賈　慧，王志清，魏　晶，董又銘，于志月, 李慧卿

(忻州師范學(xué)院化學(xué)系，山西　忻州　034000)

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科學(xué)實驗

β-乳球蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的光譜研究*

賈慧，王志清，魏晶，董又銘，于志月, 李慧卿

(忻州師范學(xué)院化學(xué)系，山西忻州034000)

在pH=7的緩沖溶液及室溫條件下，通過鹽酸胍、尿素對β-乳球蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。β-乳球蛋白在鹽酸胍溶液中的Cm為2.3 mol·L-1、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化能為14.051 kJ/(mol·L-1)。β-乳球蛋白可以結(jié)合與結(jié)合N-苯基-1-萘胺，結(jié)合該配體使蛋白在鹽酸胍中的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化能提高到17.443 kJ/(mol·L-1)。在尿素溶液中結(jié)合N-苯基-1-萘胺后的β-乳球蛋白，其穩(wěn)定化能也從14.250 kJ/(mol·L-1) 提高到17.736 kJ/(mol·L-1)，與蛋白在鹽酸胍溶液中的變化趨于一致。

N-苯基-1-萘胺；β-乳球蛋白；熒光光譜

β-乳球蛋白(β-LG)，它是一種分子量約18.4 kD的球形蛋白，由162個氨基酸殘基組成，單體由8條反平行的β帶組成的β桶裝結(jié)構(gòu)。它是乳清蛋白的主要組成部分，具有較強的結(jié)合脂溶性維生素、脂肪酸的能力及提高這些小分子在機體中的轉(zhuǎn)運效率； 在機體內(nèi)清除維生素A代謝物所形成的色素沉淀，抑制酪氨酸酶活性的能力；在體內(nèi)VE缺乏的情況下，它還能夠顯著增加肝臟中的還原型谷胱甘肽，有效提高細(xì)胞膜的抗氧化能力[1-3]。由于這些豐富的生物功能，使得其在化妝業(yè)、保健食品及醫(yī)藥等相關(guān)領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用前途。而所有這些性質(zhì)和功能是建立在β-乳球蛋白的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上的，因而對其構(gòu)象變化及結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的研究也一直是熱點。

本文通過光譜手段測定了β-乳球蛋白在尿素、鹽酸胍中遭受的構(gòu)象變化，并通過比較不同濃度下空蛋白和結(jié)合配體N-苯基-1-萘胺后蛋白的吉布斯自由能，獲得了二者的穩(wěn)定化能。

1　實驗部分

1.1試劑和儀器

N-苯基-1-萘胺，β-乳球蛋白(生物試劑)，美國 Sigma公

司；其他試劑均為分析純，購于天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，實驗用水均為二次蒸餾水。

F-4500熒光光度計，日本日立公司；UV-2550紫外可見分光光度計，日本島津公司；AL204電子天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司。

1.2光譜測定

熒光發(fā)射光譜實驗：在室溫下，使用1 cm熒光池，用F-4500熒光光度計測定，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為固定值10 nm。熒光發(fā)射光譜測定中激發(fā)波長Ex=280 nm,掃描范圍300～600 nm。

2　結(jié)果與討論

2.1鹽酸胍對β-LG構(gòu)象的影響

色氨酸殘基的熒光對環(huán)境的變化非常敏感，常常作為蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的指針。色氨酸熒光光譜的紅移通常被認(rèn)為是微環(huán)境極性增加的結(jié)果。通常認(rèn)為色氨酸處于疏水環(huán)境時最大發(fā)射波長λmax=331 nm，部分暴露于水中時λmax=341 nm，完全暴露于水中 時λmax=351 nm[4]。

圖1　鹽酸胍對β-LG最大發(fā)射峰位的影響(CLG=1×10-6 mol·L-1)

由圖1可以看出，在沒有出現(xiàn)鹽酸胍時，β-LG的色氨酸殘基熒光發(fā)射在332 nm附近，表明色氨酸殘基主要表現(xiàn)為埋在蛋白內(nèi)部；隨著鹽酸胍濃度的增加，其波長逐漸紅移。當(dāng)鹽酸胍濃度在2.3 mol·L-1附近時，出現(xiàn)明顯的突躍點，當(dāng)鹽酸胍濃度大于4.3 mol·L-1時，其波長紅移至354 nm處，顯示色氨酸完全暴露于水，蛋白二級結(jié)構(gòu)已經(jīng)瓦解。

根據(jù)“兩態(tài)模型”[5-7]，變性過程中β-LG只以未變性狀態(tài)N(nature)或完全變性狀態(tài)D(denature)存在。有如下平衡存在：

(1)

YN+YD=1

(2)

YN，YD分別為未變性以及變性的摩爾分?jǐn)?shù)。

F=YN·FN+YD·FD

(3)

FN，F(xiàn)D分別代表未變性以及完全變性時β-LG的熒光強度，F(xiàn)為任一實驗點測量的熒光強度。

按照式(3)計算各實驗點變性百分?jǐn)?shù)，并作圖。

圖2　鹽酸胍對β-LG構(gòu)象穩(wěn)定性的影響(CLG=1×10-6 mol·L-1)

如圖2所示：起始時β-LG的變性較不明顯，當(dāng)鹽酸胍濃度大于4 mol·L-1時β-LG完全變性。

由式(2)、(3)可得到式(4)、(5)：

YD=(F-FN)/(FD-FN)

(4)

YN=(FD-F)/(FD-FN)

(5)

(6)

(7)

根據(jù)式(7)可求出各點變性自由能ΔGD。

(8)

按照式(7)、(8)計算每個實驗點的吉布斯自由能ΔGD。

圖3　鹽酸胍對蛋白構(gòu)象吉布斯自由能的影響

2.2AN結(jié)合對β-LG構(gòu)象的影響

2.2.1β-LG與AN的結(jié)合

在β-LG溶液中逐漸滴加AN，結(jié)果發(fā)現(xiàn)β-LG熒光強度隨著AN增加而逐漸減弱；反之，在AN 溶液中逐漸滴加β-LG，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AN的發(fā)射峰從440紫移至420 nm，熒光強度也逐漸增強，如圖4所示。從滴定曲線(圖5)可看出，當(dāng)兩者比例在1:1附近，AN的熒光強度增強變緩，從而推斷，兩者間形成1:1復(fù)合物。

圖4　不同濃度β-LG中AN的熒光變化

圖5　β-LG對AN的滴定曲線

2.2.2與AN的結(jié)合的β-LG在鹽酸胍中的構(gòu)象變化

在β-LG-AN復(fù)合物(CLG:CAN=1:1)溶液中逐漸加入鹽酸胍，發(fā)現(xiàn)蛋白的最大發(fā)射波長也逐漸紅移，變化趨勢如圖6所示。

圖6　鹽酸胍濃度對β-LG-AN中蛋白發(fā)射波長的影響(CLG=1×10-6 mol·L-1，CAN=1×10-6 mol·L-1)

按照式(3)把圖6轉(zhuǎn)化為變性曲線，并計算不同濃度鹽酸胍下蛋白的吉布斯自由能如圖7所示。

圖7　鹽酸胍對β-LG-AN復(fù)合物中蛋白吉布斯自由能的影響

2.3尿素對β-LG構(gòu)象的影響

在尿素中比較 β-LG與 β-LG-AN的變性曲線，可以看出：類似于在鹽酸胍中，蛋白結(jié)合小分子AN后，Cm從4.3 提高到5.0 mol·L-1附近，蛋白穩(wěn)定性明顯增強。通過計算二者在不同尿濃度下的吉布斯自由能，推出空蛋白β-LG與 結(jié)合配體后的β-LG-AN穩(wěn)定化能分別為14.250和17.736 kJ/(mol·L-1)，與鹽酸胍溶液中推出的結(jié)果基本一致。

圖8　β-LG (a)與 β-LG-AN (b) 在鹽酸胍中的變性曲線(A)和不同濃度鹽酸胍下兩者的吉布斯自由能圖 (B)

3　結(jié)　論

[1]MCKENZIE H A, SAWYER W H. Effect of pH on β-Lactoglobulins[J]. Nature, 1967, 214：1101-1104.

[2]STOJADINOVIC M, RADOSAVLJEVIC J, OGNJENOVIC J, et al. Binding affinity between dietary polyphenols and β-lactoglobulin negatively correlates with the protein susceptibility to digestion and total antioxidant activity of complexes formed[J]. Food Chemistry, 2013, 136:1263-1271.

[3]SHI L, PALLEROS D R, FINK A L. Protein conformational changes induced by 1,1’-bis(4-anilino-5-naphthalenesulfonic acid): preferential binding to the molten globule of DnaK[J]. Biochemistry, 1994, 33(24):7536-7546.

[4]馬林,何維仁,黃愛民,等. 絲素蛋白在甲醇-水混合溶劑中構(gòu)象變化的光譜學(xué)研究[J]. 光譜 學(xué)與光譜分析,2010,30(11):3047-3051.

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[7]郭曉娜,姚惠源.光譜法研究變性劑對苦蕎麥蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響[J]. 光譜學(xué)與光譜分析,2011,31(6):1611-1614.

Spectra Study on the Stability of β-lactoglobulin*

JIA Hui， WANG Zhi-qing， WEI Jing， DONG You-ming， YU Zhi-yue， LI Hui-qing

(Chemistry Department, Xinzhou Teachers’ University, Shanxi Xinzhou 034000, China)

The stability of β-lactoglobulin (β-LG)in guanidine hydrochloride(GuHCl) acid or nrea solution was investigated by fluorescence spectroscopy at room temperature in pH 7.0 phosphate buffer. The denaturation transition midpoint of β-LG in GuHCl (Cm) was 2.3 mol·L-1, the free energy of stabilization was 14.051 kJ/(mol·L-1). β-LG can binding N-phenyl-1-naphthylamine (AN). Thus, the free energy of stabilization was increased to 17.443 kJ/(mol·L-1), and it was consistent with the free energies of stabilization of the β-LG (14.250 kJ/(mol·L-1)) and β-LG-AN complex (17.736 kJ/(mol·L-1)) obtained from urea.

β-lactoglobulin；N-phenyl-1-naphthylamine；the free energy of stabilization

山西省自然基金項目(No:2014011014-2)；山西省高等學(xué)校大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項目(No:2014393)；忻州師院化學(xué)化工創(chuàng)新基地項目。

李慧卿(1972-)，女，博士，副教授，主要從事生物分子研究。

O657

A

1001-9677(2016)01-0048-03