陳華，崔煥立，張雷，梁蔚陽(yáng)Δ

(1.廣東省藥品檢驗(yàn)所 生化藥品室，廣州 廣東 510180；2中山大學(xué)新華學(xué)院 藥學(xué)系，廣州 廣東 510520；3.華南理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510060)

HPLC-ELSD法同時(shí)測(cè)定依托咪酯乳狀注射液中磷脂酰膽堿與溶血磷脂酰膽堿

陳華1，崔煥立2，張雷3，梁蔚陽(yáng)1Δ

(1.廣東省藥品檢驗(yàn)所 生化藥品室，廣州 廣東 510180；2中山大學(xué)新華學(xué)院 藥學(xué)系，廣州 廣東 510520；3.華南理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510060)

目的建立HPLC-ELSD法同時(shí)測(cè)定依托咪酯乳狀注射液中磷脂酰膽堿(PC)與溶血凝血酰膽堿(LPC)含量。方法采用Lichrospher 100 Diol 125-4色譜柱 (100 mm×4.6 mm，5 um)，以正己烷-異丙醇-冰醋酸-三乙胺(814:170:15:0.8)為流動(dòng)相A、異丙醇-水-冰醋酸-三乙胺(844:140:15:0.8)為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，柱溫55 ℃，蒸發(fā)光檢測(cè)器檢測(cè)溫度為80 ℃。結(jié)果在選定的色譜條件下，磷脂酰膽堿在0.048～1.536 mg/mL范圍內(nèi)，溶血磷脂酰膽堿在0.0173～0.3118 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。磷脂酰膽堿加樣回收率為100.3%(RSD=1.4%)，溶血磷脂酰膽堿加樣回收率為95.2%(RSD=2.4%)。結(jié)論HPLC-ELSD法準(zhǔn)確、快捷、重復(fù)性好，可同時(shí)測(cè)定依托咪酯乳狀注射液中磷脂酰膽堿與溶血凝血酰膽堿含量。

依托咪酯乳狀注射液；磷脂酰膽堿；溶血磷脂酰膽堿；HPLC-ELSD

依托咪酯是一種全身麻醉藥，性能獨(dú)特，血流動(dòng)力學(xué)變化和呼吸抑制較小，具有不同尋常的安全特性[1]。與丙泊酚相比較，在小兒手術(shù)中血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定，具有蘇醒時(shí)間短，麻醉效果好的優(yōu)點(diǎn)[2]。老年人用藥表明，可單獨(dú)使用依托咪酯[3]或“丙泊酚+依托咪酯”麻醉誘導(dǎo)法，患者血壓和心率變化較小，比單一使用丙泊酚更安全[4-5]。依托咪酯溶于水，但其水溶劑導(dǎo)致嚴(yán)重的注射痛，制備成中/長(zhǎng)鏈脂肪乳注射液可顯著減少注射痛和溶血的發(fā)生率[1,6]。依托咪酯乳狀注射液是由依托咪酯、大豆油及中鏈甘油三酸脂經(jīng)蛋黃卵磷脂乳化并加甘油制成的滅菌乳狀液體，其質(zhì)量控制要點(diǎn)與乳狀注射液一致。

對(duì)于乳化劑蛋黃卵磷脂的質(zhì)控，目前丙泊酚乳狀注射液、脂肪乳注射液及中/長(zhǎng)鏈脂肪乳注射液均測(cè)定磷的含量，即蛋黃卵磷脂中磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰絲氨酸(PS)等[7]成分中磷的總和。磷脂酰膽堿是蛋黃卵磷脂的主要組分，也是體現(xiàn)其功能的主要成分[8]，中國(guó)藥典[9]規(guī)定蛋黃卵磷脂(供注射用)的磷脂酰膽堿含量不得小于68%。因此，僅僅測(cè)定磷的總量是不夠的，有必要對(duì)磷脂酰膽堿含量進(jìn)行測(cè)定。另外在制備、貯藏期間磷脂酰膽堿有可能降解產(chǎn)生溶血磷脂酰膽堿(LPC)，具有溶血或改變細(xì)胞滲透性等作用，故依托咪酯乳狀注射液中溶血磷脂酰膽堿含量也需進(jìn)行嚴(yán)格控制。本文旨在建立高效液相色譜法-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法同時(shí)測(cè)定依托咪酯乳狀注射液中磷脂酰膽堿(PC)與溶血凝血酰膽堿(LPC)含量。

1 材料與方法

1.1.1 儀器：Agilent 1200 Series高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫)；Alltech 3300蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(美國(guó)奧泰)；Sartarius CPA225D電子天平(德國(guó)賽多利斯)。

1.1.2 藥品與試劑：依托咪酯乳狀注射液(生產(chǎn)企業(yè)A，批號(hào)14255034、14235034、14244035)。磷脂酰膽堿對(duì)照品(批號(hào)：SLBH3672V ，含量99%)；溶血磷脂酰膽堿對(duì)照品(批號(hào)：SLBJ4793V，含量99%)；磷脂酰乙醇胺(批號(hào)：SLBN7096V，含量99%)，均購(gòu)自Sigma公司；正己烷、異丙醇、冰醋酸和三乙胺均為色譜純；水為超純水。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件：色譜柱： Lichrospher 100 Diol 125-4(100 mm×4.6 mm，5 um)；以：正己烷-異丙醇-冰醋酸-三乙胺(814:170:15:0.8)為流動(dòng)相A，異丙醇-水-冰醋酸-三乙胺(844:140:15:0.8)為流動(dòng)相B；柱溫為55 ℃：漂移管溫度80 ℃。按下列梯度洗脫：

時(shí)間(min)B(%)流速(mL/min)005105020108540101501001017510010176510210510220520270520290510

1.2.2 溶液的制備

① 供試品溶液：精密量取本品1 mL，置10 mL量瓶中，用二氧六環(huán)溶解并稀釋至刻度，搖勻。

② 對(duì)照品溶液：取磷脂酰膽堿對(duì)照品24 mg，精密稱定，置5 mL量瓶中，加正己烷-異丙醇(1:1)適量，超聲使溶解，并稀釋至刻度，混勻，作為磷脂酰膽堿對(duì)照品儲(chǔ)備液。取磷脂酰乙醇胺對(duì)照品10 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，加正己烷-異丙醇(1:1)適量，超聲使溶解，并稀釋至刻度，混勻，作為磷脂酰乙醇胺對(duì)照品儲(chǔ)備液。取溶血磷脂酰膽堿對(duì)照品20 mg，置25 mL量瓶中，加正己烷-異丙醇(1:1)適量，超聲使溶解，并稀釋至刻度，作為溶血磷脂酰膽堿對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密量取磷脂酰膽堿對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用正己烷-異丙醇-二氧六環(huán)(10:10:80)稀釋制成每1 mL中約含磷脂酰膽堿0.048、0.288、0.864、1.152、1.536 mg的溶液，作為磷脂酰膽堿對(duì)照品溶液。另分別精密量取溶血磷脂酰膽堿對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用正己烷-異丙醇-二氧六環(huán)(10:10:80)稀釋制成每1 mL中約含溶血磷脂酰膽堿0.016、0.08、0.16、0.192、0.288 mg的溶液，作為溶血磷脂酰膽堿對(duì)照品溶液。

從大賽的實(shí)施過(guò)程可以很明顯的看出，大賽不僅為學(xué)生提供了一個(gè)很好的實(shí)踐平臺(tái)，一個(gè)展示自我的平臺(tái)，極大地提高了學(xué)生的創(chuàng)新意識(shí)、實(shí)踐能力和團(tuán)隊(duì)協(xié)作能力[6]。

③ 系統(tǒng)適用性溶液：精密量取磷脂酰膽堿對(duì)照品儲(chǔ)備液0.16 mL、磷脂酰乙醇胺對(duì)照品儲(chǔ)備液0.25 mL和溶血磷脂酰膽堿對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5 mL，用正己烷-異丙醇-二氧六環(huán)(10:10:80)稀釋至2 mL( 每1 m中約含磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺和溶血磷脂酰膽堿分別為1.2 mg、0.25、0.19 mg的溶液)。

精密量取供試品溶液和磷脂酰膽堿系列對(duì)照品溶液各10 μL，另精密量取系統(tǒng)適用性溶液、供試品溶液和溶血磷脂酰膽堿系列對(duì)照品溶液各20 μL，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以對(duì)照品系列溶液的濃度與相應(yīng)的峰面積計(jì)算二次回歸方程。

1.2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

① 線性試驗(yàn)：分別精密量取“1.2.2”項(xiàng)下的磷脂酰膽堿系列對(duì)照品溶液10 μL與溶血磷脂酰膽堿系列對(duì)照品溶液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以對(duì)照品溶液的濃度與相應(yīng)的峰面積計(jì)算二次回歸方程。

② 重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批次的依托咪酯乳狀注射液(批號(hào)：14255034)，精密量取1 mL供試品，共6份，按“1.2.2”方法分別制備供試品溶液，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。

③ 檢測(cè)限：取“1.2.2”項(xiàng)下磷脂酰膽堿對(duì)照品溶液與溶血磷脂酰膽堿對(duì)照品溶液，逐步用正己烷-異丙醇-二氧六環(huán)(10:10:80)稀釋至色譜圖中磷脂酰膽堿和溶血磷脂酰膽堿峰高為噪音的3倍，為檢測(cè)限。

④ 定量限：取“1.2.2”項(xiàng)下磷脂酰膽堿對(duì)照品溶液與溶血磷脂酰膽堿對(duì)照品溶液，用正己烷-異丙醇-二氧六環(huán)(10:10:80)稀釋至色譜圖中磷脂酰膽堿和溶血磷脂酰膽堿峰高為噪音的10倍，為定量限。

⑤ 回收率：試驗(yàn)取樣品(批號(hào)14244035)0.5 mL，分別加入“1.2.2”項(xiàng)下磷脂酰膽堿對(duì)照品儲(chǔ)備液和溶血磷脂酰膽堿儲(chǔ)備液各0.4、0.5、0.6 mL，加正己烷-異丙醇-二氧六環(huán)(10:10:80)稀釋至10 mL，制成80%、100%和120%的低、中、高濃度的溶液，每個(gè)濃度平行3份。按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。

⑥ 樣品測(cè)定：按“1.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的配制方法制備，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以峰面積計(jì)算磷脂酰膽堿和溶血磷脂酰膽堿的含量。

2 結(jié)果

2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 磷脂酰乙醇胺與磷脂酰膽堿分離度為2.5，磷脂酰膽堿與溶血磷脂酰膽堿分離度為10.7。見(jiàn)圖1。

圖1 各溶液HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of each solution

2.2 線性試驗(yàn) 以各組分濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，計(jì)算二次回歸方程。磷脂酰膽堿與溶血磷脂酰膽堿的二項(xiàng)式回歸方程分別為：Y=-3452X2+35733X-2422.3，r=1.0；Y=37027X2+22241X-132.47，r=1.0。結(jié)果表明磷脂酰膽堿在0.048～1.536 mg/mL,溶血磷脂酰膽堿在0.0173～0.3118 mg/mL,線性關(guān)系良好。

2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 測(cè)得磷脂酰膽堿平均含量為9.4 mg/mL，RSD值為1.3%；溶血磷脂酰膽堿平均含量為0.6 mg/mL，RSD值為2.5%。

2.4 檢測(cè)限 磷脂酰膽堿檢測(cè)限為0.11 μg、溶血磷脂酰膽堿檢測(cè)限為0.17 μg。

2.5 定量限 磷脂酰膽堿定量限為 0.35 μg、溶血磷脂酰膽堿定量限為 0.35 μg。

2.6 回收試驗(yàn) 磷脂酰膽堿平均回收率為100.3%，RSD值為1.4%；溶血磷脂酰膽堿平均回收率為95.2%，RSD值為2.4%。結(jié)果表明該方法有良好的回收率。見(jiàn)表1。

表1 回收率計(jì)算結(jié)果(n=9)Tab.1 Results of recovery test(n=9)

2.7 樣品測(cè)定結(jié)果 樣品測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品測(cè)定結(jié)果

3 討論

依托咪酯乳狀注射液處方中蛋黃卵磷脂為12 mg/mL，本法測(cè)得樣品中磷脂酰膽堿約為10 mg/mL，即蛋黃卵磷脂中磷脂酰膽堿的含量約為83%，符合中國(guó)藥典蛋黃卵磷脂(供注射用)的規(guī)定(磷脂酰膽堿不得少于68%)。

樣品中磷脂酰膽堿(主成分)和溶血磷脂酰膽堿(雜質(zhì)))含量相差較大，信號(hào)響應(yīng)相差也較大，所以檢測(cè)磷脂酰膽堿時(shí)進(jìn)樣量為10 μL，檢測(cè)溶血磷脂酰膽堿時(shí)進(jìn)樣量為20 μL。

由系統(tǒng)適用性試驗(yàn)可見(jiàn)，磷脂酰膽堿乙醇胺、磷脂酰膽堿和溶血磷脂酰膽堿分離度良好，但測(cè)定依托咪酯乳狀注射液時(shí)，磷脂酰膽堿乙醇胺與輔料峰不能很好分離。因此，本方法未能測(cè)定磷脂酰乙醇胺。

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(編校：吳茜)

作者簡(jiǎn)介

梁蔚陽(yáng)，廣東省藥品檢驗(yàn)所生化藥品室主任，主任藥師。長(zhǎng)期從事生化藥品及生物制品質(zhì)量控制及研究工作，完成大量生化藥品和生物制品標(biāo)準(zhǔn)起草復(fù)核工作，發(fā)表學(xué)術(shù)論文數(shù)十篇。現(xiàn)為國(guó)家藥品GMP檢查員、中國(guó)生化制藥工業(yè)協(xié)會(huì)專(zhuān)家、《中國(guó)生化藥物雜志》編委、廣東省第三屆突發(fā)事件應(yīng)急管理專(zhuān)家?guī)鞂?zhuān)家、廣東省藥品GMP檢查員、廣東省技術(shù)監(jiān)督局實(shí)驗(yàn)室資質(zhì)認(rèn)定評(píng)審員、廣東省預(yù)防接種異常反應(yīng)調(diào)查診斷專(zhuān)家組成員。

SimultaneousdeterminationofphophatidylcholineandlysophophatidylcholineinEtomidateInjectableEmulsionbyHPLC-ELSD

CHEN Hua1, CUI Huan-li2, ZHANG Lei3, LIANG Wei-yang1Δ
(1.Biochemical Laboratory, Guangdong Institute for Drug Control, Guangzhou 510180, China; 2.Xinhua College of Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510520, China; 3.School of Bioscience and Bioengineering, South China University of Technology, Guangzhou 510060, China)

ObjectiveTo develop an HPLC-ELSD method for simultaneous determination of phosphatidylcholine (PC) and lysophosphatidyl choline (LPC) in Etomidate Injectable Emulsion.MethodsSeparation was carried out on a Lichrospher 100 Diol 125-4 culumn(100 mm×4.6 mm，5um),The gradient elution mobile phase consisted of two eluents: n-hexane-isopropanol-glacial acetic acid-triethylamine(814:170:15:0.8)as mobile phase A, isopropanol-water-glacial acetic acid-triethylamine(844:140:15:0.8)as mobile phase B.The flow rate was 1.0 mL/min at a temperature of 55 ℃.The detector was ELSD of which the drift tude temperature was maintained at 80 ℃.ResultsThe linear ranges of phosphatidyl choline of calibration curve was 0.048-1.536 mg/mL,andthe linear ranges of lysophosphatidylcholineof calibration curve was 0.0173-0.3118 mg/mL.The average recovery of phosphatidyl choline was 100.3%(RSD=1.4%),and the average recovery of lysophosphatidylcholinewas95.2%(RSD=2.4%).ConclusionThe mothod is simple,accurate and reproducible for determination of phosphatidylcholine andlysophosphatidyl choline in Etomidate Injectable Emulsion.

Etomidate Injectable Emulsion; phosphatidylcholine; lysophosphatidylcholine; HPLC-ELSD

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.10.004

廣東省食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)創(chuàng)新專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目(2015ZX05)；廣東省醫(yī)學(xué)科研基金項(xiàng)目(A2015256)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2016A010121004)

陳華，女，碩士，副主任藥師，研究方向：生化藥品質(zhì)量控制和標(biāo)準(zhǔn)研究，E-mail：gdchenhua@sina.com；梁蔚陽(yáng)，通信作者，女，碩士，主任藥師，研究方向：生化藥品質(zhì)量控制和標(biāo)準(zhǔn)研究，E-mail：lwy-123@163.com。

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