李京，王悅，范慧紅

(中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050)

首批肝素抗Ⅱa因子效價(jià)測(cè)定用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品協(xié)作標(biāo)定

李京，王悅，范慧紅Δ

(中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050)

目的建立肝素抗Ⅱa因子效價(jià)測(cè)定用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品。方法通過理化分析及效價(jià)測(cè)定，篩選出適合的標(biāo)準(zhǔn)品原料，溶解、分裝、凍干后制備成肝素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)待標(biāo)品(140817-201501)。以第6次肝素國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品07/328為標(biāo)準(zhǔn)品，分別采用《中國(guó)藥典》2015年版和2010年版肝素鈉效價(jià)測(cè)定方法測(cè)定待標(biāo)品的抗Ⅱa因子效價(jià)、抗Ⅹa因子效價(jià)和抗凝效價(jià)，由13個(gè)實(shí)驗(yàn)室協(xié)作標(biāo)定。為考察肝素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的延續(xù)性，上一批肝素鈉國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品(150509-200912)在協(xié)作標(biāo)定中使用。結(jié)果效價(jià)標(biāo)化結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)及實(shí)驗(yàn)室間的幾何變異系數(shù)(geometric coefficient of variation， gcv)均小于10%；以第6次肝素國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品07/328作為標(biāo)準(zhǔn)品，待標(biāo)品抗Ⅱa因子效價(jià)為2011 IU/安瓿，抗Ⅹa因子效價(jià)為1998 IU/安瓿，抗凝效價(jià)為1992 IU/安瓿；對(duì)各實(shí)驗(yàn)室抗Ⅱa因子效價(jià)、抗Ⅹa因子效價(jià)、抗凝效價(jià)幾何均值進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果沒有顯著性差異；各實(shí)驗(yàn)室使用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定待標(biāo)品抗Ⅱa因子效價(jià)和使用上一批肝素鈉國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品(150509-200912)測(cè)定的待標(biāo)品抗凝效價(jià)幾何均值進(jìn)行welch檢驗(yàn)，結(jié)果沒有顯著性差異，肝素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的延續(xù)性良好。結(jié)論經(jīng)國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)委員會(huì)審定后批準(zhǔn)，待標(biāo)品(140817-201501)用作肝素效價(jià)測(cè)定用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品，效價(jià)為2011 IU/安瓿。

肝素；國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品；效價(jià)測(cè)定；協(xié)作標(biāo)定；生色底物法；抗Ⅱa因子效價(jià)；抗Ⅹa因子效價(jià)； 抗凝效價(jià)

《中國(guó)藥典》2015年版肝素鈉、肝素鈣效價(jià)測(cè)定方法由2010年版收載的血液凝固法測(cè)定抗凝效價(jià)改為生色底物法測(cè)定抗Ⅱa因子效價(jià)，因此急需建立肝素抗Ⅱa因子效價(jià)測(cè)定用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品。傳統(tǒng)的肝素效價(jià)測(cè)定方法是血液凝固法[1]， 雖然能全面反映樣品的抗凝活性，但專屬性不強(qiáng)，在2009年肝素鈉注射液全國(guó)評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)[2]，有部分樣品抗凝活性明顯高于抗IIa因子活性，有關(guān)物質(zhì)檢查結(jié)果顯示，上述樣品的類肝素雜質(zhì)超標(biāo)。生色底物法[3]是肝素與純化的凝血因子形成復(fù)合物，該復(fù)合物可以定量水解特異性生色底物，方法專屬性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便，國(guó)際上已有使用生色底物法測(cè)定肝素效價(jià)替代血液凝固法的趨勢(shì)。2009年第六次肝素國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品協(xié)作標(biāo)定中[4]，世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)已將抗Ⅱa因子和抗Ⅹa因子活性測(cè)定方法作為推薦使用的標(biāo)定方法；美國(guó)藥典(The United States Pharmacopeia，USP)于2010年USP33版中收載肝素抗Ⅱa因子效價(jià)測(cè)定方法[5]替代原來的羊血漿法[6]；歐洲藥典(European pharmacopoeia，EP)于2015年EP8.3版中收載肝素抗Ⅱa因子效價(jià)測(cè)定方法[7]替代原來的活化部分凝血酶時(shí)間法(activated partial thrombin time，APTT)[8]；中國(guó)藥典(Chinese pharmacopeia，CHP)于2015年CHP2015版中收載肝素抗Ⅱa因子效價(jià)測(cè)定方法[9]替代原來的血液凝固法[1]。

原有的肝素鈉國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品(150509-200912，197 IU/mg)是采用血液凝固法[1]賦值的，為保證CHP2015版的順利執(zhí)行，決定換批制備新的肝素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品(140817-201501)，采用抗IIa因子效價(jià)測(cè)定法[9]賦值。中國(guó)食品藥品檢定研究院(中檢院)通過理化分析及效價(jià)測(cè)定，篩選出適合的標(biāo)準(zhǔn)品原料，溶解、分裝、凍干后制備成肝素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)待標(biāo)品(140817-201501)。以第6次肝素國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品07/328為標(biāo)準(zhǔn)品，分別采用CHP2015和CHP2010年肝素鈉效價(jià)測(cè)定方法測(cè)定待標(biāo)品的抗Ⅱa因子效價(jià)、抗Ⅹa因子效價(jià)和抗凝效價(jià)，由13個(gè)實(shí)驗(yàn)室協(xié)作標(biāo)定。為考察肝素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的延續(xù)性，上一批肝素鈉國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品(150509-200912)在協(xié)作標(biāo)定中使用。下面重點(diǎn)介紹協(xié)作標(biāo)定的結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品：WHO第六次肝素國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品，2009年建立，批號(hào)07/328，標(biāo)示效價(jià)為2145 IU/安瓿，凍干品，包裝為玻璃安瓿，-20 ℃避光保存，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室1支。

1.1.2 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品：肝素鈉國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品，2009年建立，批號(hào)150509-200912，標(biāo)示效價(jià)為197 IU/mg，白色粉末，包裝為硬質(zhì)玻璃管，避光冷藏保存，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室1支。

1.1.3 待標(biāo)品：肝素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品待標(biāo)品，批號(hào)140817-201501，估計(jì)效價(jià)為2 000 IU/安瓿，凍干品，包裝為玻璃安瓿，-20 ℃避光保存，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室4支。

1.2 方法

1.2.1 納入實(shí)驗(yàn)室：在全國(guó)范圍內(nèi)作問卷調(diào)查，從有意愿參加協(xié)作研究的實(shí)驗(yàn)室中挑選了13家經(jīng)驗(yàn)豐富的實(shí)驗(yàn)室，其中5家是藥檢所(中國(guó)食品藥品檢定研究院、上海市食品藥品檢驗(yàn)所、江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院、廣東省食品藥品檢驗(yàn)所、天津市藥品檢驗(yàn)所)，8家為制藥企業(yè)(河北常山生化藥業(yè)股份有限公司QC實(shí)驗(yàn)室、河北常山生化藥業(yè)股份有限公司研發(fā)實(shí)驗(yàn)室、常州千紅生化制藥股份有限公司、南京健友生化制藥股份有限公司、煙臺(tái)東誠(chéng)藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司、東營(yíng)天東制藥有限公司、深圳市海普瑞藥業(yè)股份有限公司、成都市海通藥業(yè)有限公司)。

1.2.2 抗IIa因子效價(jià)：CHP2015二部肝素鈉效價(jià)測(cè)定項(xiàng)下抗IIa因子效價(jià)測(cè)定法[9]。

1.2.3 抗Xa因子效價(jià)：CHP2015二部肝素鈉效價(jià)測(cè)定項(xiàng)下抗Xa因子效價(jià)測(cè)定法[9]。

1.2.4 抗凝效價(jià)：CHP2010二部附錄XII D肝素生物測(cè)定法[1]。

1.2.5 具體過程：每個(gè)實(shí)驗(yàn)室分別以國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)4支待標(biāo)品進(jìn)行抗IIa因子、抗Хa因子、抗凝效價(jià)測(cè)定，提供4個(gè)有效數(shù)據(jù)。為考察日間差異，上述3種實(shí)驗(yàn)方法的4次測(cè)定應(yīng)分別在4 d完成，填寫結(jié)果報(bào)告表，報(bào)告實(shí)驗(yàn)所用試劑、儀器等基本信息，原始數(shù)據(jù)及效價(jià)計(jì)算結(jié)果。

要求每次測(cè)定均應(yīng)將標(biāo)準(zhǔn)品(S)和供試品(T)稀釋成4個(gè)或3個(gè)濃度，每個(gè)濃度平行作2管。以反應(yīng)值(A)與濃度(C)的對(duì)數(shù)值作線性回歸?；诹糠磻?yīng)平行線法的測(cè)定原理[10]，S和T的劑量與反應(yīng)呈直線關(guān)系，并且S和T兩條直線應(yīng)平行。要首先對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行可靠性測(cè)驗(yàn)，回歸關(guān)系應(yīng)非常顯著(P<0.01)，偏離平行不顯著(P>0.05)，二次曲線、反向二次曲線不顯著(P>0.05)，實(shí)驗(yàn)可靠性測(cè)驗(yàn)通過者計(jì)算效價(jià)(PT)和95%概率水平的可信限率(FL%)。

對(duì)每個(gè)實(shí)驗(yàn)室提供的4個(gè)效價(jià)估計(jì)值進(jìn)行合并計(jì)算，得到每個(gè)實(shí)驗(yàn)室效價(jià)測(cè)定的幾何平均值，再對(duì)所有實(shí)驗(yàn)室的幾何平均值匯總進(jìn)行合并計(jì)算，得到所有實(shí)驗(yàn)室效價(jià)測(cè)定的幾何平均值及95%均值置信區(qū)間。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)及實(shí)驗(yàn)室間的測(cè)定差異用幾何變異系數(shù)(geometric coefficient of variation，gcv)表示，gcv的計(jì)算參照文獻(xiàn)[11]中的公式。合并計(jì)算的方法與實(shí)驗(yàn)誤差的表示參照第六次肝素國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)計(jì)算方法[4]。

1.2.6 標(biāo)準(zhǔn)品使用說明：國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品按標(biāo)準(zhǔn)品附帶說明書使用，待標(biāo)品參考國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品說明書使用。標(biāo)準(zhǔn)品和待標(biāo)品可復(fù)溶后制成母液分裝保存，每次實(shí)驗(yàn)稀釋液應(yīng)新鮮制備。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 除9號(hào)實(shí)驗(yàn)室使用了歐洲藥典生物統(tǒng)計(jì)軟件CombiStats(版本5.0)外，其余實(shí)驗(yàn)室均使用了中國(guó)藥典生物檢定統(tǒng)計(jì)程序BS2000(中國(guó)食品藥品檢定研究院編制)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及效價(jià)計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 各實(shí)驗(yàn)室使用的試劑及儀器 13個(gè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行抗Xa因子和抗IIa因子效價(jià)測(cè)定，11個(gè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了抗凝效價(jià)測(cè)定。各實(shí)驗(yàn)室抗Xa因子、抗IIa因子效價(jià)及抗凝效價(jià)測(cè)定使用的試劑及儀器見表1、表2。 從表1、表2的結(jié)果可以看出，各實(shí)驗(yàn)室使用了各自常用的試劑及儀器，來源、規(guī)格及生產(chǎn)廠商都不盡相同。在抗Xa因子、抗IIa因子效價(jià)測(cè)定實(shí)驗(yàn)中：除1個(gè)實(shí)驗(yàn)室使用人源的Xa因子外，其余實(shí)驗(yàn)室使用的Xa因子是牛源的；4個(gè)實(shí)驗(yàn)室使用了牛源FIIa，8個(gè)實(shí)驗(yàn)室使用人源IIa因子；所有實(shí)驗(yàn)室使用了人源ATIII；除兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室外，大部分實(shí)驗(yàn)室使用了Chromogenix公司的發(fā)色底物；在儀器方面，7個(gè)實(shí)驗(yàn)室使用了酶標(biāo)儀，4個(gè)實(shí)驗(yàn)室使用分光光度計(jì)，2個(gè)實(shí)驗(yàn)室使用血凝儀。在抗凝效價(jià)測(cè)定實(shí)驗(yàn)中，有4個(gè)實(shí)驗(yàn)室使用血漿復(fù)鈣法，2個(gè)實(shí)驗(yàn)室使用兔全血法，4個(gè)實(shí)驗(yàn)室使用APTT法，1個(gè)實(shí)驗(yàn)室使用USP羊血漿法；使用的底物包括兔血漿、兔全血、豬血漿、羊血漿；終點(diǎn)觀察方法，4個(gè)實(shí)驗(yàn)室使用血凝儀、8個(gè)實(shí)驗(yàn)室使用肉眼觀察。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看(見圖1)，不同廠商、不同來源的試劑、不同的儀器均可以使用，對(duì)效價(jià)測(cè)定沒有顯著影響。在以往多次的肝素與低分子肝素效價(jià)國(guó)際、國(guó)內(nèi)協(xié)作標(biāo)定中[4，12-13]，各實(shí)驗(yàn)室也均使用了多種試劑及儀器，結(jié)果沒有顯著差異。

表1 抗Xa因子、抗IIa因子效價(jià)測(cè)定使用試劑及儀器Tab.1 The reagents and instruments used in anti-FXa and anti-FIIa chromogenic assays

B和H代表試劑的動(dòng)物來源，B為牛源，H為人源。括號(hào)中字母代表試劑生產(chǎn)廠商，A: 北京艾德豪克國(guó)際技術(shù)有限公司，C：Chromogenix 公司，H：HYPHEN BioMed公司, HN:湖南一格制藥有限公司，N：中國(guó)食品藥品檢定研究院，S：Sigma-Aldrich 公司。 “/”為企業(yè)未提供數(shù)據(jù)

表2 抗凝效價(jià)測(cè)定使用試劑及儀器

APTT法：活化部分凝血活酶時(shí)間測(cè)定法。括號(hào)中字母代表試劑生產(chǎn)廠商，U：unknown，N:南京新百藥業(yè)有限公司，S：Siemens公司，ST：Stago公司，SD：山東蒼山向陽(yáng)生化助劑廠，G：廣東蕊特生物科技有限公司;SH:上海銘睿生物科技有限公司

2.2 各實(shí)驗(yàn)室提交數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果 各實(shí)驗(yàn)室提交的抗Xa因子效價(jià)測(cè)定結(jié)果共52個(gè)，抗IIa因子效價(jià)測(cè)定結(jié)果共52個(gè)，抗凝效價(jià)測(cè)定結(jié)果88個(gè)，均通過了可靠性測(cè)驗(yàn)，底物法、兔全血法APTT法FL%小于10%，血漿復(fù)鈣法FL%小于5%，所有數(shù)據(jù)均為有效數(shù)據(jù)，可以參與合并計(jì)算。

2.3 抗IIa因子效價(jià)測(cè)定結(jié)果 各實(shí)驗(yàn)室抗IIa因子效價(jià)測(cè)定結(jié)果見表3。

表3 以IS 07/328標(biāo)定肝素標(biāo)準(zhǔn)品(140817-201501)抗IIa因子效價(jià)結(jié)果(IU/安瓿)Tab.3 The anti-FIIa potency of heparin national standard(140817-201501) determined by heparin international standard(07/328)(IU/ampoule)

帶*數(shù)據(jù)為離群值，排除后計(jì)算；gcv為幾何變異系數(shù)

2.4 抗Xa因子效價(jià)測(cè)定結(jié)果 各實(shí)驗(yàn)室抗Xa因子效價(jià)測(cè)定結(jié)果見表4。

表4 以IS 07/328標(biāo)定肝素標(biāo)準(zhǔn)品(140817-201501)抗Xa因子效價(jià)結(jié)果(IU/安瓿)Tab.4 The anti-FXa potency of heparin national standard(140817-201501) determined by heparin international standard(07/328) (IU/ampoule)

帶*數(shù)據(jù)為離群值，排除后計(jì)算；gcv為幾何變異系數(shù)

2.5 抗凝效價(jià)測(cè)定結(jié)果 各實(shí)驗(yàn)室抗凝效價(jià)測(cè)定結(jié)果，見表5、表6。

表5 以IS 07/328標(biāo)定肝素標(biāo)準(zhǔn)品(140817-201501)抗凝效價(jià)結(jié)果(IU/安瓿)Tab.5 The anticoagulation potency of heparin national standard(140817-201501) determined by heparin international standard(07/328) (IU/ampoule)

gcv為幾何變異系數(shù)

表6 以上一批肝素鈉國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品((150509-200912)標(biāo)定肝素標(biāo)準(zhǔn)品(140817-201501)抗凝效價(jià)結(jié)果(IU/安瓿)Tab.6 The anticoagulation potency of heparin national standard(140817-201501) determined by last heparin standard(150509-200912) (IU/ampoule)

gcv為幾何變異系數(shù)

2.6 離群值處理結(jié)果 4號(hào)實(shí)驗(yàn)室安瓿4的抗IIa因子效價(jià)結(jié)果(見表3)和抗Xa因子效價(jià)結(jié)果(見表4)明顯離群，但安瓿4的抗凝效價(jià)結(jié)果(見表5)在正常范圍內(nèi)，因此將4號(hào)實(shí)驗(yàn)室安瓿4的抗IIa因子效價(jià)和抗IIa因子效價(jià)作為離群值處理，不參與合并計(jì)算。

2.7 抗Xa因子與抗IIa因子效價(jià)比 肝素的抗Xa因子與抗IIa因子效價(jià)比應(yīng)在0.9～1.1范圍內(nèi)，這是肝素活性的重要特征，肝素標(biāo)準(zhǔn)品(140817-201501)的抗Xa因子與抗IIa因子效價(jià)比值為1.0，符合規(guī)定。

3 討論

3.1 方法比較 使用肝素國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品(07/328)對(duì)肝素標(biāo)準(zhǔn)品(140817-201501)進(jìn)行抗IIa因子效價(jià)、抗Xa因子效價(jià)、抗凝效價(jià)測(cè)定，圖1為3種方法測(cè)定結(jié)果的頻數(shù)圖，圖2為箱線圖。使用JMP10統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各實(shí)驗(yàn)室?guī)缀尉颠M(jìn)行單因子方差分析，F(xiàn)值為0.4554(大于0.05)，結(jié)果沒有顯著性差異。3種測(cè)定方法中，抗IIa因子測(cè)定的誤差較大，這是因?yàn)榭笽Ia因子的顯色濃度范圍較窄，反應(yīng)濃度較低，加大了實(shí)驗(yàn)操作的難度。

圖1 肝素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品(140817-201501)效價(jià)測(cè)定結(jié)果頻數(shù)圖A-抗IIa因子效價(jià)，B-抗Xa因子效價(jià)，C-抗凝效價(jià)以肝素國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品(07/328)標(biāo)定，圖中每一個(gè)方塊表示一次獨(dú)立的測(cè)定結(jié)果，方塊中的數(shù)字為實(shí)驗(yàn)室代號(hào)Fig.1 Frequency distribution of potency of national standard for heparin(140817-201501),A- anti-FIIa potency, B-anti-FXa potency, C-anticoagulation potency The potencies were determined against international standard of heparin(07/328).Each square represents an individual assay estimate. The number in the square denotes the laboratory code

圖2 以肝素國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品(07/328)為標(biāo)準(zhǔn)品，采用不同方法測(cè)定的肝素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品(140817-201501)效價(jià)廂線圖Fig.2 Box plot of the potency of national standard for heparin(140817-201501)by different methods ,using heparin international standard(07/328) as standard

3.2 肝素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品延續(xù)性考察 各實(shí)驗(yàn)室使用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定肝素標(biāo)準(zhǔn)品(140817-201501)抗Ⅱa因子效價(jià)和使用上一批肝素鈉國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品(150509-200912)測(cè)定肝素標(biāo)準(zhǔn)品(140817-201501)抗凝效價(jià)的幾何均值進(jìn)行welch檢驗(yàn)，結(jié)果沒有顯著性差異，肝素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的延續(xù)性良好。圖3為2種標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定肝素標(biāo)準(zhǔn)品(140817-201501)效價(jià)的箱線圖。使用上一批肝素鈉國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品(150509-200912)測(cè)定抗凝效價(jià)與使用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品(07/328)測(cè)定抗IIa因子效價(jià)比較，實(shí)驗(yàn)間誤差較大，原因可能是因?yàn)樯弦慌嗡剽c國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品為硬質(zhì)玻璃管包裝的固體粉末，使用時(shí)需稱重，國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品為安瓿包裝凍干品，使用時(shí)為整支溶解，稱重后配制溶液的誤差較大。

圖3 以國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定抗IIa因子效價(jià)與以上批國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定的抗凝效價(jià)Fig.3 Box plot of the anti-FIIa potency by international standard and the anticoagulation potency by last national standard

3.3 實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng) 有部分實(shí)驗(yàn)室對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品分裝步驟不太清楚，可參考如下操作：取待分裝標(biāo)準(zhǔn)品1支，放置至室溫，小心開啟安瓿，加水1 mL溶解，放置使充分溶解。用1 mL無菌注射器，取出安瓿中溶液，至25 mL量瓶中。在安瓿中加水1 mL，取出，重復(fù)至少8次，每次盡量將安瓿中溶液取盡。將25 mL量瓶加水至刻度，搖勻。將溶液分裝至1.5 mL塑料離心管中，每支1 mL，將分裝后的樣品放在-20 ℃凍存，有效期為3個(gè)月。每天實(shí)驗(yàn)時(shí)取出1支復(fù)溶后使用，復(fù)溶后的樣品不能再次凍存。分裝后貯備的標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度不宜過低，應(yīng)在80 IU/mL以上，濃度過低，標(biāo)準(zhǔn)品的穩(wěn)定性無法保證。效價(jià)測(cè)定時(shí)的實(shí)驗(yàn)濃度通常在0.05 IU/mL以下，因此需要經(jīng)過多個(gè)稀釋步驟，正確的稀釋步驟十分重要，應(yīng)盡量保證標(biāo)準(zhǔn)品和供試品采用相同的稀釋步驟。

3.4 標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定性考察 肝素類標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定性較好，國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品-20 ℃儲(chǔ)存超過10年[4]。我們對(duì)肝素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品(140817-201501)進(jìn)行了初步穩(wěn)定性考察，將其置于40 ℃、80%RH的恒溫恒濕箱中，于第5天、第10天分別取樣并存放于-20 ℃冰箱中，再同時(shí)進(jìn)行效價(jià)測(cè)定，結(jié)果與-20 ℃冰箱保存樣品比較，抗FXa效價(jià)與抗FIIa效價(jià)均在95%均值置信區(qū)間內(nèi)，本品在40 ℃的儲(chǔ)存條件下10 d內(nèi)都是穩(wěn)定的，因此本品的運(yùn)輸條件為常溫，長(zhǎng)期儲(chǔ)存溫度為-20 ℃。

3.5 賦值方式 中國(guó)藥典2015年版與美國(guó)藥典38版肝素標(biāo)準(zhǔn)效價(jià)測(cè)定方法類似，均以抗IIa因子效價(jià)表示肝素效價(jià)，同時(shí)測(cè)定抗Xa因子效價(jià)，計(jì)算抗Xa因子效價(jià)與抗II因子效價(jià)比值作為肝素鑒別試驗(yàn)。美國(guó)藥典肝素效價(jià)測(cè)定用標(biāo)準(zhǔn)品(F0I187)的賦值方式是多個(gè)實(shí)驗(yàn)室使用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定抗IIa因子效價(jià)，對(duì)抗IIa因子效價(jià)結(jié)果合并計(jì)算。因此肝素標(biāo)準(zhǔn)品(140817-201501)的賦值方式為采用13個(gè)實(shí)驗(yàn)室使用肝素國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品(07/328)測(cè)定的抗IIa因子效價(jià)合并計(jì)算。

綜上，我國(guó)首批肝素抗IIa因子效價(jià)測(cè)定用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)13個(gè)實(shí)驗(yàn)室協(xié)作標(biāo)定，結(jié)果接近，實(shí)驗(yàn)室間gcv小于10%，本批肝素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品(140817-201501)效價(jià)定值為2011 IU/安瓿。2015年版中國(guó)藥典肝素鈉、肝素鈣抗IIa因子與抗Xa因子效價(jià)測(cè)定實(shí)驗(yàn)中，均使用該值作為標(biāo)準(zhǔn)品賦值。

志謝衷心感謝參與協(xié)作標(biāo)定實(shí)驗(yàn)室：上海市食品藥品檢驗(yàn)所、江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院、廣東省食品藥品檢驗(yàn)所、天津市藥品檢驗(yàn)所、河北常山生化藥業(yè)股份有限公司、常州千紅生化制藥股份有限公司、南京健友生化制藥股份有限公司、煙臺(tái)東誠(chéng)藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司、東營(yíng)天東制藥有限公司、深圳市海普瑞藥業(yè)股份有限公司、成都市海通藥業(yè)有限公司(上述實(shí)驗(yàn)室排序與文中實(shí)驗(yàn)室代號(hào)順序不同)。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：二部[S]. 2010年版，北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄118-119.

[2] 李京，王悅，宋玉娟，等. 肝素質(zhì)量評(píng)價(jià)與研究[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2013，48(16)：1412-1418.

[3] 李京，范慧紅. 微量生色底物法測(cè)定肝素抗Ⅹa因子和抗Ⅱa因子活性[J].中國(guó)生化藥物雜志，2010，31(1)：45-47.

[4] 李京，鄧?yán)?，李湛軍，?第六次肝素國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品協(xié)作標(biāo)定[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2010，45(24)：1954-1958.

[5] USP33/NF28[S].2010.

[6] USP32/NF27[S].2009:2552-2554.

[7] EP 8.3[S].2015:4341-4343.

[8] EP 8.0[S].2014:2390-2391.

[9] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：二部[S]. 2015年版，北京: 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：517-519.

[10] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：四部[S]. 2015年版，北京: 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015： 182-200.

[11] Kirkwood TBL.Geometric means and measure of dispersion[J].Biometrics,1975,35(10):908-909.

[12] 李京，王悅，范慧紅.第3次低分子肝素國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品協(xié)作標(biāo)定[J].藥物分析雜志，2014，34(1)：71-74.

[13] 李京，郝蘇麗，范慧紅，等.第一次低分子量肝素效價(jià)測(cè)定用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品協(xié)作標(biāo)定[J].2008，22(12)：1077-1080.

(編校：吳茜)

Acollaborativestudytoestablishthenationalstandardforheparinwithanassignedvalueobtainedfromanti-FIIachromogenicmethod

LI Jing, WANG Yue, FAN Hui-HongΔ
(National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050)

ObjectiveTo establish a national standard for heparin with an assigned value obtained from anti-FIIa chromogenic method.MethodsThrough physical, chemical and biological tests, one batch of heparin sodium was selected to prepare the national standard for heparin assay. The bulk material was dissolved with distilled water, distributed into ampoules and freeze-dried. The candidate sample(140817-201501) was assayed against the 6thinternational standard(07/328). Thirteen laboratories took part in the study. Three methods were used in the study, including anti-FIIa chromogenic assay, anti-FXa chromogenic assay and clot-based plasma assay. For the purpose of the continuity check between subsequent batch of national standard, the current heparin national standard for assay(150509-200912) was also included in the study.ResultsBased on the statistical analysis, the candidate gave low intra- and inter-laboratories variations, geometric coefficient variations were all less than 10%. Against the 6thinternational standard(07/328), Anti-FIIa potency of the candidate sample(140817-201501) was 2011 IU per ampoule, anti-FXa potency was 1998 IU per ampoule, anticoagulation potency was 1992 IU per ampoule. The results between three methods were not significant difference by statistics analysis. The results between international standard(07/328) and national standard(150509-200912) were not significant difference by statistics analysis. The continuity of the national standard of heparin is good.ConclusionAfter the examination of the expert committee on pharmaceutical standardization, the candidate(140817-201501) was approved as the national standard of heparin for assay with an assigned value 2011 IU per ampoule.

heparin; national standard; assay; collaborative study; chromogenic method; anti-FIIa potency; anti-FXa potency; anticoagulation potency

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.10.003

李京，女，主任藥師，研究方向：多糖類藥物質(zhì)量控制，E-mail：lijing317@nifdc.org.cn；范慧紅，通信作者，女，博士，研究員， 研究方向：生化藥物的質(zhì)量控制，E-mail：shihuayaoshi@126.com。

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