姚璐曄，張琪，沈博文，李欣怡，董駿，王開方，田嘉龍（常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟215500）

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家釀葡萄汁飲品中優(yōu)勢酵母菌的分離鑒定

姚璐曄，張琪，沈博文，李欣怡，董駿，王開方，田嘉龍
（常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟215500）

分離研究家釀葡萄汁飲品中的優(yōu)勢酵母菌，為本地葡萄釀酒酵母資源的篩選及其利用奠定基礎(chǔ)。從家釀葡萄汁飲品中分離得到一株優(yōu)勢酵母菌（命名為CSLG02），結(jié)合顯微結(jié)構(gòu)和生理生化試驗(yàn)結(jié)果，以及對其26S rDNA D1/D2序列的分析確定該菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位；通過人為地在葡萄汁中添加試驗(yàn)菌株CSLG02，發(fā)酵釀制葡萄汁飲品，考察飲品的各個(gè)理化指標(biāo)。研究結(jié)果表明，菌株CSLG02鑒定為釀酒酵母屬（Saccharomyces cerevisiae）。添加該菌后的試驗(yàn)組較對照組，飲品中各個(gè)理化指標(biāo)均有不同程度的改變。S.cerevisiae CSLG02的添加，能改善家釀葡萄汁飲品的口感和品質(zhì)，對形成地域性葡萄汁飲品的研究具有實(shí)際幫助意義。

家釀葡萄汁飲品；優(yōu)勢酵母菌；釀酒酵母；特性

葡萄酒自然發(fā)酵是借助于葡萄果皮或空氣中的天然野生酵母完成的酒精發(fā)酵過程。葡萄酒發(fā)酵是一個(gè)復(fù)雜生態(tài)和生化過程，多種酵母在發(fā)酵過程中的相互協(xié)作可有效地增加葡萄酒風(fēng)味的多樣性和復(fù)雜性［1］。在釀造過程中，通過酵母菌的作用將葡萄原料中的各種潛在品質(zhì)于酒中充分凸顯出來［2］。酵母作為主要的發(fā)酵微生物不僅對葡萄酒質(zhì)量和發(fā)酵過程影響很大，而且對葡萄酒色澤、香氣、感官質(zhì)量及風(fēng)格的形成有重要貢獻(xiàn)［3］。同時(shí)，釀酒葡萄的自然發(fā)酵液一直是野生優(yōu)良酵母的重要來源［4］。用不同菌株發(fā)酵生產(chǎn)的葡萄酒，其酒質(zhì)和風(fēng)味差別很大。所以尋找能夠適應(yīng)當(dāng)?shù)仄咸言咸匦?、有利于形成地域葡萄酒風(fēng)格的新土著酵母菌株及新酵母種已成為研究的焦點(diǎn)［5-10］。

由于天然釀制葡萄酒價(jià)格的昂貴，大多數(shù)人引用自己釀制的葡萄汁飲品，其與葡萄酒相比，口感較甜，略有澀感，符合廣大人們的感官需求；同時(shí)，由于其制作簡單、成本較低且富有保健功效，深受人們的喜愛。本研究從家庭釀造的葡萄汁飲品（口感、顏色較突出）中分離出優(yōu)勢酵母菌，進(jìn)行鑒定，并在實(shí)驗(yàn)室中，添加進(jìn)葡萄汁進(jìn)行發(fā)酵，對生成的酒體進(jìn)行理化指標(biāo)檢測，證實(shí)分離得到的菌株對釀造的葡萄汁飲品品質(zhì)有顯著提高。

1　材料與方法

1.1材料與培養(yǎng)基

樣品：家釀葡萄汁飲品。

麥芽汁培養(yǎng)基：稱取500 g麥芽，2 000 mL水，于60℃、攪拌煮沸4 h，4層紗布過濾，取濾液；用蛋清澄清濾液，即得麥芽汁（12°Bx）。添加2%的瓊脂于液體培養(yǎng)基，即為麥芽汁固體培養(yǎng)基。

葡萄品種：采用中晚熟葡萄，品種為本地區(qū)常見的金手指和巨峰。

1.2儀器與設(shè)備

M124A電子天平：伯拉莫貝林（上海）精密儀器有限公司；FE20便攜式（數(shù)顯）pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；CJ-2S超凈工作臺：天津泰斯特儀器有限公司；ZQWY-200G振蕩培養(yǎng)箱：上海知楚儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1酵母菌的分離純化

將樣品液梯度稀釋，取0.2 mL稀釋液涂布于麥芽汁固體培養(yǎng)基上，36℃培養(yǎng)36 h，挑取單菌落。將得到的優(yōu)勢單菌落再次進(jìn)行劃線分離，獲得純菌落，保存于麥芽汁固體培養(yǎng)基上備用。

1.3.2酵母菌的顯微結(jié)構(gòu)

制作酵母水片，用顯微鏡高倍鏡（40×10倍）觀察其單細(xì)胞形態(tài)特征及生殖方式。

1.3.3酵母菌生理生化鑒定

按照《酵母菌的特征與鑒定手冊》［11］的方法，將酵母菌接種到不同培養(yǎng)基中，考察其生長情況。

1.3.4酵母菌的分子生物學(xué)鑒定

提取酵母菌株的26S rDNA D1/D2序列，使用TaKaRa Fungi Identification PCR Kit（Code No.RR178），進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的片段。反應(yīng)條件具體為：94℃、5 min；94℃0.5 min、55℃0.5 min、72℃1 min，30次循環(huán)；72℃、5 min。反應(yīng)結(jié)束，取5 μL進(jìn)行3%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收目的片段。送于上海寶生物公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行BLAST比對。選取同源性比較高的典型菌株的26S rDNA基因序列作為參比對象，用CLUSTAL 1.83軟件進(jìn)行多序列比對并計(jì)算目標(biāo)菌株與參比菌株之間的序列相似性［12-13］，采用鄰位相接法（Neighbor-Joining）［14-15］，應(yīng)用MEGA6.0軟件構(gòu)建目標(biāo)菌株與參比菌株之間的系統(tǒng)進(jìn)化樹［15］。

1.3.5酵母菌的活化

將4℃保藏的酵母菌接種于麥芽汁液體培養(yǎng)基中，36℃，180r/min培養(yǎng)16h，菌懸液濃度為1×107CFU/mL，待用。

1.3.6發(fā)酵試驗(yàn)

取新鮮葡萄，分選與除梗破碎，以葡萄汁體積為700 mL，調(diào)節(jié)總糖濃度30.0 g/L為標(biāo)準(zhǔn)，接入已活化的酵母菌。發(fā)酵控溫28℃～30℃，發(fā)酵14 d。將酒體用8層紗布過濾，取濾液，置于棕色瓶中，25℃二次發(fā)酵21 d。發(fā)酵結(jié)束，靜置，使其自然澄清，過濾，滿瓶貯存，檢測飲品各項(xiàng)理化指標(biāo)。

1.3.7理化指標(biāo)測定

1）酒精度檢測［16］

取50 mL樣品加50 mL水進(jìn)行蒸餾，至餾液為50 mL，定容至100 mL，取1 mL于50 mL容量瓶，加入10 mL硫酸，10 mL重鉻酸鉀溶液（0.032 4 g/mL），用蒸餾水定容，混勻。30 min后，以空白作參比，在594 nm處測吸光值，根據(jù)回歸方程計(jì)算得出樣品的酒精濃度。

2）pH值檢測

使用pH計(jì)直接檢測樣品的pH值。

3）總糖含量的測定［17］

準(zhǔn)確移取樣品10 mL至100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容，搖勻，轉(zhuǎn)入100 mL燒杯中，加1.5 g醋酸鉛沉淀劑（加量由正交試驗(yàn)結(jié)果確定），攪拌，溶解，70℃，處理10 min（處理溫度和時(shí)間由正交試驗(yàn)結(jié)果確定）。趁熱過濾，依次準(zhǔn)確移取2.0 mL濾液至具塞試管中，加4.0 mL蒸餾水、2.0 mL 6%苯酚，搖勻，快速加入10.0 mL濃硫酸，靜置15min，于冷水浴中冷卻，至室溫，在495nm出測吸光值。對照標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算總糖濃度。

4）總酚的測定［18］

吸取10 mL樣品稀釋至100 mL，取1 mL稀釋液至100 mL容量瓶中，加60 mL蒸餾水，混勻，加入5 mL福林-肖卡試劑，充分混合。在30 s至8 min內(nèi)加入15 mL 200 mg/L碳酸鈉溶液，加水定容至100 mL，混勻，在20℃下放置2 h，在765 nm處測吸光值，以空白樣為對照。對照標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出酚濃度。

5）總酸的測定［16］

吸取樣品2 mL于250 mL錐形瓶中，加入50 mL水，同時(shí)加入2滴酚酞指示液，混勻，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)液（cNaOH=0.05 mol/L）滴定至終點(diǎn)，并保持30 s內(nèi)不變色，記錄下消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)液的體積。同時(shí)做空白試驗(yàn)，計(jì)算得出樣品的酸度。

6）單寧含量的測定［16］

取10 mL樣品，用蒸餾水定容至100 mL，用濾紙過濾，取5 mL濾液，加入5 mL靛紅溶液（0.1%），100 mL蒸餾水，用0.01 mol/L KMnO4溶液（0.01 mol/L）快速滴定至黃綠色，再緩慢滴定至明亮的金黃色為終點(diǎn)，記下消耗的KMnO4溶液體積。計(jì)算得到單寧的含量。

2　結(jié)果與分析

2.1酵母菌的菌落特征

平板培養(yǎng)的酵母菌如圖1所示。

圖1　平板培養(yǎng)的酵母菌Fig.1　The strain CSLG02 cultured on plates

經(jīng)分離純化獲得的酵母菌，命名為CSLG02。菌落直徑為1 mm～2 mm，奶白色，表面凸起、光滑，不透明，奶油狀；培養(yǎng)到后期有酒香味。

2.2酵母菌的個(gè)體形態(tài)特征

酵母菌CSLG02的個(gè)體形態(tài)（×400）結(jié)果如圖2所示。

圖2　酵母菌CSLG02的個(gè)體形態(tài)（×400）Fig.2　The morphological character of strain CSLG02（×400）

通過普通光學(xué)顯微鏡對試驗(yàn)菌的菌體形態(tài)進(jìn)行觀察，菌株CSLG02具有典型的酵母細(xì)胞形態(tài)，橢圓形，單個(gè)排列，出芽繁殖。

2.3酵母菌生理生化鑒定

根據(jù)《酵母菌的特征與鑒定手冊》提供的方法對酵母菌CSLG02的生理生化特征進(jìn)行了初步鑒定，結(jié)果如表1。

表1　生理生化鑒定結(jié)果Table 1　Characterization of physiological and biochemical identification

續(xù)表1　生理生化鑒定結(jié)果Continue table 1　Characterization of physiological and biochemical identification

查閱《酵母菌的特征與鑒定手冊》并結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果，推測菌株CSLG02為酵母屬釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

2.426S rDNA序列分析

酵母菌CSLG02的26S rDNA電泳圖如圖3所示。

圖3　酵母菌CSLG02的26S rDNA電泳圖Fig.3　Electrophoresis patterns of 26S rDNA products from strain CSLG02

通過瓊脂糖凝膠電泳分離后，得到PCR產(chǎn)物，切膠回收片段進(jìn)行DNA測序。將菌CSLG02的26S rDNA序列與GeneBank數(shù)據(jù)庫中的真菌26S rDNA序列進(jìn)行BLAST同源性比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)酵母菌CSLG02的26S rDNA序列與數(shù)據(jù)庫中酵母屬釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的26S rDNA序列自然聚集。利用Clustalx1.83軟件進(jìn)行比對，利用MEGA6.0構(gòu)建進(jìn)化樹，建樹方法采用鄰位歸并法（Neighbor Joining）。

基于26S rDNA的菌株CSLG02的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖4。

圖4　基于26S rDNA的菌株CSLG02的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4　Phylogenetic tree of strain CSLG02 based on its 26S rDNA sequences

酵母菌CSLG02與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的分支，其分支出現(xiàn)的可信度為99%，表明兩者有較高的親緣性關(guān)系。由于真菌的26S rDNA的分子結(jié)構(gòu)具有高度的保守性，只在某些位置有少量的核苷酸序列改變，且這些改變具有種屬特異性，故而利用26S rDNA構(gòu)建基因進(jìn)化樹的可靠性很高。

2.5發(fā)酵試驗(yàn)

在葡萄汁中添加不同體積比例的S.cerevisiae CSLG02培養(yǎng)液，進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，考察其對飲品不同理化指標(biāo)的影響，結(jié)果如表2所示。

表2　S.cerevisiae CSLG02的不同添加量對葡萄汁飲品的影響Table 2　The effect of different S.cerevisiae CSLG02 addition on wine quality

2.5.1酒精度

用于葡萄汁發(fā)酵的酵母應(yīng)具有較高的酒精產(chǎn)率，以符合釀造要求。本試驗(yàn)中，隨著S.cerevisiae CSLG02添加量的增加，酒體的酒精度也逐步上升，最高值較未添加的對照組提高了38.6%，表明該菌的酒精轉(zhuǎn)化率高于發(fā)酵過程中的其他微生物。

2.5.2pH

一般葡萄汁的pH在3～4，這就要求酵母菌種具有較寬的生長pH范圍，才能用于葡萄汁的釀造。由于S. cerevisiae CSLG02來源于葡萄汁飲品中，因此完全能夠在低pH值范圍內(nèi)（pH3.0）生長；同時(shí)，人為的添加S.cerevisiae CSLG02并未改變飲品的pH，表明試驗(yàn)菌株的增加對飲品的主導(dǎo)口感改變不大，仍能維持其葡萄汁的基本特性，且發(fā)酵較為徹底。

2.5.3總糖

糖是酵母菌生長和繁殖的碳源，同時(shí)也是酒精發(fā)酵的底物。葡萄汁飲品中的含糖量直接決定了感官味蕾中的甜度，一般殘余總糖量在4.0 g/L～8.0 g/L，比較符合大眾對葡萄汁飲品的接受度。隨著S.cerevisiae CSLG02添加量的增加，樣品中殘余總糖量也隨之下降；當(dāng)試驗(yàn)菌株添加量為0.1%時(shí)，殘余糖含量僅為5.2 g/L，很接近干型酒的要求（＜4.0 g/L）。這一結(jié)果表明，S.cerevisiae CSLG02對于糖濃度的耐受性較好（初始總糖濃度為30 g/L），且其利用降解糖的能力顯著，適用于葡萄汁的釀造。

2.5.4總酸

葡萄汁飲品中的總酸是指葡萄汁中游離酸的總量，即可滴定酸。S.cerevisiae CSLG02的人為添加，致使樣品中總酸濃度顯著下降（19.6%），表明試驗(yàn)菌株在無氧環(huán)境下糖代謝能力旺盛，有利于葡萄汁中的酒石酸等轉(zhuǎn)化成飲品中的脂類物質(zhì)，增加濃郁感。

2.5.5單寧類物質(zhì)

葡萄汁中含有較多的單寧類物質(zhì)，它們決定了酒的風(fēng)味、結(jié)構(gòu)與質(zhì)地。添加S.cerevisiae CSLG02的試驗(yàn)組，較對照組總酚含量有所提高（0.06%），但單寧的含量并無明顯變化。酚類物質(zhì)具有特殊的芳香氣味，因此添加S.cerevisiae CSLG02試驗(yàn)組的酒體，醇香飽滿；而單寧來源于葡萄籽、皮及梗浸泡發(fā)酵而來，跟酵母菌的生理生化特性關(guān)系不大，因此，添加S.cerevisiae CSLG02并未改變飲品的單寧含量。

3　結(jié)論

本試驗(yàn)從家釀的葡萄汁飲品中，通過富集培養(yǎng)獲得了一株優(yōu)勢菌株，經(jīng)過顯微結(jié)構(gòu)、生理生化實(shí)驗(yàn)及分子生物學(xué)，鑒定其為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），命名為S.cerevisiae CSLG02（序列登錄號：KP744022）。將S.cerevisiae CSLG02按照不同的比例添加進(jìn)葡萄汁，發(fā)酵生成相應(yīng)的飲品，檢測其各個(gè)理化指標(biāo)，表明S.cerevisiae CSLG02的添加有助于提高葡萄汁的發(fā)酵度，改善其風(fēng)味。

試驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著S.cerevisiae CSLG02添加量的增加，酒體的酒精度也逐步上升，最高值較未添加的對照組提高了38.6%。S.cerevisiae CSLG02對于糖濃度的耐受性也較好（初始總糖濃度為30 g/L），且其利用降解糖的能力顯著，適用于葡萄汁的釀造。同時(shí)，人為添加S.cerevisiae CSLG02能導(dǎo)致樣品中總酸濃度顯著下降（19.6%），總酚含量有所提高（0.06%），有利于葡萄汁中的酒石酸等轉(zhuǎn)化成飲品中的脂類物質(zhì)，增加濃郁感。

常規(guī)葡萄酒是通過葡萄皮上天然的酵母菌發(fā)酵而來，不同的葡萄品種，其上附有的酵母菌的種類特性也不相同，造成了最終釀制葡萄酒風(fēng)味的差異。目前研究較多的是，在釀造過程中參與協(xié)同作用的酵母菌的種群［18-22］，以及葡萄酒體中風(fēng)味物質(zhì)的分類與來源［23-25］；卻很少有研究酵母菌和酒體之間的關(guān)聯(lián)，原因是釀造過程是菌群發(fā)酵，給研究帶來了難度。本研究旨在重點(diǎn)考察優(yōu)勢菌株在釀造過程中的作用，在不改變原先自然的、多菌發(fā)酵的基礎(chǔ)上，著重添加這一優(yōu)勢菌株，以期改變樣品的特性，使之更符合市場商品的需求，具有創(chuàng)新性。在后期的研究中，實(shí)驗(yàn)者將重點(diǎn)考察S.cerevisiae CSLG02對風(fēng)味物質(zhì)的影響，在此基礎(chǔ)上得到最佳的添加時(shí)間和添加量。這一研究內(nèi)容對葡萄汁釀造具有現(xiàn)實(shí)的使用價(jià)值和意義。

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Isolation and Identification of Dominant Yeast in Home Grape Juice Drink

YAO Lu-ye，ZHANG Qi，SHEN Bo-wen，LI Xin-yi，DONG Jun，WANG Kai-fang，TIAN Jia-long
（School of Biology and Food Engineering，Changshu Institute of Technology，Changshu 215500，Jiangsu，China）

To isolation and study the dominant yeast in home grape juice drinks，thus to make basis of screening and subsequent using the yeast in home drink.The dominant yeast（named CSLG02）was isolated from the home wine.According to its microstucture，physiological，biochemical properties and 26S rDNA D1/D2 sequence，its position in phylogenetic development tree was defined.By measuring the physical and chemical indicators of wine forms，the effect of CSLG02 addition on drink-making was investigated.The results showed that：strain CSLG02 was identified as Saccharomyces cerevisiae.There were some changes of physicochemical paramenters between the control and experimental group，which was added the stain CSLG02 into drink making.The drink quality was enhanced by adding the strain CSLG02.It showed reality helpful value in the study of regional grape juice drink.

home grape juice drink；dominant yeast；Saccharomyces cerevisiae；characteristic

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.13.036

常熟理工學(xué)院大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品項(xiàng)目（2014年）；常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院第二批SRP資助項(xiàng)目（201308）；大學(xué)生實(shí)踐創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（2015109）

姚璐曄（1983—），女（漢），實(shí)驗(yàn)師，碩士研究生，研究方向：生物工程發(fā)酵。

2015-06-23