楊文靜　王　璐　孫　銳

(江漢大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，武漢430015)

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不同濃度柚皮苷對人宮頸癌HeLa細(xì)胞體外增殖及其COX-2表達(dá)影響①

楊文靜王璐孫銳②

(江漢大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，武漢430015)

①本文為武漢市衛(wèi)計委臨床醫(yī)學(xué)科研項目(WX15D59)、武漢市科技局科技攻關(guān)項目(No.2015061701011626)和武漢市衛(wèi)生與計劃生育委員會重點項目(No.WX15A08)。

②華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬普愛醫(yī)院腫瘤科，武漢430033。

目的：研究柚皮苷對人宮頸癌Hela細(xì)胞體外增殖的影響及相關(guān)機(jī)制研究。方法：用不同濃度的柚皮苷處理體外培養(yǎng)人宮頸癌Hela細(xì)胞，采用MTT法檢測處理24、48、72 h后Hela細(xì)胞的增殖情況，流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率，Hoechst 33258染色觀察細(xì)胞凋亡情況，同時Western blot觀察環(huán)氧合酶-2(COX-2)表達(dá)的相對量。結(jié)果：與對照組相比，柚皮苷低劑量組細(xì)胞抑制率無顯著差異(P>0.05)，柚皮苷中劑量組和高劑量組細(xì)胞抑制率顯著增高(P<0.05)；柚皮苷低劑量組細(xì)胞凋亡率無顯著差異(P>0.05)，柚皮苷中劑量組和高劑量組細(xì)胞凋亡率顯著增高(P<0.05)，同時柚皮苷中劑量和高劑量組可觀察到明顯的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象；柚皮苷低劑量組細(xì)胞COX-2表達(dá)的相對量無顯著差異(P>0.05)，柚皮苷中劑量組和高劑量組細(xì)胞COX-2表達(dá)的相對量顯著降低(P<0.05)；結(jié)論：柚皮苷能抑制宮頸癌細(xì)胞生長，且隨其濃度增加抑制作用增強，其機(jī)制可能與其抑制COX-2蛋白表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡相關(guān)。

柚皮苷；HeLa細(xì)胞；增殖；環(huán)氧化酶-2

子宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤，在全球婦女惡性腫瘤中居第二位，僅次于乳腺癌。Cuzick等研究報道該病的80%病例在發(fā)展中國家，而我國占世界新發(fā)病例的28%[1]。目前對于子宮頸癌的治療主要采取手術(shù)、放療和化療，但對于其發(fā)生、發(fā)展以及治療后的不良反應(yīng)等仍然存在很多問題，因此對子宮頸癌的機(jī)制研究和治療新的手段得到了重視。柚皮苷是一類天然黃酮化合物，來源于蕓香科柑橘屬植物柚，葡萄柚的未成熟或近成熟的干燥外層果皮中提取出的淡黃色的雙氫黃酮類化合物。游瓊等[2]研究表明，柚皮苷除了具有抗病毒、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛等作用外還具有預(yù)防癌癥的作用。同時Diane等[3]研究表明黃酮類化合物能通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、增強抑癌基因表達(dá)等方式產(chǎn)生抗腫瘤作用。嗣后，宋淑慧研究發(fā)現(xiàn)柚皮苷對人卵巢癌SKOV3細(xì)胞體外增殖具有顯著抑制作用，且其相關(guān)機(jī)制可能與環(huán)氧合酶-2(COX-2)的表達(dá)有關(guān)。黃酮類化合物對細(xì)胞的抗凋亡作用越來越受到重視，關(guān)于柚皮苷對細(xì)胞凋亡和癌變的化學(xué)和物理因素進(jìn)行許多研究[4-8]。故本文以體外培養(yǎng)人宮頸癌Hela細(xì)胞為研究對象，通過MMT法等觀察其增殖和凋亡情況，同時檢測COX-2的表達(dá)以探索其作用的相關(guān)機(jī)制，為今后人宮頸癌的治療和研究提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1藥物與試劑柚皮苷、二甲基亞(DMSO)、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)和Hoechst33258均購于Sigma公司；細(xì)胞凋亡檢測ELISA試劑盒購于Roche公司；兔人抗COX-2購于Santa Cruz公司。細(xì)胞：人宮頸癌Hela細(xì)胞購于上海中科院細(xì)胞庫。

1.1.2儀器超凈工作臺(蘇州安泰生物技術(shù)有限公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國ThermoScientific)；超速低溫離心機(jī)(美國Beckman公司)； EBICS-XL流式細(xì)胞檢測儀(美國貝克曼)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；垂直凝膠電泳儀(美國佰樂)；酶標(biāo)儀(美國ThermoScientific)。

1.2方法將HeLa細(xì)胞置于37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)液含10%小牛血清的RPMI1640，按照細(xì)胞的生長進(jìn)行接種。當(dāng)細(xì)胞生長狀態(tài)穩(wěn)定、呈對數(shù)生長期時才進(jìn)行實驗。

1.2.1MTT法檢測人宮頸癌HeLa細(xì)胞抑制率按1×104/孔密度將對數(shù)生長期的人宮頸癌HeLa細(xì)胞接種于96孔板，分成4組，即對照組，柚皮苷低、中、高劑量組，每組10孔。孵育24 h后，吸出原培養(yǎng)液，對照組加入100 μl的RPMI1640溶液，柚皮苷低、中、高劑量組中分別加入含柚皮苷濃度為40、80、100 μmol/L的RPMI1640溶液100 μl。孵育24、48、72 h后，每孔分別加入50 μl MMT溶液。繼續(xù)孵育4 h后，終止培養(yǎng)。吸取孔內(nèi)上清液，棄之，加入DMSO 150 μl，震搖10 min，用酶標(biāo)儀在490nm處測定各孔的吸光度OD。細(xì)胞增殖抑制率=(1-給藥組OD /對組OD)×100%。

1.2.2細(xì)胞凋亡率的檢測同前法將細(xì)胞培養(yǎng)、分組以及給予不同濃度的柚皮苷處理，按照細(xì)胞凋亡試劑盒的操作說明采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.3Hoechst 33258染色按1×105/孔密度將對數(shù)生長期的人宮頸癌HeLa細(xì)胞接種于35 mm的培養(yǎng)皿中，分成4組，即對照組，柚皮苷低、中、高劑量組，每組10孔。各組給予不同濃度的柚皮苷，在37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，48 h。用4%的多聚甲醛固定細(xì)胞，4℃固定15 min。去掉固定液，用PBS洗兩遍，每次3 min。加5 mg/ml的Hoechst33258染色液，室溫放置10 min。倒掉染色液，用PBS洗3遍，每次3 min，避光風(fēng)干。在熒光倒置顯微鏡下觀察。

1.2.4Western blot法對COX-2表達(dá)檢測分別取各組人宮頸癌HeLa細(xì)胞，用蛋白裂解液充分的裂解細(xì)胞；離心，取上清提取總蛋白；采用酚試劑法進(jìn)行對蛋白定量；采用聚丙烯酰胺凝膠電泳和電轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF 膜，封閉，過夜；按說明書要求加入待檢測的一抗以及相應(yīng)的二抗，顯色，掃描測定雜交帶的灰度值，用目的蛋白活性片段與內(nèi)參β-肌動蛋白灰度值的相對比值代表各COX-2活化蛋白的相對含量。

2　結(jié)果

2.1柚皮苷對人宮頸癌HeLa細(xì)胞抑制率影響由表1知，與空白組相比，低劑量組在24、48、72 h時人宮頸癌HeLa細(xì)胞抑制率均無顯著性差異(P>0.05)；中劑量組在24、48、72 h時人宮頸癌HeLa細(xì)胞抑制率均顯著性增高(P<0.05)；高劑量組在24、48、72 h時人宮頸癌HeLa細(xì)胞抑制率均顯著性增高(P<0.05)。提示，柚皮苷對人宮頸癌HeLa細(xì)胞具有顯著的抑制作用，且強度隨濃度的增加而增強，同時還對時間有一定的依懶性。

2.2柚皮苷對人宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡影響由表2和圖1知，與空白組相比，低劑量組人宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡率無顯著性差異(P>0.05)；中劑量組人宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡率顯著性增高(P<0.05)；高劑量組人宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡率顯著性增高(P<0.05)。

表1　柚皮苷對人宮頸癌HeLa細(xì)胞抑制率影響結(jié)果±s)Tab.1　Effects of naringin on growth inhibition ratio of human cervical cancer HeLa ±s)

表2　柚皮苷對人宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡率結(jié)果±s)Tab.2　Effects of naringin on apoptosis ratio of human cervical cancer HeLa ±s)

圖1　流式細(xì)胞儀檢測柚皮苷對HeLa細(xì)胞凋亡率的影響Fig.1　Effects of naringin on apoptosis ratio of human cervical cancer HeLa cellNote: A.Control group;B.Low dose group;C.Middle dose group;D.High dose group.

圖2　各組在熒光顯微鏡下人宮頸癌Hela細(xì)胞Fig.2　Morphological changes of human cervical cancer HeLa cell induced by naringin

2.3Hoechst33258染色結(jié)果由圖2可知，在熒光顯微鏡下，對照組和低劑量組中Hela細(xì)胞膜完整，細(xì)胞核大， 胞核極顯清楚，呈橢圓形或圓形，核內(nèi)熒光較弱，染色部分為均一的淡藍(lán)色，而中劑量組的Hela細(xì)胞可見部分細(xì)胞核體積減小，細(xì)胞核由于濃縮、著色深而呈亮藍(lán)色，其染色質(zhì)分布不均勻，部分細(xì)胞核呈顆粒團(tuán)狀分布，細(xì)胞核呈現(xiàn)不同程度的早期凋亡特征；當(dāng)給藥濃度繼續(xù)增加，即在高劑量組可知，細(xì)胞核裂解為碎塊，典型的呈梅花瓣狀，產(chǎn)生凋亡小體，甚至溶解消失，呈現(xiàn)出晚期凋亡和壞死的細(xì)胞核特征。

2.4柚皮苷對各組細(xì)胞COX-2蛋白表達(dá)的影響由表3知，與空白組相比，低劑量組COX-2蛋白相對表達(dá)量無顯著性差異(P>0.05)；中劑量組COX-2蛋白相對表達(dá)量顯著性降低(P<0.05)；高劑量組COX-2蛋白相對表達(dá)量顯著性降低(P<0.05)。

表3　柚皮苷對COX-2蛋白相對表達(dá)量結(jié)果±s)Tab.3　Naringin ameliorates expression of COX-2 in HeLa ±s)

3　討論

目前對于子宮頸癌的治療主要采取手術(shù)、放療和化療，但對于其發(fā)生、發(fā)展以及治療后的不良反應(yīng)等仍然存在很多問題，因此發(fā)展新的治療手段不斷得到人們的重視?，F(xiàn)文獻(xiàn)研究中多以體外培養(yǎng)細(xì)胞為對象，通過給予不同的藥物處理探索其藥理作用，同時檢測其特定的靶向物質(zhì)來研究其可能的相關(guān)機(jī)制。如宋淑慧研究發(fā)現(xiàn)柚皮苷對人卵巢癌SKOV3細(xì)胞體外增殖具有顯著抑制作用，且其相關(guān)機(jī)制可能與COX-2的表達(dá)有關(guān)；米合勒阿衣·艾克帕等[9]研究了異常黑膽質(zhì)成熟劑總黃酮對人宮頸癌Hela細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果表明異常黑膽質(zhì)成熟劑總黃酮能顯著抑制人宮頸癌Hela細(xì)胞增殖，其可能機(jī)制是增強其抗氧化能力。反之，我們又可以通過相關(guān)機(jī)制來預(yù)測新的治療方法，程金龍等[10]研究宮頸癌與鱗狀細(xì)胞癌抗原(SCCA)和環(huán)氧合酶-2(COX-2)之間的敏感性和相關(guān)性，預(yù)測出宮頸癌新輔助化療法。本文以體外培養(yǎng)人宮頸癌Hela細(xì)胞為研究對象，通過MMT法等觀察其增殖和凋亡情況，同時檢測COX-2的表達(dá)以探索其作用的相關(guān)機(jī)制。

本文首先采用MTT法檢測各組HeLa細(xì)胞給予不同濃度的柚皮苷后的24、48、72 h后的增殖情況，結(jié)果表明中劑量組和高劑量組的HeLa細(xì)胞抑制率顯著增高，提示柚皮苷對人宮頸癌HeLa細(xì)胞具有顯著的抑制作用，且強度隨濃度的增加而增強，同時還對時間有一定的依懶性。進(jìn)一步采用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率和Hoechst 33258染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低劑量組人宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡率無顯著性差異，而中劑量組和高劑量組人宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡率顯著性增高，且中劑量組和高劑量組的人宮頸癌HeLa細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的凋亡現(xiàn)象。以上結(jié)果表明柚皮苷對體外人宮頸癌HeLa細(xì)胞有明顯的抑制作用，且作用隨濃度的增加而增強和對時間具有一定的依懶性。最后本文還采用Western blot法對COX-2相對量表達(dá)進(jìn)行檢測以探索相關(guān)機(jī)制，結(jié)果表明低劑量組COX-2蛋白相對表達(dá)量無顯著性差異，中劑量組和高劑量COX-2蛋白相對表達(dá)量顯著性降低。環(huán)氧合酶是花生四烯酸轉(zhuǎn)化為各種前列腺素的關(guān)鍵酶，Menczer等[10]研究表明COX-2為一種誘導(dǎo)酶，它參與體內(nèi)多種病理生理過程，可以被一些腫瘤促進(jìn)因子和癌基因誘導(dǎo)。COX-2參與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、預(yù)后的機(jī)制可能主要為以下幾方面：促進(jìn)細(xì)胞凋亡；促進(jìn)機(jī)體的抗腫瘤免疫；抑制成腫瘤新生血管；抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。近來研究表明COX-2在結(jié)腸癌、胃癌等癌組織中呈現(xiàn)較高的表達(dá)，而COX-2抑制劑對體外癌細(xì)胞具有顯著的抑制增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用[11，12]。嗣后，馬雪蓮等[13，14]研究表明，COX-2選擇性抑制劑能誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，從而抑制癌細(xì)胞增長，同時與化療和放療有一定的協(xié)同作用。結(jié)合本文研究結(jié)果表明，中劑量和高劑量柚皮苷對COX-2的相對表達(dá)量具有顯著的抑制作用，提示柚皮苷可作為COX-2抑制劑抑制人宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖，這可能是其機(jī)制之一。

綜上所述，柚皮苷對體外人宮頸癌HeLa細(xì)胞有明顯的抑制作用，且作用隨濃度的增加而增強和對時間具有一定的依懶性；其作用機(jī)制可能與抑制COX-2的相對表達(dá)量有關(guān)。

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[收稿2015-12-15修回2016-03-09]

(編輯張曉舟)

Effects of naringin on growth and COX-2 expressions in human cervical cancer HeLa cell line

YANG Wen-Jing,WANG Lu,SUN Rui.Obstetrics and Gynecology，Affiliated Hospital of the Jianghan University，Wuhan 430015，China

Objective:To study the effect of naringin on human cervical cancer HeLa cell line and its related mechanism.Methods: HeLa cells were cultured in vitro in the presence of different concentration naringin.The method of MTT was used to detect the growth of HeLa cell in 24 h,48,72 h.Apoptotic cells were observed by Hoechst 33258 staining.The protein expressions of COX-2 in SCL-12 cells were analyzed by Western blot.Results: The inhibition ratio of the cell growth in middle dose group and high dose group significantly higher than control group(P<0.05) and the inhibition ratio in low dose group was no significant change(P>0.05).The apoptosis ratio of the cell growth in middle dose group and high dose group significantly higher than control group(P<0.05) and the apoptosis ratio in low dose group was no significant change(P>0.05).The expression of COX-2 was significantly decreased in middle dose group and high dose group.Conclusion: Naringin plays a central role in the apoptosis of the human cervical cancer HeLa cell line,which may be related to the expression of COX-2.

Naringin;HeLa cell;Growth;COX-2

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.026

R739.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

1000-484X(2016)08-1200-04

楊文靜(1981年-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事婦科腫瘤方面的研究，E-mail：yangwenjing999000@163.com。

及指導(dǎo)教師：孫銳(1988年-)，男，博士，主治醫(yī)師，主要從事腫瘤的免疫調(diào)節(jié)及綜合治療方面的研究。