學(xué)效果進(jìn)行檢測[3]。現(xiàn)報告如下。

1　材料與方法

1.1實驗動物健康昆明種小鼠，無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，購自北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院。實驗用公雞：由華北理工大學(xué)實驗動物中心提供。取SPF級小鼠40只隨機分成4組：正常對照組，聯(lián)合疫苗1組，聯(lián)合疫苗2組，聯(lián)合疫苗3組，每組各10只。全部實驗小鼠飼喂基礎(chǔ)日糧，適應(yīng)性喂養(yǎng)10 d后，分別用濃度為0.1、0.2、0.4 g/L聯(lián)合疫苗免疫1組、2組、3組小鼠，每天上午灌服0.2 mL[4-5]；對照組小鼠每天灌服生理鹽水0.2 mL。免疫10 d。根據(jù)實驗要求處死小鼠，進(jìn)行檢測。

1.2主要試劑蛋白胨溶液(湖北興銀河化工有限公司)，氯化鈉注射液(山東齊都藥業(yè)有限公司)，75%乙醇(滄州鑫安化工產(chǎn)品有限公司)。

1.3主要儀器設(shè)備HR60-ⅡA2生物安全柜(青島海爾醫(yī)用低溫科技有限公司)，超聲波破碎儀SONIFIER(北京星越天成科技有限公司)，高速臺式離心機TGL-16B(上海安亭科學(xué)儀器廠)，電子精密天平CPA124S(上海恒磁電子科技有限公司)，臺式離心機TDL-40B(上海安亭科學(xué)儀器廠)，全自動酶標(biāo)儀SpectraPlus384(美國Molecular Devices公司)，分光光度計D-8PC(南京菲勒儀器有限公司)，光學(xué)顯微鏡CHC-212(日本奧林帕斯公司)。

1.4菌種來源由開灤總醫(yī)院收集細(xì)菌，在華北理工大學(xué)微生物實驗室分離培養(yǎng)。

1.5聯(lián)合疫苗的制備從臨床上分離培養(yǎng)呼吸道感染常見6種細(xì)菌(同蘭菌凈菌株)，等質(zhì)量混合，然后裝入無菌的離心管中，分別用生理鹽水洗滌，用天平調(diào)平后，以3 000 r/min離心10 min，棄去上清液，反復(fù)3次，取最后沉淀物用生理鹽水稀釋后，用超聲波破碎儀將細(xì)菌分別破碎，用移液管加飽和硫酸銨到破碎細(xì)菌混合液中，混勻，沉淀細(xì)菌蛋白，利用透析膜除去硫酸銨，分光光度計測定蛋白含量，用細(xì)菌蛋白作為抗原[6]。按比例將抗原混合用0.9%生理鹽水配置成實驗要求濃度即為實驗用聯(lián)合疫苗。

1.6雞紅細(xì)胞懸液的制備將雞翼下靜脈取血部位用75%酒精消毒后，用注射器抽取靜脈血，將雞血置于肝素抗凝管中。然后取抗凝血3 mL加入裝有12 mL生理鹽水的離心管中，混勻后2 000 r/min離心15 min。棄掉上清，再在離心管中加入12 mL生理鹽水，混勻后2 000 r/min離心15min。棄掉上清后，通過同樣方法再洗滌1次，其沉積物即為雞紅細(xì)胞。隨后立即取1 mL雞紅細(xì)胞加入9 mL生理鹽水中，充分混勻，此溶液即為體積比為10%雞紅細(xì)胞懸液。

1.7巨噬細(xì)胞吞噬功能測定進(jìn)行體外實驗前每天9：00向小鼠腹腔內(nèi)注入1%的蛋白胨溶液1次，共3次，末次注射24 h后，將1 mL 10%的雞紅細(xì)胞懸液注射入小鼠腹腔，30 min后，將小鼠頸椎脫臼處死，再向腹腔注入生理鹽水2 mL，輕輕按摩小鼠腹部1 min。打開小鼠腹腔，吸取1 mL腹腔液，均勻涂在潔凈載玻片上，37℃溫箱孵育30 min。漂洗掉未貼片細(xì)胞，晾干，甲醇固定，用瑞氏染液濃染2 min，加入等量緩沖液淡染3 min，沖洗干凈后晾干。顯微鏡下觀察巨噬細(xì)胞吞噬情況，并按下式計算。吞噬率=(吞噬雞紅細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)÷計數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù))×100%。吞噬指數(shù)=被吞噬的雞紅細(xì)胞總數(shù)÷計數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù)

1.8遲發(fā)型超敏反應(yīng)測定適應(yīng)性喂養(yǎng)各組小鼠2周后，將50 μL 10%(v/v)CRBC懸液注入每只小鼠的左后足掌，將等量生理鹽水注射入右后足掌。待24 h后，頸椎脫臼處死小鼠，沿相同部位切下小鼠雙后足，用電子天平精確稱其質(zhì)量，計算左右后足質(zhì)量差。

1.9血清溶血素含量測定取SPF級小鼠40只，按照1.6中分組及免疫小鼠，處死小鼠后摘除眼球取血，分離血清，用生理鹽水稀釋500倍待測。取稀釋的血清1 mL，10%雞紅細(xì)胞0.5 mL，10%的補體1 mL，依次加入試管內(nèi)，混勻。用混勻的稀釋血清作對照，置37℃恒溫水浴箱中反應(yīng)30 min，然后移至冰浴中使反應(yīng)終止，2 000 r/min離心10 min，取上清液于λ540 nm處比色測吸光度值。

1.10小鼠免疫器官指數(shù)測定電子天平分別稱取小鼠體質(zhì)量；濾紙吸干取出的脾臟、胸腺表面血液，用精密電子天平分別稱其質(zhì)量。免疫器官指數(shù)=脾臟(胸腺)質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)。

1.11統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 13.0 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料比較分別采用單因素方差分析和SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)　　果

在實驗設(shè)計疫苗濃度范圍各組中，聯(lián)合疫苗1、2、3組與對照組相比，聯(lián)合疫苗2、3組與聯(lián)合疫苗1組間相比，小鼠巨噬細(xì)胞吞噬率及吞噬指數(shù)、左右后足質(zhì)量差、溶血素含量、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著提高(P<0.05)，見表1。

表14組各項觀察指標(biāo)比較

組別吞噬率(%)吞噬指數(shù)左右后足質(zhì)量差(mg)溶血素D(λ)脾臟指數(shù)胸腺指數(shù)對照組 22.5±1.950.32±0.0216.50±2.120.205±0.0234.92±0.231.53±0.32聯(lián)合疫苗1組27.3±1.65*0.46±0.02*21.60±2.07*0.229±0.018*5.64±0.30*2.16±0.24*聯(lián)合疫苗2組30.24±2.10*#0.57±0.04*#23.36±2.65*0.236±0.022*5.93±0.28*#2.56±0.31*#聯(lián)合疫苗3組35.29±2.65*#△0.65±0.05*#△25.63±3.02*#0.258±0.015*#△6.30±0.32*#△2.96±0.46*#△F 6.7814.9735.6253.9365.3057.582P 0.0010.0010.0010.0030.0010.001

*P<0.05與對照組比較#P<0.05與聯(lián)合疫苗1組比較△P<0.05與聯(lián)合疫苗2組比較(SNK-q檢驗)

3　討　　論

免疫制劑能調(diào)節(jié)機體免疫功能，減少不良反應(yīng)，能有效地預(yù)防和治療呼吸道感染。本研究利用引起小兒呼吸道反復(fù)感染的6種常見菌制備聯(lián)合疫苗，進(jìn)行動物體內(nèi)實驗，觀察聯(lián)合疫苗對機體免疫功能的影響。

巨噬細(xì)胞可識別和清除病原體等抗原性異物，參與和促進(jìn)炎癥反應(yīng)，對腫瘤和病毒感染等靶細(xì)胞具有殺傷作用，可加工提呈抗原，啟動適應(yīng)性免疫應(yīng)答，活化的巨噬細(xì)胞可通過分泌多種細(xì)胞因子，參與免疫調(diào)節(jié)[7]。細(xì)菌溶解產(chǎn)物能增強巨噬細(xì)胞的趨化作用，增加IL-2和IFN-γ的分泌量，提高T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的活性，同時增強單個核細(xì)胞和多核細(xì)胞的吞噬功能[8-9]。實驗聯(lián)合疫苗的作用機制與蘭菌凈、泛福舒相似，可能是通過刺激巨噬細(xì)胞，增強淋巴因子釋放，激活T淋巴細(xì)胞和促使B細(xì)胞向漿細(xì)胞成熟轉(zhuǎn)化，T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生淋巴因子、漿細(xì)胞使IgA和自然殺傷細(xì)胞活性增強，提高機體免疫力[10-11]；也可能是通過激活黏膜源性淋巴組織，使其分泌補體及細(xì)胞活素，刺激氣管黏膜分泌免疫球蛋白，肺、腸分泌的IgA 濃度增加，提高呼吸道分泌型IgA(SIgA)及肺的巨噬細(xì)胞活性，通過特異性、非特異性細(xì)胞和體液機制增強免疫系統(tǒng)反應(yīng)的效應(yīng)，并可獲得長期非特異性免疫保護作用，對反復(fù)呼吸道感染可起到預(yù)防和治療的目的[12-13]。巨噬細(xì)胞是體內(nèi)執(zhí)行非特異性免疫作用的效應(yīng)細(xì)胞，其吞噬指數(shù)是衡量機體非特異性免疫功能指標(biāo)[14-15]。本研究結(jié)果顯示，在實驗濃度范圍各組中，聯(lián)合疫苗組與對照組相比，聯(lián)合疫苗高濃度組與低濃度組間相比，小鼠的巨噬細(xì)胞吞噬率和吞噬指數(shù)得到明顯提高。說明制備的聯(lián)合疫苗可以提高小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能，促進(jìn)正常小鼠非特異性免疫功能，且隨濃度的升高免疫功能加強。

遲發(fā)型超敏反應(yīng)也稱Ⅳ超敏反應(yīng)，為變態(tài)反應(yīng)的一種。本研究采用雞紅細(xì)胞誘導(dǎo)小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)，觀察小鼠左右后足質(zhì)量差異(即足墊部腫脹程度)來衡量細(xì)胞免疫功能[16]。本研究結(jié)果顯示，聯(lián)合疫苗組小鼠左右后足質(zhì)量差與對照組相比，實驗高濃度組與低濃度組相比，檢測數(shù)據(jù)均明顯增高。說明制備的聯(lián)合疫苗對小鼠細(xì)胞免疫功能具有促進(jìn)作用，且隨濃度的增高免疫功能增強。

溶血素是B淋巴細(xì)胞受抗原刺激后，分化成漿細(xì)胞產(chǎn)生的抗體。抗體是機體殺滅病原菌和清除外來抗原的重要活性物質(zhì)，主要存在于體液中，是體液免疫反應(yīng)的標(biāo)志。本研究采用雞紅細(xì)胞免疫小鼠，致使小鼠血清溶血素抗體生成，其生成量可代表抗體生成總量，從而觀察聯(lián)合疫苗對小鼠體液免疫功能的影響[17]。溶血素與雞紅細(xì)胞、補體在37 ℃發(fā)生反應(yīng)，雞紅細(xì)胞溶解。紅細(xì)胞破裂釋放出的血紅蛋白使溶液變成紅色，顏色越深，血紅蛋白滲出量越多，且吸光度值與溶血素含量正相關(guān)，測定上清液的吸光度值，可間接反映血清中溶血素的含量，從而反映機體的體液免疫水平。本研究結(jié)果顯示，聯(lián)合疫苗組比對照組吸光度值顯著增高，實驗疫苗高濃度組與低濃度組相比吸光度值也明顯增高。表明此聯(lián)合疫苗可顯著提高小鼠體液免疫功能，且隨實驗濃度的增高體液免疫功能增強。

免疫器官是實現(xiàn)免疫功能的器官或組織，是免疫細(xì)胞進(jìn)行生長發(fā)育以及產(chǎn)生免疫應(yīng)答的主要場所，當(dāng)免疫器官生理性體積增大，免疫細(xì)胞數(shù)量增多，機體的免疫功能與抵抗力也會相對增強。因此，促進(jìn)免疫器官質(zhì)量增加，必定對機體免疫力起到提高的作用[18]。從本研究結(jié)果可以看出，用聯(lián)合疫苗免疫后，小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均顯著提高，隨濃度的升高其檢測指數(shù)也明顯升高。說明聯(lián)合疫苗可以促進(jìn)機體免疫細(xì)胞增殖，提高機體免疫功能，且隨濃度的升高而加強。

總之，通過一系列體內(nèi)實驗，證明利用呼吸道常見感染細(xì)菌制備的聯(lián)合疫苗，對機體非特異性免疫、細(xì)胞免疫和體液免疫均有明顯提高，且在實驗濃度范圍內(nèi)隨疫苗濃度的升高而增強免疫力。同時證明利用我國上呼吸道感染的常見細(xì)菌，能夠成功制備細(xì)菌聯(lián)合疫苗，這為我國聯(lián)合疫苗的研制提供了理論依據(jù)。

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(本文編輯：劉斯靜)

In vivo experimental study of bacteria combined vaccine in respiratory tract infection

LI Shu-yi1, BAO Chen-xian2, ZHANG Jing3

(1.Department of Clinical Laboratory,the Ninth Hospital of Tangshan City,Tangshan 063000, China;2.Department of Planned Immunization, Prevention and Control Center of Shuangqiao, Chengde 067000, China; 3.Department of Clinical Laboratory, Blood Center of Tangshan City, Tangshan 063000, China)

ObjectiveThe immune function of the mice was detected through theinvivoexperiment in mice, which will provide theoretical basis for the development of the bacterial combined vaccine of respiratory tract infection in our country. Methods①Six common bacterias in children with respiratory tract infection in our country were isolated and cultured. Bacterial proteins were prepared by washing, ultrasonic crushing, precipitation, dialysis and spectrophotometer, and the equivalent amount of the mixture was used as the experimental combined vaccine. ②Forty specific pathogen free mice were randomly divided into four groups, with 10 rats in each group. All mice were fed with a basal diet.After adaptive feeding for 10 days, the experimental group were fed with concentrations of 0.1, 0.2, 0.4 g/L combined vaccine, with daily morning irrigation of 0.2 mL. The mice in normal control group were orally administered daily with physiological saline 0.2 mL. All groups were immuned for 10 days. Effects of combined vaccine on the phagocytic function of macrophage,the cellular immune function of mice, the changes of serum hemolysin content and the effect of thymus index and spleen index determinated. ResultsCompared with the normal control group, the macrophage phagocytic rate and phagocytic index,left and right foot weight, the absorbance value of serum hemolysin, the spleen index and thymus index of combined vaccine groups were significantly increased(P<0.05). In the experimental design of vaccine concentration range, the detection values in different groups were increased with the increasement of vaccine concentration, and there were significant differences among the test groups(P<0.05). ConclusionCombined vaccine can improve the immune function of organism. Combined vaccine can not only improve the cellular immune function, but also has obvious effect on humoral immune function. In the experimental concentration range, the higher the vaccine concentration, the more obvious effect on the immune function of the body.

respiratory tract infections； vaccines； immunity

2015-11-02；

2015-12-11

李樹義(1974-)，男，滿族，河北青龍人，河北省唐山市第九醫(yī)院副主任檢驗師，醫(yī)學(xué)碩士，從事臨床檢驗學(xué)研究。

R517.6

A

1007-3205(2016)06-0693-04