陳　娜　龐保東

(唐山市婦幼保健院兒內(nèi)科,唐山063000)

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哮喘患兒外周血巨噬細(xì)胞M1/M2極化狀態(tài)研究

陳娜龐保東

(唐山市婦幼保健院兒內(nèi)科,唐山063000)

目的：體外培養(yǎng)哮喘患兒外周血巨噬細(xì)胞，并從細(xì)胞的表型和功能方面觀察巨噬細(xì)胞M1/M2極化狀態(tài)的變化，從而探討巨噬細(xì)胞在哮喘發(fā)病中的作用。 方法：選取50例健康對照者與50例哮喘患兒，收集哮喘患兒及健康對照組的血液，分離純化得到巨噬細(xì)胞，體外給予10 ng/ml GM-CSF的血清培養(yǎng)液培養(yǎng)，并在第7天，收集細(xì)胞及上清，運(yùn)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測巨噬細(xì)胞表型表達(dá)，ELISA方法檢測細(xì)胞上清IL-10、 IL-12含量變化，檢測巨噬細(xì)胞吞噬外來性抗原及刺激淋巴細(xì)胞分化的能力。 結(jié)果：與健康對照組相比，哮喘患兒外周血巨噬細(xì)胞表面表達(dá)的共刺激分子CD64、CD11c、CD40明顯降低，CD206、CD14及CD23明顯升高(P均<0.05)；患兒巨噬細(xì)胞分泌的IL-10明顯降低(P<0.05)，IL-12與對照組相比無顯著變化(P>0.05)；外周血巨噬細(xì)胞吞噬能力明顯降低(P<0.05)；將患兒巨噬細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，IL-4含量明顯升高，IFN-γ含量明顯降低(P均<0.05)。 結(jié)論：相比于健康對照組，哮喘患兒外周血巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)M2型，提示巨噬細(xì)胞與哮喘疾病具有很大的相關(guān)性。

巨噬細(xì)胞；哮喘；表型

哮喘是一種由多種因素導(dǎo)致的復(fù)雜性疾病，其致病機(jī)制至今未明，但多種研究認(rèn)為其與免疫因素密切相關(guān)[1]。巨噬細(xì)胞作為機(jī)體內(nèi)重要的固有免疫細(xì)胞，在機(jī)體起著重要作用。根據(jù)活化后功能的不同，巨噬細(xì)胞可分為M1及M2型巨噬細(xì)胞，不同的巨噬細(xì)胞可誘發(fā)不同的T細(xì)胞免疫應(yīng)答。已經(jīng)明確的是，哮喘患兒體內(nèi)存在Th1/Th2亞群失衡，且Th2占優(yōu)勢[2]，鑒于巨噬細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中的重要作用，我們推測巨噬細(xì)胞在哮喘患兒的發(fā)病機(jī)制中起到了重要的作用。因此，本研究提取哮喘患兒的外周血，分離純化得到巨噬細(xì)胞，觀察巨噬細(xì)胞的表型和功能的變化，來探討巨噬細(xì)胞在哮喘疾病發(fā)生發(fā)展中的意義。

1　資料與方法

1.1資料

1.1.1一般資料(1)實(shí)驗(yàn)組：選取2013年1月到2015年6月在我院兒科就診的哮喘患兒50例，其中男30例，女20例，年齡為2～6歲，平均(4.9±7.6)歲?；純翰∏榉现腥A醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會呼吸學(xué)組制定的哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，為急性發(fā)作者,此次發(fā)作前4周已停用糖皮質(zhì)激素等免疫抑制劑，患兒均無嚴(yán)重心、肝疾病史，近期無呼吸道感染 ，排除患兒自身存在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性血管炎等其他風(fēng)濕性免疫性疾病，病毒性肝炎、心梗、糖尿病等影響免疫系統(tǒng)的疾病，并排除入院3月來使用激素或免疫抑制劑及免疫調(diào)節(jié)藥物的患兒。(2)對照組：選取門診查體的健康患兒50例，其中男性28例，女性22例，年齡為2～7歲，平均(4.2±6.5)歲。對照組患兒不存在哮喘的臨床癥狀，無嚴(yán)重心、肝疾病史，近期無呼吸道感染，無糖皮質(zhì)激素等免疫抑制劑使用史。實(shí)驗(yàn)組與對照組在性別、年齡等方面差異不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本實(shí)驗(yàn)研究符合本單位的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)并得到批準(zhǔn)，且已獲得患兒與監(jiān)護(hù)人的知情同意。

1.1.2主要試劑人單核細(xì)胞分離液試劑盒購于天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司，GM-CSF細(xì)胞因子購于Peprotech公司，流式抗體CD64、CD11c、CD40、CD206、CD14及CD23及IL-10、 IL-12、IL-4及IFN-γ酶聯(lián)免疫試劑盒均購于ebioscience公司，異硫氰酸酯(FITC)標(biāo)記的右旋糖苷(dextran)購于Sigma公司。

1.1.3標(biāo)本采集分別收集對照組及實(shí)驗(yàn)組哮喘發(fā)作后立即抽取血液標(biāo)本8 ml，肝素抗凝。

1.2方法

1.2.1巨噬細(xì)胞的分離培養(yǎng)將血液標(biāo)本與PBS緩沖液倍比稀釋混勻，嚴(yán)格按照人單核細(xì)胞分離液試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作，將混合液輕輕置于分離液上，4℃，3 000 r/min，離心30 min。輕輕取出離心管，此時(shí)會出現(xiàn)分層，將第二層白膜細(xì)胞吸出置于另一離心管中，加入PBS清洗，獲得單個核細(xì)胞備用。配置含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，并加入GM-CSF細(xì)胞因子，終濃度為10 ng/ml。將獲得的單個核細(xì)胞用上述聯(lián)合培養(yǎng)基重懸，于6孔板中培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后全量換液，棄去漂浮的細(xì)胞，并再加入上述聯(lián)合培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，隔天進(jìn)行半量換液。繼續(xù)培養(yǎng)至第7天，細(xì)胞刮刀刮取收集細(xì)胞及上清用于實(shí)驗(yàn)檢測。

1.2.2流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表型收集培養(yǎng)第7天的細(xì)胞，與用異硫氰酸酯(FITC)或藻紅沅素(PE)標(biāo)記的流式抗體CD64、CD11c、CD40、CD206、CD14及CD23混合，4℃孵育30 min，PBS洗滌2次后，每管加入300 μl的PBS溶液重懸后，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，記錄結(jié)果為陽性細(xì)胞所占的比例。

1.2.3細(xì)胞因子檢測 收集培養(yǎng)第7天的細(xì)胞上清，嚴(yán)格按照試劑盒說明書，應(yīng)用IL-10、 IL-12、IL-4及IFN-γ 酶聯(lián)免疫試劑盒，檢測上清細(xì)胞因子含量。

1.2.4同種混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)取健康志愿者外周血10 ml，經(jīng)過淋巴細(xì)胞分離液梯度離心后獲取單個核細(xì)胞，PBS洗滌后，于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，24 h后收集懸浮細(xì)胞，視其為T淋巴細(xì)胞。將收集培養(yǎng)第7天的巨噬細(xì)胞用絲裂霉素C 25 μg/ml，處理 45 min后用PBS洗滌收集細(xì)胞，用10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106ml-1，取100 μl置于96孔板中。并將淋巴細(xì)胞也用10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106ml-1，也取100 μl置于96孔板中，使巨噬細(xì)胞與淋巴細(xì)胞混合的最終容積為200 μl，然后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h。于培養(yǎng)結(jié)束時(shí)取細(xì)胞上清細(xì)胞因子分泌來檢測T淋巴細(xì)胞分化狀況。

1.2.5吞噬功能檢測收集培養(yǎng)第7天的細(xì)胞，應(yīng)用PBS溶液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106ml-1，取100 μl置于流式管中，每管加入10 μl用異硫氰酸酯(FITC)標(biāo)記的抗體右旋糖苷 ，斡旋混勻，4℃孵育50 min，PBS洗滌2次后，每管加入300 μl的PBS溶液重懸后，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，記錄結(jié)果為陽性細(xì)胞所占的比例。

2　結(jié)果

2.1各組對象外周血巨噬細(xì)胞表面共刺激分子表達(dá)哮喘患兒與對照組相比，外周血巨噬細(xì)胞表面表達(dá)的CD64、CD11c、CD40明顯低于對照組，CD206、CD14及CD23明顯高于對照組，各組差異均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，具體見表1。

2.2各組對象外周血巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子分泌哮喘患兒與對照組相比，外周血巨噬細(xì)胞分泌的IL-10明顯低于對照組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，分泌的IL-12與對照組相比無顯著差異(P>0.05)，具體見表2。

2.3各組對象外周血巨噬細(xì)胞吞噬能力哮喘患兒與對照組相比，外周血巨噬細(xì)胞吞噬能力明顯低于對照組，均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，具體見表3。

表1　各組對象外周血巨噬細(xì)胞表面共刺激分子表達(dá)變化±s,n=50)Tab.1　Phenotype expression of macrophagocyte in each ±s,n=50)

表2　各組對象外周血巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子分泌變化±s,n=50)Tab.2　Cytokine secretion of macrophagocyte in each ±s,n=50)

表3　各組對象外周血巨噬細(xì)胞吞噬能力±s,n=50)Tab.3　Phagocytic capacity of macrophagocyte in each ±s,n=50)

表4　各組對象外周血巨噬細(xì)胞刺激T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子±s,n=50)Tab.4　Cytokine secretion of T lymphocyte in each ±s,n=50)

2.4各組對象外周血巨噬細(xì)胞刺激T淋巴細(xì)胞分化哮喘患兒與對照組相比，外周血巨噬細(xì)胞刺激T淋巴細(xì)胞分泌IL-4含量明顯高于對照組，IFN-γ含量明顯低于對照組，各組差異均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，具體見表4。

3　討論

支氣管哮喘是由多種細(xì)胞，如嗜酸粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和肥大細(xì)胞等浸潤為主的氣道慢性變態(tài)反應(yīng)性炎癥,其中T淋巴細(xì)胞是最重要的致病性細(xì)胞。目前普遍認(rèn)為，Th1/Th2細(xì)胞失衡，Th2占優(yōu)勢與哮喘發(fā)病密切相關(guān)[4]。Th1細(xì)胞主要分泌IL-12、IFN-γ等，介導(dǎo)與細(xì)胞毒和局部炎癥有關(guān)的免疫應(yīng)答，可提高巨噬細(xì)胞的吞噬能力[5]。Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-10等，介導(dǎo)抗體生成和寄生蟲免疫，參與體液免疫，在感染和環(huán)境變應(yīng)原的應(yīng)答中起重要作用[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，CD4+T細(xì)胞僅在過敏原存在的情況下，并不能導(dǎo)致Th1/Th2細(xì)胞失衡，而在巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的情況下，Th2優(yōu)勢明顯增加，T細(xì)胞分化即存在失衡，說明了巨噬細(xì)胞在哮喘發(fā)病中起著重要作用[7]。

巨噬細(xì)胞作為體內(nèi)重要的固有免疫細(xì)胞，以往多認(rèn)為巨噬細(xì)胞的主要作用為清除機(jī)體損傷、衰老或凋亡的細(xì)胞以及抗原性異物，如病原體和免疫復(fù)合物等。近年來，隨著巨噬細(xì)胞生物學(xué)特性和功能的深入研究，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞的功能狀態(tài)可極大影響T淋巴細(xì)胞功能，會直接影響免疫應(yīng)答的反應(yīng)，從而影響機(jī)體的各種生命活動，因此巨噬細(xì)胞的重要性被重新評估和強(qiáng)調(diào)。已明確的是，巨噬細(xì)胞分為M1及M2型。 M1型巨噬細(xì)胞，主要由Th1細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子或脂多糖等誘導(dǎo)生成，表現(xiàn)為抗原提呈功能增強(qiáng)，可分泌多種細(xì)胞因子，如IL-12、IL-6以及趨化因子，如CXCL-9、CCL-5等，高表達(dá)多種表面因子，如CD64、CD11c、CD40，參與Th1免疫應(yīng)答，導(dǎo)致炎性損傷，可殺傷體內(nèi)腫瘤和病原體[8,9]。M2型巨噬細(xì)胞，主要由Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，如IL-4及IL-13等誘導(dǎo)生成，表現(xiàn)為高分泌多種細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-1清道夫受體以及趨化因子CCL17 和 CCL24 等，高表達(dá)多種表面因子，如CD206、CD14及CD23，可促進(jìn)Th2免疫應(yīng)答，參與組織的損傷修復(fù)和纖維變性[10,11]。目前多數(shù)研究認(rèn)為，在M1及M2型巨噬細(xì)胞之間還存在另一種細(xì)胞及調(diào)節(jié)性巨噬細(xì)胞，通過高表達(dá)IL-10來參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展[11,12]。

本研究可以看出，與健康對照組相比，哮喘患兒外周血巨噬細(xì)胞表面表達(dá)的共刺激分子CD64、CD11c、CD40明顯降低(P<0.05)，CD206、CD14及CD23明顯升高(P<0.05)；哮喘患兒巨噬細(xì)胞分泌的IL-12與對照組相比無顯著變化(P>0.05)。以上結(jié)果均提示哮喘患兒外周血巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)M2型極化。并且，研究發(fā)現(xiàn)哮喘患兒外周血巨噬細(xì)胞吞噬能力明顯低于對照組，提示巨噬細(xì)胞在極化變化的情況下，成熟度也明顯下降。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，將患兒巨噬細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，IL-4(Th2細(xì)胞因子)含量明顯升高，IFN-γ(Th1細(xì)胞因子)含量明顯降低，即驗(yàn)證了，巨噬細(xì)胞可以顯著誘導(dǎo)T細(xì)胞向Th2極化，從而導(dǎo)致Th1/Th2失衡，誘導(dǎo)疾病生成。與此同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)哮喘患兒巨噬細(xì)胞分泌IL-10明顯下降，提示調(diào)節(jié)性巨噬細(xì)胞含量降低，這與多種研究結(jié)果基本吻合，其他研究表明哮喘患者肺巨噬細(xì)胞IL-10表達(dá)量明顯下降，并且下降量與疾病的嚴(yán)重程度正相關(guān)[13,14]。本研究也提示了哮喘患兒外周血調(diào)節(jié)性巨噬細(xì)胞含量較正常組明顯下降,與國內(nèi)外多項(xiàng)研究吻合。

綜上所述，相對于健康對照者，哮喘患兒外周血巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)M2型分化，由此可見巨噬細(xì)胞參與了哮喘疾病的發(fā)生與發(fā)展，并在其中起著重要作用。

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[收稿2015-11-02修回2016-03-10]

(編輯張曉舟)

Study on polarization of macrophage in peripheral blood of patients with asthma

CHEN-Na,PANG Bao-Dong.Department of Pediatiric Internal Medicine,Tangshan Maternity and Child Health Hospital,Tangshan 063000,China

Objective:To investigate the different function of macrophage between patients with asthma and healthy control, and discuss the pathogenesis of the disease.Methods: Choose 50 healthy controls,50 patients with asthma, and isolation of blood macrophage. Then samples were induced with GM-CSF, and cells were collected on day 7. Macrophage function was evaluated using the following methods: fluorescence-activated cell sorting analysis for cell surface markers and phagocytosis;enzyme-linked immunosorbent assay for cytokine production and the induction of T cell.Results: Compared with the control group, asthma group had decreased CD64, CD11c, CD40 expression, and increased CD206, CD14, CD23 expression(P<0.05);displayed the decreased IL-10 level(P<0.05);displayed a decreased phagocytosis ability(P<0.05);when co-cultured with T cells, the supernatantdisplayed the increased IL-4 expression, and decreased IFN-γ level(P<0.05).Conclusion: Compared with the control group, macrophage in asthma group displayed M2 phenotype, which inditates macrophage play the important role in the pathogenesis of asthma.

Macrophage;Asthma;Polarization

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.028

R256.12文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

1000-484X(2016)08-1208-04

陳娜(1979年-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事兒科方面的研究。