易高，潘嘉宇，林純意，劉兆宇

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院，廣州510700)

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呼吸道合胞體病毒F蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析及其B細(xì)胞表位預(yù)測

易高，潘嘉宇，林純意，劉兆宇

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院，廣州510700)

目的分析呼吸道合胞體病毒(RSV)F蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)并預(yù)測其B細(xì)胞表位。方法分析RSV F蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，得出RSV F蛋白中可能出現(xiàn)的信號(hào)肽序列以及位置?；谕唇５姆椒A(yù)測RSV F蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，以三級(jí)結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)預(yù)測F蛋白中可能存在的構(gòu)象B表位和線性B表位。結(jié)果F蛋白的574個(gè)編碼氨基酸中占主要比例的是絲氨酸(10.45%)、亮氨酸(10.28%)、天冬酰胺(8.71%)和蘇氨酸(8.71%)；可能有7個(gè)蛋白結(jié)合位點(diǎn)、6個(gè)產(chǎn)生螺旋結(jié)構(gòu)的區(qū)域；可能存在兩個(gè)主要的β-折疊片蛋白；F蛋白N-末端第1～25區(qū)段為信號(hào)肽。RSV F蛋白頭部主要由β-折疊片、無規(guī)則卷曲和轉(zhuǎn)角組成，尾部主要由兩段長的α-螺旋組成。RSV F蛋白中可能存在4個(gè)構(gòu)象B表位、8個(gè)線性B表位。結(jié)論F蛋白編碼氨基酸主要為絲氨酸和亮氨酸，可能有7個(gè)蛋白結(jié)合位點(diǎn)、6個(gè)產(chǎn)生螺旋結(jié)構(gòu)的區(qū)域、兩個(gè)主要的β-折疊片蛋白。 RSV F蛋白中可能存在4個(gè)構(gòu)象B表位、8個(gè)線性B表位。

呼吸道合胞體病毒；F蛋白；蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)；B細(xì)胞表位

呼吸道合胞體病毒(RSV)是一種常見嬰幼兒氣道感染和炎癥的病原體[1,2]。研究發(fā)現(xiàn)，RSV感染是誘發(fā)哮喘的危險(xiǎn)因素，其致病性遠(yuǎn)超其他微生物病原體[3]。研究和開發(fā)RSV疫苗、抗體藥物以及檢測試劑盒具有重要的臨床意義。RSV屬于副黏液病毒科，是一種不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA病毒。RSV基因組大小約為15 kb，共編碼10種不同的病毒蛋白，其中NS1蛋白、NS2蛋白和SH蛋白為RSV非結(jié)構(gòu)蛋白，而G蛋白、F蛋白、M1蛋白、M2蛋白、P蛋白、L蛋白、N蛋白等7種蛋白為RSV結(jié)構(gòu)蛋白[4]。G蛋白和F蛋白是RSV的兩個(gè)表面糖蛋白，能促進(jìn)機(jī)體保護(hù)性抗體的表達(dá)[5,6]。G蛋白又稱為附著蛋白，在病毒吸附到宿主細(xì)胞表面的過程中發(fā)揮作用，而F蛋白是一種融合性包膜糖蛋白，在病毒包膜與宿主細(xì)胞膜融合過程中發(fā)揮作用[7,8]。不同RSV亞型之間G蛋白變異較大，而F蛋白相對比較保守，不同亞型之間同源性較高，針對F蛋白產(chǎn)生的抗體在不同亞型之間具有交叉保護(hù)作用，因此一般以F蛋白作為開發(fā)疫苗、診斷試劑的研究對象[9]。本研究通過分析RSV F蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，預(yù)測其可能的B細(xì)胞表位，旨在為RSV疫苗、治療性抗體及診斷檢測試劑盒的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1RSV F蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

1.1．1RSV F蛋白氨基酸序列從GenBank中選取近年來在越南南部地區(qū)分離的RSV基因組序列(登錄號(hào)：KJ939966)為研究對象[10]，獲得RSV F蛋白編碼基因及氨基酸序列，F(xiàn)蛋白基因位于5651、7375，核苷酸長度為1 725 bp，氨基酸長度574 aa，氨基酸序列為MELPILNTNAITTILAAVTLCFTSSQ-NITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNI-KENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQS-TPAANSRARRELPRFMNYTLNNTKNTNVTLSKKRKR-RFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALL-STNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNK-QSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPV-STYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQ-SYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLC-TTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETC-KVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNIDIFNPKYDCKI-MTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIK-TFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLY-VKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFI-RKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGL-LLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN。

1.1.2RSV F蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析通過蛋白結(jié)構(gòu)在線預(yù)測網(wǎng)站Predict Protein Server(http://www.predictprotein.org/)分析F蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，對F蛋白的氨基酸組成以及蛋白序列中可能存在的蛋白結(jié)合區(qū)域、α-螺旋區(qū)域、β-折疊區(qū)以及其他不規(guī)則區(qū)域進(jìn)行分析，同時(shí)預(yù)測蛋白結(jié)構(gòu)中可能的暴露區(qū)域和隱藏區(qū)域。

1.1.3RSV F蛋白的信號(hào)肽分析通過在線服務(wù)器上的信號(hào)肽預(yù)測軟件SignalIP 3.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/)，采用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法(NN)和隱馬爾可夫模型(HMM)分析RSV F蛋白中可能出現(xiàn)的信號(hào)肽序列以及位置。

1.2RSV F蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)及B細(xì)胞抗原表位的預(yù)測基于同源建模的方法，通過在線服務(wù)器軟件SWISS-MODEL(http://www.swissmodel.expasy.org/)預(yù)測RSV F蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，并通過PyMOL Viewer分析并輸出預(yù)測的三級(jí)結(jié)構(gòu)。綜合比較分析上述方法，以RSV F蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，采用Ellipro(http://tools.immuneepitope.org/ellipro/)在線服務(wù)器程序預(yù)測F蛋白中可能存在的構(gòu)象B表位，得分大于0.5(軟件默認(rèn)值)則預(yù)測為優(yōu)勢構(gòu)象B表位。選取親水性強(qiáng)、表面可及性好以及抗原性高的區(qū)域作為線性B細(xì)胞表位預(yù)測的備選區(qū)域，并且排除序列中的N-末端的信號(hào)肽序列、C-末端跨膜區(qū)及位于病毒囊膜內(nèi)部的序列。Ellipro服務(wù)器軟件預(yù)測F蛋白中可能存在的線性B表位，得分大于0.5(軟件默認(rèn)值)則預(yù)測為優(yōu)勢線性B表位。

2　結(jié)果

2.1RSV F蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)F蛋白的574個(gè)編碼氨基酸中占主要比例的是絲氨酸(S,10.45%)、亮氨酸(L,10.28%)、天冬酰胺(N,8.71%)和蘇氨酸(T,8.71%)，見圖1?？赡艿鞍捉Y(jié)合位點(diǎn)有7個(gè)，主要位于蛋白N-末端第100～135、260～350、400～430區(qū)段；可能產(chǎn)生螺旋結(jié)構(gòu)的區(qū)域有6個(gè)，分別為N-末端第29～48、82～96、134～233、377～385和490～550區(qū)段；可能存在兩個(gè)主要的β-折疊片，分別位于N-末端第275～374和395～475區(qū)段；此外，在蛋白中還可能包含有1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域(N-末端第525～545區(qū)段)和1個(gè)小的無序結(jié)構(gòu)(N-末端第126～128區(qū)段)。整個(gè)蛋白暴露區(qū)域和隱藏區(qū)域均勻相間分布，無大片段暴露區(qū)域或者隱藏區(qū)域，見圖2。

2.2RSV F蛋白信號(hào)肽RSV F蛋白的信號(hào)肽預(yù)測結(jié)果見圖3；NN(圖3A)和HMM(圖3B)結(jié)果表明F蛋白N-末端第1～25區(qū)段為信號(hào)肽。

2.3RSV F蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)、B表位根據(jù)SWISS-MODEL同源建模結(jié)果表明RSV F蛋白分為較大的頭部和細(xì)長的尾部組成，頭部主要由β-折疊片、無規(guī)則卷曲和轉(zhuǎn)角組成(暴露于病毒囊膜外，容易形成抗原表位)，而尾部主要由兩段長的α-螺旋組成，并且包括跨膜區(qū)(鑲嵌于病毒囊膜內(nèi)部，難以形成抗原表位予以排除)。經(jīng)過Ellipro預(yù)測分析表明RSV F蛋白中可能存在4個(gè)構(gòu)象表位：表位①由N-末端第61～108、110～112、198～225、227～228、231、234～235、291～295區(qū)段組成，該表位的得分為0.702；表位②由N-末端第114～133、141、146區(qū)段組成，表位得分為0.678；表位③由N-末端第421、423～435、444～449、451、453～454、456、458～461區(qū)段組成，表位得分為0.609；表位④由N-末端第264～269區(qū)段組成，表位得分為0.533，見圖4。F蛋白存在8個(gè)潛在線性B表位，分別位于N-末端第61～134、198～228、178～186、418～435,152～166,291～295、264～269和444～464區(qū)段，各個(gè)表位的預(yù)測得分分別為：0.728、0.721、0.649、0.621、0.618、0.569、0.533、0.515。

圖1　RSV F蛋白氨基酸組成

圖2　RSV F蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)

3　討論

RSV是引起嬰幼兒感染并誘發(fā)支氣管炎、肺炎的常見病原，幾乎所有的兒童都都有經(jīng)歷過一次或者多次感染，對人們的生活、工作造成了極大的威脅[11]。疫苗的研制和應(yīng)用是目前用于防治病毒感染最為有效的手段，表位疫苗由于制備簡單、效果突出、毒副作用小等特點(diǎn)而成為新型RSV疫苗研制的熱點(diǎn)和趨勢[12～14]?？乖瓋?yōu)勢表位的確定是疫苗研制、臨床應(yīng)用的基礎(chǔ)，其所采用的方法主要有結(jié)構(gòu)測定、免疫學(xué)鑒定和生物信息學(xué)等方法，前兩種由于比較耗時(shí)耗力，周期較長而在具體的表位疫苗研制開發(fā)中應(yīng)用較少，生物信息學(xué)方法簡單可靠而越來越受到研究者的信賴和關(guān)注[15～18]。基于疫苗開發(fā)、單克隆抗體制備以及快速檢測試劑盒的開發(fā)，采用生物信息學(xué)方法對RSV中的一些關(guān)鍵性蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)和B細(xì)胞表位的預(yù)測具有重要的意義。

注：圖A為NN對RSV F蛋白信號(hào)肽的預(yù)測結(jié)果；圖B為HMM對RSV F蛋白信號(hào)肽的預(yù)測結(jié)果。

圖3RSV F蛋白信號(hào)肽預(yù)測結(jié)果

圖4　RSV F蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)和構(gòu)象B細(xì)胞抗原表位。

F蛋白是RSV編碼的一種多功能膜蛋白，在病毒侵染融合過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[19]。相對于RSV編碼的其他膜蛋白而言，F(xiàn)蛋白在不同亞型之間保守性較高，針對F蛋白產(chǎn)生的抗體在不同的亞型之間具有交叉反應(yīng)，因此針對F蛋白開發(fā)相關(guān)的表位抗體在RSV的診療都具有較為重要的意義。B表位由線性表位和構(gòu)象表位組成，蛋白中α-螺旋、β-折疊等二級(jí)結(jié)構(gòu)由于結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定、鍵能高，并且通常處于蛋白質(zhì)分子的內(nèi)部而很難形成抗原表位與相應(yīng)的抗體分子結(jié)合；無規(guī)則卷曲、轉(zhuǎn)角等二級(jí)結(jié)構(gòu)由于結(jié)構(gòu)較為松散，容易發(fā)生構(gòu)象改變，并且通常處于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的表面而往往易于形成與抗體發(fā)生結(jié)合的穩(wěn)定位點(diǎn)，因此這些位置往往易于形成抗原B表位[20,21]。另外，蛋白的疏水性區(qū)域往往位于蛋白的內(nèi)部，而親水性區(qū)域位于蛋白表面。因此在蛋白質(zhì)潛在抗原表位預(yù)測過程中，必須要綜合考慮親水性、表面可及性、柔韌性等，避免疏水區(qū)域、α-螺旋和β折疊區(qū)域[22,23]。在本研究中，我們首先通過Predict Protein Server，結(jié)果顯示F蛋白中可能包含有6個(gè)產(chǎn)生螺旋、2個(gè)產(chǎn)生β折疊片的區(qū)域，另外還包含有7個(gè)可能的蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)(見圖2)，提示F蛋白可能參與多種蛋白或其它分子之間的相互作用并在RSV感染過程中發(fā)揮重要作用，可對F蛋白的相關(guān)功能位點(diǎn)進(jìn)行深入研究，進(jìn)一步的揭示RSV的侵染機(jī)制。在預(yù)測了F蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，我們又通過Swiss-model預(yù)測了F蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，并通過Ellipro Prediction對F蛋白中可能的線性B表位和構(gòu)象B表位進(jìn)行了預(yù)測，結(jié)果表明F蛋白中存在較多的線性B表位和構(gòu)象B表位(見圖4)，這可能與RSV F蛋白分子量較大、結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜相關(guān)。對于進(jìn)一步的確認(rèn)F蛋白的優(yōu)勢表位信息，需要通過體外試驗(yàn)、動(dòng)物模型等來進(jìn)行驗(yàn)證，本研究預(yù)測的相關(guān)線性表位、構(gòu)象表位將為下一步F蛋白抗原表位的確證、診療抗體的開發(fā)等提供一定的依據(jù)和參考。

基于上述研究結(jié)果，我們將在下一步的研究工作中通過構(gòu)建RSVF蛋白的表達(dá)載體，開發(fā)能對RSV進(jìn)行快速檢測的膠體金試劑盒。通過參考上述的B細(xì)胞表位預(yù)測結(jié)果，合成部分優(yōu)勢表位序列用于嘗試構(gòu)建和制備針對F蛋白的人源化單克隆抗體，為RSV感染的治療性抗體開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

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Secondary structure and prediction of B cell epitope of F protein in respiratory syncytial virus

YI Gao,PAN Jiayu,LIN Chunyi,LIU Zhaoyu

(The 5th Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University,Guangzhou 510700,China)

ObjectiveTo analyze the secondary structure and predict its B cell epitope of F protein in respiratory syncytial virus(RSV).MethodsWe analyzed the secondary structure of RSV F protein and obtained the sequence and location about the signal peptide in RSV F protein.Based on the homology modeling method,we predicted the potential conformational B epitopes and linear B epitopes in RSV F protein.ResultsAmong the 574 amino acids of RSV F protein,the major amino acids were serine(10.45%),leucine(10.28),asparagine(8.71%)and threonine(8.71%).There might be 7 protein binding sites,6 helical structure generation regions and 2 β-plated sheets in F protein.The sites 1-25 of N-terminus in F protein were signaling peptides.The head of the F protein was mainly composed by β-plated sheets,random coils and turns,while the tail was mainly composed by 2 long α-helixes.Eight linear B epitopes and four conformational B epitopes were predicted in F protein.ConclusionsSerine and leucine occupy the maximum ratio of amino acids encoding F protein.There might be seven protein binding sites,six helical structure generation regions,two major β-plated sheets in F protein,and RSV F protein may contain four conformational B epitopes and eight linear B epitopes.

respiratory syncytial virus;F protein;secondary structure of protein;B cell epitope

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(81400013)；廣東省科技計(jì)劃自助項(xiàng)目(2014A020212329)。

易高(1977-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要研究方向?yàn)闅獾姥装Y與氣道疾病。E-mail：15360802191@163.com

簡介：劉兆宇(1983-)，男，博士，助理研究員，主要研究方向?yàn)橄忍煨悦庖吲c氣道疾病。E-mail：sysu1924@gmail.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.27.006

R392.11

A

1002-266X(2016)27-0020-04

2016-02-11)