趙松峰，胡靈，杜麗蘋

（鄭州大學附屬洛陽中心醫(yī)院 血管外科，河南 洛陽 471009）

論著

M i c roRN A-599對靜脈曲張中血管平滑肌細胞去分化的影響及其機制研究

趙松峰，胡靈，杜麗蘋

（鄭州大學附屬洛陽中心醫(yī)院 血管外科，河南 洛陽 471009）

目的研究m i c ro R NA-599（m i R-599）在曲張靜脈中的表達，探討m i R-599是否通過下調血小板源性生長因子B（P D G F-BB），抑制曲張靜脈中血管平滑肌細胞（V S MC s）去分化。方法收集大隱靜脈移植術患者中曲張靜脈和正常靜脈標本，通過實時熒光定量聚合酶鏈反應（q R T-P C R）檢測42例曲張靜脈組織及39例正常靜脈組織中m i R-599、m i R-200、m i R-145、m i R-146b、m i R-155的表達；W e s t e r n blot檢測兩組標本中S M-a c t in、S M-22、S M-MC H、O P N的表達；在細胞實驗中，轉染m i R-599m i m i c和m i R-N C至離體培養(yǎng)的V S MC s中，W e s t e r n blot檢測V S MC s中S M-a c t in、S M-22、S M-MC H、O P N、P D G F-BB的表達，噻唑藍法測細胞增殖、劃痕實驗觀察細胞遷移，利用熒光素酶試驗驗證P D G F是m i R-599的靶基因。結果相比于正常靜脈組織，m i R-599在曲張靜脈中的表達降低（F=73.012，P=0.001）。兩組m i R-146b、m i R-200、m i R-30、m i R-155的表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義。相比于正常靜脈組織，曲張靜脈組織中S M-a c t in、S M-22、S M-MC H的表達降低（P＜0.05），O P N的表達升高（F=56.414，P=0.009）；在細胞實驗中，相比于對照組，m i R-599組V S MC s中S M-a c t in、S M-22、S M-MC H的表達升高（P＜0.05），O P N的表達降低（F=27.353，P=0.022），細胞增殖減少（F= 37.824，P=0.016），遷移減少（F=69.365，P=0.001），P D G F表達量減少（F=55.345，P=0.004）。熒光素酶試驗結果顯示，m i R-599能夠降低P D G F-3'-U T R質粒的熒光素活性（F=21.429，P=0.036）。結論在曲張靜脈組織中，m i R-599低表達。在V S MC s中，m i R-599可以通過下調P D G F-BB而抑制V S MC s去分化。

下肢靜脈曲張；m i c ro R NA-599；血管平滑肌細胞；細胞分化

下肢靜脈曲張是指下肢淺靜脈系統(tǒng)過分迂曲、伸長和擴張，一般發(fā)生在大隱靜脈，是血管外科常見病之一，其發(fā)病機制尚不清楚［1-2］。相關文獻報道顯示，靜脈曲張的病理生理基礎為血管重塑，其中血管平滑肌細胞（v asc u lar smooth m u scle cells，V S MC s）去分化在血管重塑過程中發(fā)揮重要作用［3-6］。

M icro R N A（以下簡稱mi R）是一類長度為18～25個核苷酸的普遍存在于細胞中的非編碼R N A。mi R為單鏈R N A分子，來源于內源轉錄本，主要作用于靶基因3'非翻譯區(qū)（3’-u ntranslated re g ions，3’U T R），引起靶m R N A的降解或抑制其翻譯，從而調節(jié)靶基因的表達［7］。研究證實，mi R還可以通過與靶基因的5’-U T R或開放讀框序列結合發(fā)揮同樣的作用［8］。大量研究所證實，mi R在血管平滑肌細胞去分化中具有重要的調控作用，其中以mi R-599、mi R-200、mi R N A-145、mi R-146b、mi R-155的研究最為熱門［9-12］。但是上述5個mi R在靜脈曲張中的作用尚未闡明。

血小板源性生長因子B（platelet deri v ed g ro w th f actor-BB，P D G F-BB）是目前公認的，可以誘導V S CM s表型轉化的一種生長因子［13］。M A R T I N［14-15］和W A G NE R等［16］的研究發(fā)現，瑞舒伐他汀可以通過抑制P D G F-BB的表達從而抑制V S MC s的表型轉化。

本實驗擬通過實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time q u antitati v e polymerase chain reaction，q R TPC R）檢測靜脈曲張組織及對應正常靜脈組織中mi R-599、mi R-200、mi R-145、mi R-146b、mi R-155的表達，篩選出與靜脈曲張相關的mi R N A，并通過細胞離體實驗進一步驗證mi R-599是否可以抑制V S MC s去分化及其作用機制是否為通過下調P D G F-BB。

1　資料與方法

1.1一般資料

選取2012年8月-2015年6月在鄭州大學附屬洛陽中心醫(yī)院行大隱靜脈移植術患者曲張靜脈（42例）和正常靜脈標本（39例）。其中，男性23例，女性19例；年齡45～76歲，平均（54.0±5.6）歲，樣品采集后立即置入-80℃冰箱冷凍保存，并經病理診斷證實。本研究中患者均簽署知情同意書，并由鄭州大學附屬洛陽中心醫(yī)院倫理委員會審核通過。

1.2方法

1.2.1實驗試劑人血管平滑肌細胞T/G H A-V S MC（上海鈺博生物科技有限公司），達爾伯克必需基本培養(yǎng)基 （d u lbecco's minim u messential medi u m，D M E M）胰蛋白酶（美國S i g ma公司），胎牛血清（美國G ibco公司），R N A提取試劑（美國I n v itro g en公司），Ta K a R a逆轉錄試劑盒（大連寶生生物工程有限公司），限制性內切酶B am HⅠ、X hoⅠ、T4 DN A連接酶，無內毒素質粒小、大提取試劑盒，S YB R G reen熒光染料試劑盒（瑞士R oche公司），脂質體2000（上海英駿公司），4，6-聯脒-2-苯基吲哚（瑞士R cohe公司），噻唑藍［3-（4，5-dimethyl-2-thia z olyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetra z oli u m bromide，M TT］（美國 Em resco公司），兔或鼠抗人S M-actin、S M-22、S M-MC H、O P N、P D G F-BB、肌動蛋白β多克隆抗體（英國A b cam公司），辣根過氧化酶標記的山羊抗兔或者抗鼠二抗、異硫氰酸熒光素（f l u orescein isothiocyanate，F I T C）、紅色異硫氰酸熒光素（red f l u orescein isothiocyanate，F R I T C）標記的山羊抗兔免疫球蛋白G（美國J ac k son公司），W estern blot檢測相關試劑（江蘇碧云天生物技術研究所）。

1.2.2q R T-P C R反應檢測基因表達提取曲張靜脈和正常靜脈組織中總R N A，將提取的R N A進行逆轉錄成cDN A，反應體系為20μl，反應條件為：16℃預變性30min，45℃變性30min，85℃退火5min。運用S YB R G reen法檢測mi R-599、mi R-200、mi R-145、mi R-146b、mi R-155的表達，反應條件為：94℃預變性15 min，94℃變性30s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸8min。每組樣品重復3次，實驗重復3次，統(tǒng)計分析曲張靜脈和正常靜脈組織中mi R-599、mi R-200、mi R-145、mi R-146b、mi R-155的表達。其次，在質粒轉染后將V S MC s分成空白對照組、過表達mi R-599組和無效處理組3組，提取總R N A，反轉錄cDN A，用S YB R G reen法，用 A B I P R I S M 7500自動熒光 PC R儀進行q R T-PC R反應檢查mi R-599m R N A表達水平，每組樣品重復3次，實驗重復3次，設定閾值，測定平均的C t值。

1.2.3W e s t e r n blot檢測蛋白表達量提取曲張靜脈和正常靜脈組織中總蛋白，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，B C A）法定量蛋白，聚丙烯酰胺凝膠電泳膠每孔加入30μl樣品，70 V 30min進行蛋白濃聚，110 V 2 h進行凝膠電泳，并用孔徑0.45μm聚偏氟乙烯膜250m A 100min進行轉膜。轉膜后經常溫下三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液（tris b uff ered saline and t w een 20，T B S T）洗膜3次、封閉1 h后，以1∶1 000濃度加入兔（鼠）抗人S M-actin一抗（或抗S M-22、S M-M H C、O P N、P D G F-BB、肌動蛋白β一抗），4℃孵育過夜，常溫下T B S T洗膜3次，辣根過氧化物酶標記羊抗兔（鼠）二抗孵育后增強化學發(fā)光法（enhanced chemil u minescence，E C L）檢測?？逻_膠片暗室顯影，Q u antity one軟件分析。其次，在質粒轉染后將V S MC s分成空白對照組、過表達mi R-599組和無效處理組3組，提取總蛋白，檢測各組中S M-actin、S M-22、S M-M H C、O P N、P D G F-BB、肌動蛋白β的表達。

1.2.4轉染細胞株mi R-599-mimic由上海吉瑪公司設計合成，mi R-599-mimic序列為，正向引物：5'-G UU G U G U C A G UUUVU C AAA C-3'，反向引物：5'-G U UU G A U AAA C U G A C A C AA C-3'。對照序列為，正向引物：5'-G UU G U G U C A G A UUVU C AA U C-3'，反向引物：5'-G A UU G A U AA U C U G A C A C AA C-3'將V S MC細胞接種至6孔板，生長至50%～70%密度時，以脂質體2 000分別轉染mi R-599 mimic或mimic-對照各100 pmol 24 h后，提取總R N A后PC R鑒定轉染效率，進行后續(xù)實驗。

1.2.5M TT法測V S MC s增殖在質粒轉染后將V S MC s分成空白對照組、過表達mi R-599組和無效處理組3組，每組設3個復孔，2個不加細胞的空白孔。細胞在各自條件下培養(yǎng)24、48和72 h。培養(yǎng)結束后，每孔加入M TT液20μl，37℃下繼續(xù)孵育4～6 h，小心棄去培養(yǎng)上清液，每孔加入150μl改良Ea g le培養(yǎng)基溶液，震蕩10min，選擇492 nm波長在酶聯免疫檢測儀測定各孔吸光度值并記錄。以時間為橫軸，吸光值為縱軸繪制各組V S MC s細胞生長曲線。

1.2.6細胞劃痕實驗測V S MC s遷移在質粒轉染后將V S MC s分成空白對照組、過表達mi R-599組和無效處理組3組。1.8mmol/L羥基脲作用12 h抑制細胞增殖，100μl黃色槍頭垂直孔板制造細胞劃痕，吸掉細胞培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate b uff er saline，P B S）沖洗孔板3次。在相應的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)細胞，拍照記錄0、12、24、48和72 h圖片，用I ma g e pro pl u s 6.0軟件分析計算細胞遷移面積，并以遷移面積和原劃痕面積比值來表示各組V S MC s遷移的多少。

1.2.7細胞免疫熒光法檢測各組中S M-a c t in在細胞中的分布及表達在質粒轉染后將V S MC s分成空白對照組、過表達mi R-599組和無效處理組3組。P B S洗3遍，用4%多聚甲醛固定，0.25%Triton X 100穿破細胞膜，山羊血清室溫封閉1 h，加入稀釋250倍的anti-S M A抗體，4℃過夜，P B S清洗3遍，加入結合有異硫氰酸熒光素的山羊抗兔二抗，室溫孵育1 h，P B S清洗3遍，熒光顯微鏡拍照后圖片用I ma g e pro pl u s 6.0分析。

1.2.8熒光素酶試驗設計合成P D G F-BB-3'-U T R的序列及突變序列，以P D G F-BB質粒為載體，分別構建能夠表達熒光素酶的包含P D G F-BB-3'-U T R 和P D G F-BB-3'-U T R突變序列的質粒，然后將V S MC s按每孔1×105接種至24孔板，24 h后以脂質體2 000共轉染200 n g包含P D G F-BB-3'-U T R 或P D G F-BB-3'-U T R突變序列的熒光素酶質粒和80 n g海腎熒光質粒，以及60 pmol mi R-599-mimic或對照，48 h后用熒光檢測儀檢測熒光強度，海腎熒光作為內參照，每組實驗重復3次。

1.3統(tǒng)計學方法

采用S P SS 20.0統(tǒng)計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組比較用單因素方差分析，兩兩比較用LS D法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1V SMC去分化相關的m i RN A s和蛋白質在曲張靜脈和正常靜脈組織中的表達

q R T-PC R反應檢測曲張靜脈和正常靜脈組織中mi R-599、mi R-200、mi R-145、mi R-146b、mi R-155的表達，結果發(fā)現，曲張靜脈組織中mi R-599的表達低于正常靜脈組織（F=73.012，P=0.001）（見圖1A）。兩組m i R-200、mi R-145、mi R-146b、mi R-155的表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義。W estern blot檢測曲張靜脈和正常靜脈組織中S M-actin、S M-22、S M-MC H、O P N的表達，相比對正常靜脈組織，曲張靜脈組織中S M-22、S M-MC H表達減少，O P N表達增多（F=56.414，P=0.009）；兩組S M-actin表達比較，差異無統(tǒng)計學意義（見圖1B）。

2.2m i R-599對V SMCs增殖和遷移的影響

mi R-599minic轉染V S MC s后，R eal-time q PC R反應檢測發(fā)現，過表達mi R-599組中mi R-599的表達較對照組和空質粒升高（F=65.753，P=0.001）（見圖2A）。12 h時3組V S MC s的增殖比較，差異無統(tǒng)計學意義；干預24 h后，相比于對照組和空質粒組，mi R-599組中V S MC s增殖減少（F=37.824，P=0.0161）（見圖2B）。干預48 h后，相比于對照組和空質粒組，mi R-599組中V S MC s遷移減少，差異有統(tǒng)計學意義（F=69.365，P=0.001）（見圖2C）。

2.3m i R-599對V SMCs中SM-a c t i n、SM-22、SM-MC H、OPN、PD GF-BB表達的影響

圖1　曲張靜脈和正常靜脈組織中V SMC去分化相關的m i RN A s以及蛋白質表達

圖2　M i R-599抑制V SMCs的增殖和遷移

mi R-599mimic轉染V S MC s后，W estern blot檢測發(fā)現，相比于對照組和空質粒組，mi R-599組V S MC s中S M-22、S M-M H C表達增多，O P N表達減少（F=27.353，P=0.022）。3組S M-actin表達比較，差異無統(tǒng)計學意義。見圖3。

2.4m i R-599對V SMCs形態(tài)的影響

M i R-599mimic轉染V S MC s后，免疫熒光結果顯示，mi R-599組V S MC s形態(tài)細長，呈典型的血管平滑肌細胞形態(tài)，對照組和空質粒組中平滑肌細變圓變寬，失去原有的細胞形態(tài)。見圖4。

2.5m i R-599通過識別3'-UTR抑制PD GF-BB的表達

分別構建包含P D G F-BB-3'-U T R和其突變序列的熒光素酶質粒（見圖5A），與mi R-599-mimic對照共轉V S MC s細胞，培養(yǎng)24 h后，檢測各組細胞熒光素酶活性，結果顯示，mi R-599-mimic+W T-P D G FBB-3'-U T R組熒光素酶活性低于空質粒+W TP D G F-BB-3'-U T R組（F=21.429，P=0.036）（見圖5B）。W estern blot檢測結果顯示，相比于對照組和空質粒組，mi R-599組V S MC s中P D G F-BB表達降低（F= 55.345，P=0.004）（見圖5C）。

圖3　M i R-599對V SMCs中細胞分化狀態(tài)標志蛋白表達的影響

圖4　細胞免疫熒光法觀察各組的細胞形態(tài) （×200）

圖5　m i R-599通過識別3'-UTR抑制PD GF-BB的表達

3　討論

在不同的外界因素影響下，V S MC s處于不同的分化狀態(tài)，具有很強的可塑性。在正常血管膜中的V S MC s是一種高分化的細胞，細胞形態(tài)呈梭形，主要起維持血管形狀和收縮血管的作用，具有低增殖、低遷移、低蛋白分泌等特征［17-18］。當發(fā)生動脈粥樣硬化、靜脈擴張、動脈瘤等血管疾病時，V S MC s可以去分化為未分化成熟的細胞，形態(tài)變圓，細胞收縮性能下降，表現出高增殖、高遷移、高蛋白分泌等特征［19-22］。

靜脈曲張時靜脈管腔明顯擴張，局部管壁厚薄不均，管壁硬度增加而順應性減低，目前認為血管重塑是靜脈曲張的基本病理生理過程［23］。V S MC s去分化作為血管重塑的關鍵和始動環(huán)節(jié)，在靜脈曲張的發(fā)生、發(fā)展發(fā)揮重要的調節(jié)作用。J I A N G等［21］發(fā)現在靜脈曲張發(fā)生時，位于靜脈管壁的收縮型V S MC s去分化為合成型細胞。本實驗結果顯示，靜脈曲張組織中S M-22、S M-MC H等V S MC s分化狀態(tài)標志性蛋白表達減少，而合成型細胞標志蛋白O P N表達增多，同樣證實靜脈曲張的病理機制中有V S MC s去分化的參與。

mi R是一類進化上高度保守的非編碼小分子單鏈R N A，越來越多的證據顯示，mi R參與對細胞增殖、遷移和細胞表型的調控［24］。目前經證實的與V S MC s去分化相關的mi R主要包括：mi R-599、mi R-200、mi R-145、mi R-146b、mi R-155、mi R-146a、mi R-133、mi R-221、mi R-222、mi R-21和mi R-143［13］。在大鼠V S MC s離體實驗中，mi R-143和mi R-145表達量較高，加入P D G F-BB后，這兩種mi R表達量驟減。在用球囊損傷血管后，mi R-143和mi R-145基因敲除的小鼠V S MC s分化受阻，說明上述mi R在血管損傷后的修復過程中發(fā)揮重要作用［25］。C H EN G等［26］的實驗進一步探明mi R-145是通過抑制K L F5的表達，從而減少球囊損傷后血管中V S MC s的增殖和遷移。最近X I E等［9］的研究在細胞和動物兩個層面證實mi R-599是通過靶向結合T G F-βⅡ受體基因，從而抑制V S MC s的增殖。本實驗結果顯示，mi R-599在靜脈曲張組織中表達減少，并進一步在離體實驗中證實mi R-599可以抑制V S MC s的增殖、遷移及去分化。

P D G F-BB是最早發(fā)現的一種可以促進V S MC s去分化的因素，是一種較強的促有絲分裂因子，具有促增殖和遷移的生物活性，能引起V S MC s的合成及分泌功能增強［27］。P D G F-BB通過誘導特定DN A的表達或沉默，最終導致V S MC s去分化。分化成熟的V S MC合成和分泌P D G F-BB的能力很弱。目前已知P D G F-BB主要通過M KK6/p38和M A P K M E K1/E R K兩條途徑發(fā)揮促V S MC s去分化的作用［28］。筆者用熒光素酶實驗進一步發(fā)現，mi R-599是通過與P D G FBB-3'-U T R靶向結合，減少P D G F-BB的表達，從而發(fā)揮其抑制V S MC s去分化的作用。

本實驗通過q R T-PC R反應檢測靜脈曲張組織及正常靜脈組織中mi R-599、mi R-200、mi R-145、mi R-146b、mi R-155的表達，發(fā)現mi R-599在靜脈曲張組織中表達減少，同時發(fā)現靜脈曲張組織中P D G F-BB的表達增加，V S MC s分化表型的標志性蛋白表達減少。在離體實驗中證實mi R-599可以抑制V S MC s增殖、遷移、去分化，并進一步通過螢光素酶實驗發(fā)現其機制是通過靶向抑制P D G F-BB的表達，為闡明靜脈曲張的發(fā)病機制提供新的思路。

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（童穎丹 編輯）

M icroRNA-599 inhibits vascular smooth muscle cell dedifferentiation and its mechanism in varicose veins

Song-feng Zhao，Ling Hu，Li-ping Du
（Department of Vascular Surgery，Luoyang Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University，Luoyang，Henan 471009，China）

Objective To verify whether microRNA-599（miR-599）could inhibit vascular smooth muscle cell（VSMC）dedifferentiation by targeting platelet-derived growth factor-BB（PDGF-BB）in varicose veins. M ethods Varicose veins and normal samples were collected from patients undergoing great saphenous vein transplantation surgery.qRT-PCR was used to test the expressions of miR-599，miR-200，miR-145，miR-146b and miR-155 in the varicose veins.Western blot was used to test the expressions of SM-actin，SM-22，SM-MCH and OPN.For in vitro experiment，after miR-599 was transfected into VSMCs，MTT was used to investigate the proliferation ability of VSMCs，wound healing was employed to test the migratory ability of VSMCs，Western blot was used to investigate the expressions of SM-actin，SM-22，SM-MHC，OPN and PDGF-BB in VSMCs.Luciferase assay was used to confirm whether PDGF-3'-UTR was the target gene of miR-599.Results Compared with the healthy control tissue，the expressions of miR-599，SM-actin，SM-22and SM-MHC in the varicose veins were significantly decreased（P＜0.05）；meanwhile the expression of OPN increased（P＜0.01）.The result of the in vitro experiment showed that compared with the control group，the expressions of SM-actin，SM-22 and SM-MHC were increased in the miR-599 group（P＜0.05），and the expression of OPN and PDGF-BB decreased（P＜0.05）.The luciferase activity of the PDGF-3'-UTR plasmid was suppressed by miR-599（P＜0.05）.Conclusions In varicose veins，the expression of miR-599 decreases. miR-599 inhibits VSMC dedifferentiation by targeting PDGF-3'-UTR.

varicose vein；miR-599；VSMC；dedifferentiation

R 654.4

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.15.017

1005-8982（2016）15-0091-07

2016-01-20