喬淦

（青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東青島　266042）

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文蛤抗腫瘤蛋白M ere15的表達純化及鑒定

喬淦

（青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東青島266042）

抗腫瘤蛋白Mere15是從海洋生物文蛤中獲得的抗腫瘤多肽。前期研究表明，Mere15具有顯著的體內(nèi)外抗腫瘤活性，但其在文蛤體液中含量極低。利用簡并引物技術(shù)克隆了Mere15的全基因序列，并在大腸桿菌中獲得高效表達。利用親和層析技術(shù)純化目的蛋白，經(jīng)透析除去鹽和超濾濃縮，獲得Mere融合蛋白，SDS-PAGE分析表明，目的蛋白分子量為33 kDa。MTT結(jié)果表明，目的蛋白對多種腫瘤細胞具有顯著的抑制作用，為海洋抗腫瘤蛋白研究提供了新的思路，對抗腫瘤新藥Mere15的開發(fā)應(yīng)用也有一定的價值。

文蛤；抗腫瘤多肽；重組表達；細胞毒活性

文蛤（Meretrix meretrix） 作為一味傳統(tǒng)中藥，在《傷寒雜病論》及《百草綱目》等記載文蛤具有活血化瘀、防寒止痛的功效。目前，從文蛤分離的化合物有多糖、糖肽、脂質(zhì)、?；撬?、多肽等［1-7］；文蛤提取物具有抗氧化、抗癌、抗糖尿病、抗炎、增強免疫等生物活性［2，8-17］。文蛤多肽類的抗癌活性研究中，范成成等人［18］提取的一種文蛤多肽Mer2具有廣譜的癌細胞抑制活性，調(diào)控癌細胞的凋亡、抑制癌細胞的生長。在本試驗前期分離的1種文蛤多肽Mere15［19］，通過多通路誘導(dǎo)肺癌細胞A549凋亡文蛤多肽抑制腫瘤細胞微管蛋白聚合。Mere15可以抑制微管蛋白的聚合，調(diào)控細胞周期蛋白的表達，阻滯細胞周期的正常發(fā)生，在多肽作用下肺癌細胞在G2/M時期停滯，抑制肺癌細胞的生長并促進細胞凋亡。

本試驗通過對Mere15多肽進行Edama降解法測序，測得一段序列。通過簡并引物技術(shù)克隆了Mere15相關(guān)基因，構(gòu)建工程菌，表達Mere15融合多肽，并研究了其對癌細胞的細胞毒作用。

1　材料與方法

1.1材料

文蛤，購買自青島河套海洋漁業(yè)發(fā)展有限公司；克隆載體Puc-19和表達載體Pet-28a，均購買自大連Takara公司；感受態(tài)菌株Top10和表達菌株BL21，均購買自全式金生物公司；總RNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、Fast HiFidelity PCR Kit聚合酶、膠回收試劑盒，均購買自北京天根生化科技有限公司；限制性內(nèi)切酶、連接酶，均購買自NEB；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑，均購買自Takara公司；PVDF膜，購自Milipore；抗-His抗體、羊抗鼠二抗及DNA Mark2000，均購買自碧云天生物技術(shù)有限公司；5 mLNi-NTA His Bind column，購買自GE公司；透析袋，購買自Sigama公司；其他常用化學(xué)用品均購買自國藥集團。

1.2方法

1.2.1抗腫瘤多肽Mere15基因克隆

Mere15 N端序列測定采用Edama降解法，由上海生工公司完成。文蛤總RNA提取，使用1 mL TRIZOL buffer處理文蛤組織，然后離心分離，按照試劑盒說明進行操作，最終使用TE buffer重懸RNA。以RNA模板合成cDNA，反應(yīng)體系參數(shù)按照反轉(zhuǎn)錄試劑說明書進行，反應(yīng)條件為42℃，15 min；85℃，30 s終止試驗。Mere15基因合成使用簡并引物技術(shù)，根據(jù)Mere15多肽序列比對分析結(jié)果，使用CODEHOP軟件設(shè)計簡并引物［20-21］。

M1：5'CGCCGAATTCATGGTNGTNTGYCCNGAY G3'；

M2：5'CCGAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTT3'

（R=A+G；Y=T+C；N=A+T+C+G；）

引物由上海生工合成，EcoRI及HindIII雙酶作為酶切設(shè)計用于載體構(gòu)建。Mere15基因克隆以cDNA為模板，反應(yīng)體系按照PCR反應(yīng)說明書要求進行，反應(yīng)條件按照Perkin Elmer的方法：94℃，2 min；94℃，15 s，58℃，10 s，68℃，30 s，共35個循環(huán)；68℃延伸5 min，獲得Mere15基因全長序列。將獲得條帶經(jīng)膠回收，純化得到目的基因片段。

1.2.2表達載體構(gòu)建

將目的基因與T載體（PUC19-Mere15），試驗方法按照載體說明書操作。構(gòu)建好的克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大腸桿菌DH5α，進行質(zhì)粒擴增，采用膠回收的方法純化PUC18-Mere15質(zhì)粒，測序驗證后將目的基因插入表達載體PET28，獲得表達載體成PET28-Mere15。

1.2.3Mere15融合蛋白誘導(dǎo)表達與純化

使用Ni離子親和柱（GE，Ni-NTA His Bind column）純化Mere15融合蛋白。PET28-Mere15質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21宿主菌，接種重組子在含有50 μg/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基中篩選陽性克隆，培養(yǎng)過夜。接種陽性重組子至含有50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，待菌體生長至對數(shù)期（OD=0.8）左右，使用1 m MIPTG，37℃，220 r/min誘導(dǎo)目的蛋白表達，4 h后高速離心收集菌體。使用100 mLLysis buffer（50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，10 mmol/L imidazole，pH值8.0） 重懸菌體，加入1 mmol/L苯甲基磺醯化氟、1%NP40及適量溶菌酶，進行超聲破碎細胞（工作2 s，暫停1 s），至細胞完全破碎，然后高速離心（12 000 r/min，10 min），取上清。經(jīng)Ni離子親和柱親和純化，上樣過程中收集穿透液（如圖2 A1），后使用15 mL Washing buffer（50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，20 mmol/L imidazole，pH值8.0）洗脫并收集雜蛋白（如圖2 A2）。使用20mL Elution buffer（50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，250 mmol/L imidazole，pH值8.0）洗脫并收集目的蛋白（如圖2 A3），然后使用SDS-PAGE鑒定蛋白表達純化。

1.2.4Mere15融合蛋白鑒定

取適量目的蛋白，使用15%SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)至0.45 μm PVDF膜，后使用5%小牛血清封閉PVDF膜1 h后，加入適量HIS抗體稀釋液（1∶1 000），4℃層析柜中孵育過夜，TBST（19 mmol/L Tris-HCl，2.7 mmol/L KCl，137 mmol/L NaCl，0.1% Tween 20，pH值8.0）緩沖液漂洗PVDF膜3次，每次5 min，然后加入適量過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗（1∶2 000），室溫孵育1 h后，使用TBST漂洗膜3次，每次5 min。使用ECL化學(xué)發(fā)光的方法檢測融合蛋白印跡。

1.2.5MTT法測定細胞抑制率

取對數(shù)期細胞A549及PNC28，然后細胞密度稀釋至2×104個，按照每孔190 μL接種于96孔板，培養(yǎng)24 h；然后加入10 μL的重組蛋白，按照20，40，80，160 μg/mL的最終濃度加入各孔，空白組加入10 μL培養(yǎng)基，每組設(shè)3個復(fù)孔。置于5%CO2，37℃條件下培養(yǎng)24 h，然后在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并記錄，每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL）。放入細胞培養(yǎng)箱中4 h后，棄去培養(yǎng)基，加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），水平振蕩10 min；然后使用酶標(biāo)儀測定各孔于570 nm處吸光度，每組取平均值計算多肽對細胞的抑制活性。

2　結(jié)果與分析

2.1目的基因鑒定

分子印跡檢測見圖1。

圖1　分子印跡檢測

使用簡并引物技術(shù)擴增目的基因，根據(jù)Mere多肽的N端序列，經(jīng)數(shù)據(jù)庫Blast比對得到Mere同源蛋白序列，然后根據(jù)簡并引物設(shè)計原則克隆目的基因。目的基因擴增結(jié)果如圖1 A所示，目的基因片段在850 bp左右，通過比對PET-Mere15序列與Mere15蛋白測序結(jié)果，確定其序列一致，重組子構(gòu)建符合設(shè)計。PUC19-Mere15載體的雙酶切如圖1 B，表達載體PET28-Mere15的雙酶切凝膠如圖1 C，目的基因在850 bp左右，和克隆基因的分子大小一致，符合預(yù)測值。而天然分離的Mere15分子大小在15 kDa左右，融合的大小則為33 kDa。理論上，融合蛋白只增加了6個組氨酸標(biāo)簽并沒有改變蛋白序列，蛋白之間差異可能是Mere15 RNA剪接發(fā)生而產(chǎn)生分子量不同的蛋白。

2.2Mere15多肽表達純化

蛋白純化系統(tǒng)純化過程1，2，3樣品吸光度見圖2，3樣品SDS-PAGE結(jié)果見圖3，免疫印跡蛋白見圖4。

圖2　蛋白純化系統(tǒng)純化過程1，2，3樣品吸光度

圖3　3樣品SD S-PAG E結(jié)果

圖4　免疫印跡蛋白

結(jié)果表明，目的蛋白主要存在于包涵體中，超聲破碎包涵體以獲得目的蛋白。使用Ni離子柱對目的蛋白進行親和純化，蛋白純化流程如圖2，其中穿透液（1）、雜蛋白洗脫液（2）、目的蛋白洗脫液（3）。由圖3可知，目的蛋白的分子大小在33 kDa左右，和預(yù)計結(jié)果一致。從結(jié)果中可以看出，目的組分中有少許雜蛋白，但目的產(chǎn)物純度為95%以上，雜蛋白對蛋白影響較小，目的蛋白可以用于細胞活性測定。由圖4可知，在33 kDa大小左右有1條明顯印跡條帶，說明有融合蛋白成功表達。使用超濾設(shè)備對目的蛋白濃縮除鹽，最終使用PBS緩沖溶液稀釋Mere15融合蛋白至5 mg/mL。

2.3重組蛋白對腫瘤細胞生長的抑制作用

24 h后A549細胞形態(tài)變化見圖5，24 h后PNC28細胞形態(tài)變化見圖6。

圖5　24 h后A549細胞形態(tài)變化

圖6　24 h后PN C 28細胞形態(tài)變化

采用MTT法測定了重組蛋白對A549及PNC28生長的抑制作用，蛋白多肽對2種細胞的抑制活性在160 μg/mL質(zhì)量濃度下抑制率分別為43.7%，44.6%。在多肽處理24 h后，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)如圖5和圖6，空白組的細胞形態(tài)呈緊密排列，狀態(tài)良好，而隨著蛋白質(zhì)量濃度的升高，細胞的形態(tài)出現(xiàn)了變化，多肽質(zhì)量濃度越高細胞狀態(tài)變化越大。細胞由規(guī)則的形態(tài)逐漸變化為體積縮小直至成為細胞碎片，細胞胞漿固縮并出現(xiàn)明顯的空泡狀結(jié)構(gòu)。細胞之間的空隙逐漸增大，貼壁能力變?nèi)?，呈現(xiàn)一定的凋亡特征，說明多肽對癌細胞具有一定的抑制作用。多肽的抑制活性隨著蛋白質(zhì)量濃度梯度增加，說明藥物活性和多肽質(zhì)量濃度有較強的依賴關(guān)系。

3　討論

多肽生物活性的研究中，多數(shù)多肽表現(xiàn)出一定的抗腫瘤活性，如趙進［22］發(fā)現(xiàn)的海鞘多肽CS5931，通過作用于細胞表面的烯醇化酶（Enolase） 相互作用，抑制Enolase的活性，從而抑制癌細胞的正常代謝功能，誘導(dǎo)細胞凋亡。阮之平等人［23］分離出一種蟾蜍多肽的試驗表明，蟾蜍活性多肽可能通過下調(diào)周期相關(guān)基因cyclin B，CDK1的表達阻滯腫瘤細胞周期于G2/M期檢查點。對凋亡誘導(dǎo)的作用可能與凋亡相關(guān)基因Survivin，Caspase-3表達和bcl/bak表達的比值上調(diào)有關(guān)。另外，莊海峰等人［24］分離的一種蝎毒多肽對急性淋巴癌細胞的研究中，結(jié)果表明蝎毒多肽可有效抑制HL-60細胞的增殖，并誘導(dǎo)細胞凋亡，其機制可能是多肽參與HL-60細胞內(nèi)p53基因的表達調(diào)控，抑制Bcl-2基因的表達有關(guān)。

Mere15是一種從文蛤分離天然多肽，在前期研究中文蛤多肽具有靶向調(diào)控肺癌細胞凋亡的作用，在Mere15多肽處理癌細胞后，細胞周期停滯在G2/M期，阻滯細胞周期的正常發(fā)生，并通過調(diào)控細胞周期蛋白p21的表達及抑制微管蛋白的聚合，從而抑制細胞正常代謝及有絲分裂功能，促進細胞凋亡的發(fā)生。本試驗中克隆的Mere15相關(guān)基因約為使用原核表達的方法得到Mere15的融合蛋白，Mere融合蛋白大小約為33 kDa左右，與分離的天然文蛤蛋白Mere15分子量有一定差異，分離的 Mere多肽在45 μg/mL的抑制活性為77%，而表達的融合蛋白細胞活性（43.6%）降低，產(chǎn)生這個結(jié)果的原因可能是融合蛋白的分子量較大，蛋白的結(jié)構(gòu)改變掩蓋了蛋白的活性位點。天然多肽可能是由融合多肽基因剪接而得到的一種小分子多肽。目前的試驗表明，大分子Mere15融合多肽具有一定的抑癌活性，下一階段將對融合蛋白的基因截取小片段后再融合表達，通過研究小片段多肽活性及機制，尋找抗癌藥物的新靶點。

［1］蔣金來，王令充，吳皓，等.雙酶水解四角蛤蜊工藝優(yōu)化研究 ［J］.食品工業(yè)科技，2013，34（2）：214-217.

［2］Saravanan R，Vairamani S，Shanmugam A.Glycosaminoglycans from marine clam Meretrix meretrix（Linne）. are an anticoagulant［J］.Preparative Biochemistry&Biotechnology，2010，40（4）：305-315.

［3］李莉，錢建瑛，嚴曉丹，等.文蛤多糖的提取，分離純化及結(jié)構(gòu)表征 ［C］.全國第九屆海洋生物技術(shù)與創(chuàng)新藥物學(xué)術(shù)會議論文摘要集，2014：80-87.

［4］冷波，陳蕓蕓，鄭藝梅，等.胰蛋白酶酶解文蛤制備文蛤多肽的研究 ［J］.漳州師范學(xué)院學(xué)報（自然科學(xué)版），2012，25（2）：90-95.

［5］龔麗芬，陳碧娥，鄭志福.從文蛤提取牛磺酸的工藝 ［J］.華僑大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2003，24（3）：300-304.

［6］吳杰連，羅珊珊，方海紅.文蛤糖肽MGP0501的分離純化及性質(zhì)鑒定 ［J］.氨基酸和生物資源，2013（2）：41-45.

［7］Yue X，Liu B，Sun L，et al.Cloning and characterization of a hsp70 gene from Asiatic hard clam Meretrix meretrix which is involved in the immune response against bacterial infection［J］.Fish&Shellfish Immunology，2011，30（3）：791-799.

［8］宋文靜.文蛤蛋白水解制備抗氧化活性肽的研究 ［J］.云南民族大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2014，23（3）：172-177.

［9］Heo S J，Yoon W J，Kim K N，et al.Evaluation of anti-inflammatory effect of fucoxanthin isolated from brown algae in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 macrophages［J］. Food and Chemical Toxicology，2010，48（8）：2 045-2 051.

［10］張賽樂，王雪鵬，閆茂倉，等.文蛤抗菌物質(zhì)的粗提及活性檢測 ［J］.山東畜牧獸醫(yī)，2014，35（7）：3-5.

［11］竇昌貴，黃芳.文蛤多糖抗癌免疫藥理作用的研究 ［J］.中國海洋藥物，1999，18（2）：15-19.

［12］康勁翮，范成成，張劍，等.文蛤活性多肽對肺癌A549的細胞生物學(xué)效應(yīng)及酶學(xué)效應(yīng)的研究 ［J］.華東六省一市生物化學(xué)與分子生物學(xué)會2008年學(xué)術(shù)交流會論文摘要匯編，2008：201-203.

［13］王惠.文蛤多肽Mere15的抗腫瘤機制研究 ［D］.青島：中國科學(xué)院研究生院（海洋研究所），2012.

［14］王曉潔，史倩，張晨晨，等.中國蛤蜊水提取物對小鼠急性肝損傷的保護作用 ［J］.食品科學(xué)，2011，32（19）：205-208.

［15］吳杰連，徐珊，羅珊珊，等.文蛤糖肽MGP0501體內(nèi)抗腫瘤活性 ［J］.南昌大學(xué)學(xué)報（理科版），2014，38（5）：492-497.

［16］Ning X，Zhao J，Zhang Y，et al.A novel anti-tumor protein extracted from Meretrix meretrix（Linn）. induces cell death by increasing cell permeability and inhibiting tubulin polymerization［J］.International Journal of Oncology，2009，35（4）：805-812.

［17］嚴曉丹，錢建瑛，許泓瑜，等.文蛤不同極性提取物對糖尿病小鼠降血糖作用的研究 ［J］.中國海洋藥物，2015，34（5）：71-76.

［18］范成成，張劍，康勁翮，等.文蛤多肽的體外抗癌活性研究 ［J］.臺灣海峽，2009，28（4）：472-476.

［19］Wang H，Wei J，Wu N，et al.Mere15，a novel polypeptide from Meretrix meretrix，inhibits adhesion，migration and invasion of human lung cancer A549 cells via down-regulating MMPs［J］.Pharmaceutical Biology，2013，51（2）：145-151.

［20］逄曉陽，刑鑫，劉國文，等.用CODEHOP設(shè)計簡并引物克隆反芻月形單胞菌K6乙酸激酶基因片段 ［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報，2010（1）：102-106.

［21］孫輝，祝建波.利用簡并引物克隆天山雪蓮sikPIP基因片段及RNAi載體的構(gòu)建 ［J］.生物技術(shù)通報，2010（6）：107-112.

［22］趙進.薩氏海鞘多肽CS5931的克隆，表達，純化及其抗腫瘤機制研究 ［D］.青島：中國科學(xué)院研究生院，2013.

［23］阮之平，田濤，焦敏，等.蟾蜍活性多肽對不同腫瘤細胞的抗癌功能及機制研究 ［J］.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2015，23（15）：2 100-2 104.

［24］莊海峰，鄭智茵，莊曉芬，等.蝎毒抗癌多肽對 HL-60細胞凋亡及Bcl-2和p53基因表達的影響 ［J］.浙江醫(yī)學(xué)，2014（8）：656-658.◇

Cloning Experession and Cytotoxicity of Antitumor Protein from Meretrix Meretrix

QIAO Gan
（Colege of Chemical Engineering，Qingdao University of Science and Technology，Qingdao，Shandong 266042，China）

In the precious study，an antitumor protein，called Mere15 is isolated form Meretrix meretrix.The polypeptide could effectively inhibit the cancer proliferation both in vitro and in vivo.However，the content of the polypeptide in the species is very low.In the present study，the cDNA sequence is cloned and the polypeptide is expressed in E.coli.The antitumor protein is purified to homogeneity with molecular 33 kDa.MTT assay revealed that the recombinant protein displayed potent cytotoxicity to several cancer cells.The study develop an novel strategy for the production of antitumor protein from marine organisms，and the work is also important for developing Mere15 as an novel anticancer agent.

Meretrix meretrix；anticancer protein；cloning and expression；cytotoxicity

G420

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.07.013

1671-9646（2016）07a-0044-04

2016-05-09

國家自然科學(xué)基金（81573457）。

喬淦（1989— ），男，碩士，研究方向為生物藥物。