楊會(huì)會(huì)，周志強(qiáng)，韓二芳，王　娟，劉　欣

（河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，河南鄭州　451450）

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原子吸收光譜法測(cè)定血清中不同化學(xué)形態(tài)的鈷與鎳

楊會(huì)會(huì)，周志強(qiáng)，韓二芳，王娟，劉欣

（河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，河南鄭州451450）

采用乙醇低溫（4℃）沉淀蛋白法，將血清中的鈷、鎳分為結(jié)合態(tài)和非結(jié)合態(tài)，利用石墨爐原子吸收光譜法靈敏度高、取樣量少的優(yōu)點(diǎn)，測(cè)定血清中的鈷、鎳2種元素的總量及非結(jié)合態(tài)含量，通過(guò)差減法求出血清中結(jié)合態(tài)元素含量，從而建立鈷、鎳2種元素化學(xué)形態(tài)的分離分析方法。以胎牛血清為例，詳細(xì)研究了儀器工作條件的優(yōu)化、沉淀劑種類及用量的選擇、測(cè)定方法準(zhǔn)確度的考察和測(cè)定方法的精密度及檢出限。結(jié)果表明，該方法鈷、鎳的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為4.5%和2.5%，加標(biāo)回收率分別為84%～98%和91%～94%，檢出限分別為6.36，8.60 μg/L，測(cè)定結(jié)果可靠。

石墨爐原子吸收；胎牛血清；鈷；鎳；化學(xué)形態(tài)

隨著醫(yī)學(xué)事業(yè)的發(fā)展及病理學(xué)研究的日益深入，微量元素與生物體健康之間關(guān)系的研究不斷有新發(fā)現(xiàn)，很多疾病都與生物體內(nèi)微量元素的比例失調(diào)有關(guān)。

鈷、鎳均為生物體必需的微量元素，對(duì)生物體的細(xì)胞代謝、生物合成及生理功能起著重要的作用，并可以對(duì)內(nèi)分泌功能等產(chǎn)生影響［1-3］。因?yàn)椴煌⒘吭氐幕瘜W(xué)形態(tài)生物效應(yīng)差別很大，它們決定了元素在生物體內(nèi)的化學(xué)行為，表現(xiàn)不同的效應(yīng)。因此，對(duì)微量元素作用的研究，不僅要對(duì)其總量進(jìn)行分析，更重要的是對(duì)微量元素存在形態(tài)進(jìn)行研究。然而，目前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)C(jī)體內(nèi)微量元素的研究主要集中于總量的測(cè)定，對(duì)生物體內(nèi)微量元素不同的化學(xué)形態(tài)研究還很少。原子吸收光譜法雖是測(cè)定微量元素應(yīng)用最廣泛的方法，但應(yīng)用原子吸收光譜法測(cè)定血清中不同化學(xué)形態(tài)的鈷、鎳還未見(jiàn)報(bào)道。

對(duì)微量元素測(cè)定，可應(yīng)用火焰原子吸收光譜法和石墨爐原子吸收光譜法。因血清中鈷、鎳含量均較低，所以本文利用石墨爐原子吸收光譜法靈敏度高、取樣量少的優(yōu)點(diǎn)，測(cè)定血清中的鈷、鎳含量。通過(guò)對(duì)血清中鈷、鎳2種元素不同形態(tài)測(cè)定方法的研究，建立了生物體內(nèi)結(jié)合態(tài)與非結(jié)合態(tài)微量元素Co和Ni測(cè)定的方法，能為探索這些微量元素與生物體的健康關(guān)系提供更多的信息，進(jìn)而為Co和Ni所導(dǎo)致一些疾病的治療提供幫助。

1　試驗(yàn)部分

1.1試劑及儀器

濃硝酸（分析純），TritonX-100；無(wú)水乙醇（分析純），0.2%TritonX-100和硝酸混合液（取1.0 mLTritonX-100和1.0 mL硝酸，用水稀釋到500 mL容量瓶中）；Co和Ni的標(biāo)準(zhǔn)溶液（儲(chǔ)備液為1 g/L）；胎牛血清，鄭州佰安生物工程有限公司提供；SPDUO 240FS/240Z型原子吸收光譜儀，美國(guó)瓦里安公司產(chǎn)品；H2500R-2型離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2試驗(yàn)過(guò)程

1.2.1樣品處理

（1）血清中Co和Ni總量。取-20℃環(huán)境下保存的血清樣品2.5 mL于25 mL容量瓶中，用0.2% TritonX-100和硝酸的混合液定容。

（2）血清中非結(jié)合態(tài)Co和Ni含量。取1支聚乙烯試管，加入0.8 mL胎牛血清，4.8 mL無(wú)水乙醇，2.4 mL混合溶液。靜置一夜后于轉(zhuǎn)速15 000 r/min下離心，溫度4℃，時(shí)間10 min。連續(xù)離心2次，以保證離心充分。上層清液，即制備的血清樣品中元素的非結(jié)合態(tài)樣品溶液。

1.2.2儀器工作條件

波長(zhǎng)240.8 nm，通帶0.2 nm，燈電流10 mA，氬氣流量200 mL/min，原子化階段停氣。石墨爐Co升溫程序的為干燥（85℃，保持5 s；95℃，保持40 s；120℃，保持10 s）、灰化（963℃，5s）、原子化（2 459℃，5 s）、除殘（2 800℃，3 s），Ni的升溫程序?yàn)楦稍铮?5℃，保持5 s；95℃，保持40 s；120℃，保持10 s）、灰化（1 021℃，5 s）、原子化（2 292℃，5 s）、除殘（2 800℃，3 s）。

2　結(jié)果與討論

2.1干燥條件優(yōu)化

移取2.5 mL胎牛血清至25 mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋定容，將其作為母液。用1%TritonX-100和硝酸混合液稀釋成0.2%的溶液作為制備液（把2種溶液分別放在自動(dòng)進(jìn)樣器樣品盤的相應(yīng)位置，分析時(shí)自動(dòng)進(jìn)樣裝置會(huì)將上述2種溶液按一定比例混合，組成與樣品基體的黏度、表面張力大致相同的溶液，以便較準(zhǔn)確考察干燥時(shí)的情況。），然后在儀器軟件的引導(dǎo)下（第1步，85℃，5 s；第2步，95℃，40 s；第3步，120℃，10 s）進(jìn)行干燥。通過(guò)石墨爐視頻畫(huà)面觀察干燥的效果，發(fā)現(xiàn)在給定的干燥溫度及時(shí)間下，溶劑可以完全蒸發(fā)，灰化時(shí)無(wú)液體飛濺現(xiàn)象，所以儀器軟件引導(dǎo)下的干燥步驟、溫度和時(shí)間是合適的。

2.2灰化和原子化溫度及時(shí)間

取適量Co和Ni的標(biāo)準(zhǔn)溶液，逐級(jí)稀釋至質(zhì)量濃度為20 μg/L，作為母液。移取20 mL混液至100 mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋定容，作為制備液。利用儀器的表面響應(yīng)動(dòng)力學(xué)向?qū)Э傻玫紺o2+和Ni2+灰化和原子化溫度及時(shí)間的優(yōu)化程序，在該程序下儀器自動(dòng)測(cè)定工作，并給出測(cè)定結(jié)果和優(yōu)化圖。

Co2+灰化和原子化溫度及時(shí)間的優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)圖1，Ni2+灰化和原子化溫度及時(shí)間的優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖1　C o2+灰化和原子化溫度及時(shí)間的優(yōu)化結(jié)果

圖2　N i2+灰化和原子化溫度及時(shí)間的優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)圖1，儀器自動(dòng)給出Co的最佳工作條件為灰化溫度963℃，原子化溫度2 459℃。根據(jù)圖2，Ni的最佳工作條件為灰化溫度1 021℃，原子化溫度2 292℃。

2.3沉淀劑的選擇

結(jié)合態(tài)與非結(jié)合態(tài)測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度在一定程度上取決于蛋白質(zhì)的分離狀況，選擇合適的沉淀劑是非常重要的。目前，蛋白質(zhì)的沉淀主要有鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法、重金屬鹽析法、生物堿試劑和某些酸沉淀法以及加熱變性沉淀法等。

血清中Co的存在形式主要有與生物大分子結(jié)合的生物金屬和自由離子，即結(jié)合態(tài)與非結(jié)合態(tài)。使用蛋白沉淀劑把血清中的蛋白沉淀，結(jié)合態(tài)的微量元素隨蛋白質(zhì)進(jìn)入沉淀中，上清液中剩下的元素即為非結(jié)合態(tài)。如果采用鹽析法、重金屬鹽析法、生物堿試劑和某些酸沉淀法、加熱變性沉淀法，都會(huì)向樣品中引入其他元素，從而給測(cè)定帶來(lái)不可預(yù)知的影響。所以，本試驗(yàn)選用有機(jī)溶劑沉淀法，因甲醇與丙酮毒性均比乙醇大，故而乙醇是較為理想的沉淀劑。同時(shí)，由文獻(xiàn)［4］可知乙醇低溫沉淀蛋白法不僅完全且溫和，對(duì)結(jié)合態(tài)的元素影響較小，且取材容易、操作簡(jiǎn)單、成本低廉、耗時(shí)短、可重復(fù)性好。因而，本試驗(yàn)選用乙醇作為沉淀劑。

2.4沉淀劑用量的選擇

取4支具塞聚乙烯試管，編號(hào)為1，2，3，4，分別加入0.80 mL血清樣品，依次加入乙醇4.00，4.40，4.80，5.20 mL，加水定容至8.00 mL，使乙醇體積分?jǐn)?shù)一次達(dá)到50%，55%，60%，65%，血清濃度均為10%。

靜置一夜后，用湘儀離心機(jī)進(jìn)行離心，條件為轉(zhuǎn)速15 000 r/min，溫度4℃，時(shí)間10 min，連續(xù)離心2次，以保證離心充分。取上層清液，用石墨爐在優(yōu)化條件下測(cè)定Co和Ni的含量。因乙醇中本身含有少量的Co和Ni，需測(cè)定空白乙醇中2種元素的含量。

胎牛血清中Co和Ni的含量見(jiàn)表1。

表1　胎牛血清中C o和N i的含量/μg·L-1

由表1可知，對(duì)于Co而言，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，分離結(jié)合態(tài)與非結(jié)合態(tài)的效果最好。因而，本試驗(yàn)采用60%乙醇為沉淀劑分離血清，測(cè)定非結(jié)合態(tài)中Co的含量。對(duì)于Ni而言，測(cè)定結(jié)果均為負(fù)值，分析發(fā)現(xiàn)原因主要為無(wú)水乙醇中Ni含量太高，經(jīng)蒸餾后仍無(wú)法消除，使背景吸收較大，而胎牛血清中Ni含量本就較低，致使元素Ni的測(cè)定不準(zhǔn)確。

2.5工作曲線

分別配制Co和Ni的標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其質(zhì)量濃度分別達(dá)到0，3.00，6.00，9.00，15.00 μg/L，測(cè)定其吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)空白樣品低質(zhì)量濃度加標(biāo)試驗(yàn)，按照樣品處理方法平行分析7份空白加標(biāo)樣品，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算Co和Ni的方法檢出限。

Co和Ni的標(biāo)準(zhǔn)曲線與方法檢出限見(jiàn)表2。

表2　C o和N i的標(biāo)準(zhǔn)曲線與方法檢出限

2.6方法的加標(biāo)回收率和精密度

Co和Ni的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見(jiàn)表3。

在空白樣品中，加Co和Ni標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照樣品處理方法處理后用原子吸收進(jìn)行測(cè)定。平行測(cè)定7次，得到Co和Ni的回收率及樣品結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。方法回收率和精密度滿足樣品分析要求。

表3　C o和N i的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.7胎牛血清中Co和Ni含量測(cè)定

按照試驗(yàn)優(yōu)化過(guò)的樣品前處理和測(cè)定參數(shù)對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，胎牛血清中結(jié)合態(tài)Co的含量=血清中Co的總含量-非結(jié)合態(tài)Co的含量。

血清中不同形態(tài)Co和Ni的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

表4　血清中不同形態(tài)C o和N i的測(cè)定結(jié)果/μg·L-1

3　結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)配制合適質(zhì)量濃度的母液，利用石墨爐的表面響應(yīng)動(dòng)力學(xué)向?qū)В瑑?yōu)化Co和Ni的工作條件；選用乙醇作為沉淀劑，通過(guò)測(cè)定不同體積分?jǐn)?shù)乙醇下血清分離情況，得出乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)分離效果最好。在優(yōu)化條件下，測(cè)定血清中Co和Ni含量及非結(jié)合態(tài)10%血清中元素含量，通過(guò)差減法求出結(jié)合態(tài)元素含量。結(jié)果表明，Co的RSD為4.5%，回收率在84%～98%；Ni的RSD為2.5%，回收率91%～94%，方法可靠，結(jié)果較為可信，為探索這些微量元素與生物體的健康關(guān)系提供更多的信息，進(jìn)而為Co和Ni所導(dǎo)致一些疾病的治療提供幫助。

［1］汪紅梅.過(guò)敏性鼻炎患者血清中鉻鈷鎳釩鉬含量的研究 ［J］.內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)雜志，2008，40（1）：102-103.

［2］苗懿德，劉杰，劉曉瑞.健康老年人與糖尿病患者血清10種元素測(cè)定比較 ［J］.微量元素與健康研究，2001，18（3）：23-24.

［3］劉巨濤，朱志國(guó)，年瑞華，等.中老年糖尿病輕重度患者血清中的鐵鉻鈷鎳 ［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2000，20（1）：87-88.

［4］胡軍，常耀明，高雙斌.原子吸收光譜法測(cè)定血清中不同化學(xué)形態(tài)的銅鐵鋅 ［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2008，28（3）：700-703.◇

Determination of Different Chemical Form of Co and Ni in Fetal Bovine Serum by Atomic Absorption Spectrometry

YANG Huihui，ZHOU Zhiqiang，HAN Erfang，WANG Juan，LIU Xin
（He'nan Vocational College of Agriculture，Zhengzhou，He'nan 451450，China）

Separate cobalt and nickel in the serum into the forms of combination and non-combination by the use of ethanol at low temperature（4℃） protein precipitation method.Because the sensitivity of GFAAS is high and the sampling is low，this study uses it to analysis the total amount of Co and Ni in serum and the amount of the forms of non-combination.The amount of the forms of combination of Co and Ni is obtained by calculation，so as to establish two chemical forms of Co and Ni separation element analysis method.Take fetal bovine serum for example，a detailed study are as follow：working conditions for the choice of instruments，the type and amount of precipitation agent of choice，determination of the accuracy of the inspection，determination of precision and seizure the limited.The results show that the cobalt and nickel，respectively，the relative standard deviation of 4.5%and 2.5%，and recovery are 84%～98%and 91%～94%，respectively，the detection limit 6.36，8.60 μg/L.The result is accurate and reliable.

GFAAS；fetal bovine serum；cobalt；nickel；chemical form

P618.63

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.07.018

1671-9646（2016）07a-0059-03

2016-04-12

楊會(huì)會(huì)（1987— ），女，碩士，助教，研究方向?yàn)槭称放c環(huán)境分析。