姚春紅　袁新初　劉　沖　鄧建平

(武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 武漢430081)

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miRNA-15a在前列腺癌中的表達(dá)及診斷意義

姚春紅袁新初劉沖①鄧建平①

(武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 武漢430081)

①湖北省黃石市愛康醫(yī)院，黃石435000。

目的：檢測(cè)前列腺癌患者miRNA-15a的表達(dá)情況，探討其在前列腺癌診斷的意義。方法：選擇2014年1月至2015年1月本院泌尿外科收治的前列腺癌患者血清及腫瘤組織36例，良性前列腺增生患者(Prostatic hyperplasia，BPH)血清40例，健康對(duì)照血清40例。miRNA-15a表達(dá)采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time PCR)技術(shù)檢測(cè)。結(jié)果：miRNA-15a在前列腺癌患者、良性前列腺增生患者和健康對(duì)照血清的表達(dá)量分別為(0.193±0.081)、(0.359±0.04)和(0.376±0.037)，miRNA-15a在前列腺癌患者血清中的表達(dá)量顯著低于良性前列腺增生患者和健康對(duì)照(P<0.05)，在BPH組和對(duì)照組中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，前列腺癌患者血清miRNA-15a表達(dá)在不同PSA表達(dá)水平、Gleason評(píng)分、臨床分期、有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與其他病理因素?zé)o關(guān)(P>0.05)；前列腺癌患者腫瘤組織中的miRNA-15a的表達(dá)與PSA表達(dá)水平、Gleason評(píng)分、臨床分期、有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與其他病理因素?zé)o關(guān)(P>0.05)。結(jié)論：miRNA-15a低表達(dá)參與了前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程，是前列腺癌輔助診斷及治療的潛在的指標(biāo)。

前列腺癌；良性前列腺增生；miRNA-15a

前列腺癌是男性中最常見的惡性腫瘤，是男性因癌癥死亡的第二大原因，發(fā)病率隨年齡增長(zhǎng)而升高[1,2]。前列腺癌早期通常沒有癥狀，只有當(dāng)腫瘤阻塞尿道、膀胱頸時(shí)，發(fā)生類似下尿道梗阻或刺激癥狀，才引起注意。因此早期診斷和早期治療是決定腫瘤患者治愈率及預(yù)后的一個(gè)重要因素，尋找可靠、有效的分子標(biāo)記物來指導(dǎo)前列腺癌的診斷和預(yù)后分析仍然是臨床上研究的熱點(diǎn)[3]。微小RNA(miRNA)是一種大小為22 nt左右的非編碼單鏈小分子。其通過與靶基因互補(bǔ)配對(duì)，在翻譯水平調(diào)控基因的表達(dá)，在細(xì)胞的增殖和凋亡、器官形成、發(fā)育等生命過程中發(fā)揮著重要的作用[4]。miRNA-15a定位于人類染色體13q14.2，屬于miRNA-15家族，研究表明miR-15a在腫瘤中表達(dá)缺失或下調(diào)。本研究檢測(cè)了前列腺癌患者miRNA-15a表達(dá)的情況，探討其與前列腺癌的關(guān)系，研究其對(duì)前列腺癌診斷的價(jià)值，并分析miRNA-15a的表達(dá)水平與PCa臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對(duì)象選擇2014年1月至2015年1月本院泌尿外科收治的前列腺癌患者36例，年齡49～73歲，平均(63.44±6.41)歲，其中患者年齡≥60歲24例，<60歲12例；腫瘤按TMM(2012AJCC)分期：Ⅰ期15例，Ⅱ期6例，Ⅲ期10例，Ⅳ期5例；病理按Gleason評(píng)分分級(jí)：高分化腺癌(Gleason 2～6分)24例，中分化腺癌(Gleason 7分)7例，低分化腺癌(Gleason 8～10分)5例。BPH患者30例，平均年齡(61.6±8.1)歲，對(duì)照者為40例健康體檢男性血清，年齡22～55歲，平均(35.7±18.34)歲。所有標(biāo)本-80℃保存。所有疾病術(shù)前未做任何治療、放療和化療。

1.1.2主要試劑和儀器Trizol、RNA提取試劑盒、M- MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自大連寶生物科技公司，Has-miRNA-15a莖環(huán)引物由上海吉瑪生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成，Real-time PCR儀為美國(guó)羅氏公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本收集與處理采集患者靜脈血2 ml，3 000 r/min離心10 min，吸取上清于2 ml離心管中，再次12 000 r/min離心2 min，吸取上層無細(xì)胞血清200 μl，置于-80℃ 低溫冰箱內(nèi)保存待測(cè)。采用Trizol試劑從血清樣本中提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)RNA濃度及純度，取吸光度比值為1.8～2.1的樣品用于后續(xù)試驗(yàn)。蠟塊組織標(biāo)本RNA抽提按照 Trizol 說明書進(jìn)行。取200 ng總RNA，M- MLV逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為20 μl，包括10×緩沖液2 μl，M-MLV(10 U/μl)0.4 μl，引物(400 nmol/L)0.5 μl，RNA 酶抑制劑(40 U/μl)0.6 μl，dNTP混合物(2.5 mol/L)2 μl，補(bǔ)超純水至20 μl。 反應(yīng)條件為 16℃30 min，42℃30 min，85℃10 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，產(chǎn)物置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2SYBRGreen法檢測(cè)miRNA-15a表達(dá)水平加入1 mlTrizol，按照試劑盒說明提取細(xì)胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物和M- MLV逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄，TaqDNA聚合酶、Has-miRNA-15a莖環(huán)引物和SYBRGreen熒光染料定量檢測(cè)miRNA-15a的表達(dá)量。Has-miRNA-15a莖環(huán)引物序列為：上游序列5′-GCTGTGGAGAGAAAGGCAGTCTG-3′；下游序列5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。其中以U6作為內(nèi)參引物，其上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。相對(duì)表達(dá)量計(jì)算公式為RQ=2-△△CT。

2　結(jié)果

2.1前列腺癌、良性前列腺增生患者和正常對(duì)照的血清miR-15a表達(dá)水平 miRNA-15a在前列腺癌患者、良性前列腺增生患者和健康對(duì)照血清的表達(dá)量分別為(0.193±0.081)、(0.359±0.04)和(0.376±0.037)。miRNA-15a在前列腺癌患者的表達(dá)量顯著低于良性前列腺增生患者和健康對(duì)照的血清miR-15a表達(dá)水平(P<0.05)，良性前列腺增生患者和健康對(duì)照的血清miR-15a表達(dá)水平無顯著性差異(P>0.05)。如圖1。

2.2前列腺癌患者血清miRNA-15a表達(dá)變化與PCa 臨床病理參數(shù)的相關(guān)性將前列腺癌患者年齡、PSA表達(dá)水平、Gleason評(píng)分、臨床分期、有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移進(jìn)行分組，結(jié)果顯示積分≥7分組與<7分組miRNA-15a的表達(dá)量分別為(0.256±0.06)和(0.162±0.071)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。血清miRNA-15a表達(dá)水平與臨床分期相關(guān)(P<0.05)，隨著臨床分期的增加，miRNA-15a的表達(dá)水平降低。骨轉(zhuǎn)移的前列腺癌miRNA-15a表達(dá)量與未轉(zhuǎn)移者相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但miRNA-15a表達(dá)量與PSA水平無關(guān)(均P>0.05)，見表1。

2.3前列腺癌患者腫瘤組織中miRNA-15a表達(dá)變化與PCa 臨床病理參數(shù)的相關(guān)性將前列腺癌患者年齡、腫瘤大小、PSA表達(dá)水平、Gleason評(píng)分、臨床分期、有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等進(jìn)行分組，結(jié)果顯示腫瘤患者PSA 表達(dá)量<10與≥10的患者腫瘤組織中的表達(dá)量分別為(0.440±0.178)和(0.304±0.185)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；積分≥7分組與<7分組miRNA-15a的患者腫瘤組織中的表達(dá)量分別為(0.418±0.137)和(0.299±0.171)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。血清miRNA-15a表達(dá)水平與臨床分期相關(guān)(P<0.05)，隨著臨床分期的增加，miRNA-15a的表達(dá)水平降低。骨轉(zhuǎn)移的前列腺癌miRNA-15a表達(dá)量與未轉(zhuǎn)移者相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但miRNA-15a表達(dá)量與其他病理參數(shù)無關(guān)(均P>0.05)，見表2。

圖1　前列腺癌、良性前列腺增生患者和正常對(duì)照的血清miR-15a表達(dá)水平Fig.1　Benign prostatic hyperplasia,prostate cancer patients and normal controls expression level of serum miR-15aNote: MiRNA-15a amount of expression in prostate cancer patients was significantly lower than patients with benign prostatic hyperplasia and expression level of serum miR-15a in healthy controls(P<0.05),patients with benign prostatic hyperplasia and expression level of serum miR-15a in healthy controls there was no significant difference(P>0.05).

表1　前列腺癌患者血清miRNA-15a表達(dá)水平與臨床參數(shù)的相關(guān)性Tab.1　Correlation between expression of serum miRNA-15a and clinicopathological parameters in prosta-te cancer

表2　前列腺癌患者腫塊miRNA-15a表達(dá)水平與臨床參數(shù)的相關(guān)性Tab.2　Correlation between expression of tumor miRNA-15a and clinicopathological parameters in prosta-te cancer

3　討論

前列腺癌發(fā)病機(jī)制尚不明確[5,6]，前列腺特異性抗原(PSA)是前列腺癌篩選、診斷及預(yù)后判斷的常用血清學(xué)指標(biāo)，雖然PSA診斷PCa的標(biāo)準(zhǔn)臨界值為4.0 ng/ml，但其陽(yáng)性預(yù)測(cè)率僅為41.5%[7]，因此PSA的臨床運(yùn)用存在一定的局限性，如良性前列腺增生及前列腺炎等均會(huì)出現(xiàn)不同程度的PSA升高，以致影響臨床醫(yī)生的診斷。研究表明miRNA參與前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[8-10]，miRNA控制著機(jī)體60%以上的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。miRNA-15a在多種人類癌癥細(xì)胞中過表達(dá)，具有負(fù)調(diào)控作用[11]，能夠在轉(zhuǎn)錄后水平抑制BCL2、CCDI和WNTBA的表達(dá)，從而干擾癌基因的多種活動(dòng)，起到抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展的作用。最近研究發(fā)現(xiàn)，VEGF等也參與miRNA-15a在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展中的抑制作用，這種抑制作用是不依賴于轉(zhuǎn)錄作用的，通過多途徑對(duì)前列腺癌的發(fā)展起抑制作用[12]。本研究采用莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄-熒光定量的方法檢測(cè)了36例前列腺癌組織中miRNA-15a的表達(dá)，與良性前列腺增生患者和健康對(duì)照比較，發(fā)現(xiàn)miRNA-15a在前列腺癌患者、良性前列腺增生患者和健康對(duì)照血清的表達(dá)量分別為(0.193±0.081)、(0.359±0.04)和(0.376±0.037)。miRNA-15a在前列腺癌患者的表達(dá)量顯著低于良性前列腺增生患者和健康對(duì)照的血清miR-15a表達(dá)水平(P<0.05)，良性前列腺增生患者和健康對(duì)照的血清miR-15a表達(dá)水平無顯著性差異(P>0.05)。腫瘤組織miRNA-15a表達(dá)水平與臨床分期相關(guān)(P<0.05)，并且與Gleason積分、臨床分期及骨轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，但與是否復(fù)發(fā)及血清PSA水平無明顯相關(guān)性(P>0.05)。本研究顯示積分≥7分組與<7分組miRNA-15a的患者腫瘤組織中的表達(dá)量分別為(0.418±0.137)和(0.299±0.171)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。miRNA-15a表達(dá)水平與臨床分期相關(guān)(P<0.05)，隨著臨床分期的增加，miRNA-15a的

表達(dá)水平降低。miRNA-15a在PCa中明顯低表達(dá)，因此通過檢測(cè)miRNA-15a的表達(dá)水平能夠?qū)Ca患者與健康對(duì)照者區(qū)分開來，在很大程度上可能會(huì)提高臨床上對(duì)PCa患者的早期診斷率。本研究觀察到miRNA-15a表達(dá)在高PSA表達(dá)水平、Gleason評(píng)分、臨床分期和有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的前列腺癌患者顯著低于低PSA表達(dá)水平、Gleason評(píng)分、臨床分期和無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的前列腺癌患者。Gleason評(píng)分代表著腫瘤分化的程度，Gleason評(píng)分≥7分多屬中高危，Gleason評(píng)分≤7分者多系低危，可以推斷miRNA-15a低表達(dá)可能與前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移，并可能成為前列腺癌預(yù)后評(píng)估的監(jiān)測(cè)因子。

綜上所述，從前列腺癌的早期診斷來看，需要發(fā)現(xiàn)靈敏度和特異度較高的診斷標(biāo)志物，提高診斷率，以減少前列腺穿刺帶來的風(fēng)險(xiǎn)和不便。本研究顯示前列腺組織中miR-15a的表達(dá)與前列腺癌的組織學(xué)分級(jí)、臨床分期和轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，低表達(dá)參與了前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程，miRNA-15a可作為前列腺癌非侵入性診斷和預(yù)后的分子標(biāo)志。

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[收稿2015-11-13修回2016-03-09]

(編輯許四平)

Expression and diagnostic value of miRNA-15a in prostate cancer

YAO Chun-Hong,YUAN Xin-Chu,LIU Chong,DENG Jian-Ping.Wuhan University of Science and Technology School of medicine Wuhan 430081,China

Objective:To explore the diagnostic value of miRNA-15a in patients with prostate cancer.Methods: From January 2014 to January 2015,Gene expression of MiRNA-15a were examined in 36 serum and tumor tissue samples from prostate cancer,40 benign prostatic hyperplasia(BPH)and 40 health volunteers,which examined by quantitative Real-time reverse transcription polymerase chain reaction(RT-qPCR).Results: The serum expression of miRNA-15a were (0.193±0.081),(0.359±0.04) and (0.376±0.037) in patients with prostate cancer,benign prostatic hyperplasia and healthy controls respectively.miRNA-15a expression was significantly lower in BPH and healthy controls than patients with prostate cancer(P<0.05).There were no significant difference between BPH and control group(P>0.05).Serum miRNA-15a expression in patients with prostate cancer at different expression levels PSA,Gleason score,clinical stage,the difference between the presence of distant metastasis was statistically significant(P<0.05),and other pathological factors unrelated(P>0.05);Prostate cancer tumor tissue expression and PSA expression levels of miRNA-15a,Gleason score,clinical stage,presence of distant metastasis was statistically significant difference between(P<0.05),and other pathological factors unrelated(P>0.05).Conclusion: Low expression of miRNA-15a may be contributed in the development of prostate cancer,and the expression levels miRNA-15a may be considered potential novel biomarkers for the diagnosis of prostate cancer.

Prostate cancer;Benign prostatic hyperplasia;miRNA-15a

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.030

R737文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

1000-484X(2016)08-1219-04

姚春紅(1972年-)，男，副主任技師，主要從事免疫學(xué)檢驗(yàn)，E-mail:ych335@163.com。

及指導(dǎo)教師：袁新初(1953年-)，男，教授，主要從事心血管疾病和腫瘤的研究，E-mail:y5307@126.com。