張宏宇　劉忠山　王鐵君　李志超　郭　杰

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院放療科,長(zhǎng)春130041)

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氯化甲基汞對(duì)發(fā)育階段大鼠小腦 PKCδ mRNA及蛋白表達(dá)的影響①

張宏宇②劉忠山王鐵君李志超③郭杰

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院放療科,長(zhǎng)春130041)

①本文為吉林省衛(wèi)生廳科研基金資助項(xiàng)目(3D5097923427)、吉林大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目(421030140427)、吉林大學(xué)青年教師基金資助項(xiàng)目(419070210048)。

②中國(guó)人民解放軍208醫(yī)院461臨床部,長(zhǎng)春130061。

③吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，長(zhǎng)春130061。

目的：觀察氯化甲基汞對(duì)發(fā)育大鼠小腦中 PKCδ mRNA 及蛋白表達(dá)的影響。方法：建立發(fā)育大鼠小腦甲基汞損傷實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。采用核酸原位雜交方法(In Situ Hybridization, ISH )檢測(cè) δ 型蛋白激酶 C(PCKδ) mRNA 表達(dá)。采用Western blot方法檢測(cè)PKCδ蛋白表達(dá)。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組仔鼠在出后就即可檢測(cè)到小腦蒲肯野細(xì)胞 PKCδ表達(dá)，且隨生后時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)水平雖有增高但幅度很小。各實(shí)驗(yàn)組仔鼠腦汞含量明顯高于對(duì)照組，且實(shí)驗(yàn)組小腦蒲肯野神經(jīng)元PKCδmRNA表達(dá)陽(yáng)性率及小腦組織胞漿和胞膜PKCδ蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。結(jié)論：氯化甲基汞以劑量依賴方式和時(shí)間依賴方式促進(jìn)仔鼠小腦蒲肯野細(xì)胞 PKCδmRNA及蛋白表達(dá)。 PKCδ亞類可能是甲基汞介導(dǎo)神經(jīng)毒作用的關(guān)鍵靶分子。

氯化甲基汞;腦發(fā)育;PKCδ expression

氯化甲基汞(Methylmercury chloride,MMC) ，是一種親脂性有機(jī)汞的環(huán)境污染物,極易透過(guò)血腦屏障，具有強(qiáng)烈的神經(jīng)毒性作用[1-3]。既往的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲基汞可導(dǎo)致幼鼠腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡，引起發(fā)育階段大鼠海馬組織胞漿及胞膜蛋白激酶C(Protein kinase C，PKC)活性升高，并且以劑量依賴方式和時(shí)間依賴方式促進(jìn)仔鼠小腦蒲肯野細(xì)PKCαmRNA表達(dá)[4-6]。另外，我們還觀察到氯化甲基汞可以誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡[7]?；谇笆鲅芯康慕Y(jié)果，我們認(rèn)為PKC可能是氯化甲基汞神經(jīng)毒作用機(jī)制中的關(guān)鍵靶標(biāo)。PKCδ是鈣離子依賴型蛋白激酶, 是細(xì)胞增殖分化及凋亡信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，但其對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、分化的影響尚不清楚[8,9]。 因此本研究在建立甲基汞致大鼠小腦發(fā)育損傷模型的基礎(chǔ)上,采用核酸原位雜交及Western blot方法觀察氯化甲基汞對(duì)發(fā)育大鼠小腦 PCKδ 在mRNA和蛋白質(zhì)水平上表達(dá)的影響，旨在深入研究甲基汞神經(jīng)毒作用的分子機(jī)制。

1　材料與方法

1.1試劑與儀器FV500 激光共聚焦顯微鏡 Olympus,日本； MMC 德國(guó) Merck 公司。ISH檢測(cè)試劑盒,武漢博士德生物公司。

1.2方法

1.2.1慢性氯化甲基汞暴露小腦發(fā)育損傷動(dòng)物模型的建立，詳見(jiàn)引文[4]。

1.2.2腦汞含量測(cè)定采用干燒法測(cè)定，詳見(jiàn)引文[4]。

1.2.3ISH石蠟切片二甲苯脫蠟,乙醇梯度復(fù)水,預(yù)雜交,雜交,顯色,相同區(qū)域顯微鏡下在同一放大倍數(shù)下計(jì)數(shù)，計(jì)10 個(gè)不同視野的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù),計(jì)算陽(yáng)性率。

1.2.4免疫印跡法(Western blot )腦組織樣品制備:分離細(xì)胞漿PKC取鼠腦稱重，加入勻漿緩沖液(50 mmol/L Tris-HCL pH7.5,0.32 mmol/L sucrose,0.25 μg/ml Leupeptin,0.1 μg/ml Aprotinin,1 mmol/L EDTA,1 mmol/L EGTA, 50 mmol/L PMSF)。超聲粉碎20 s共3次，每次間隔20 s。100 000 r/min 4℃，離心1 h。將上清，沉淀分開(kāi)待用。

分離細(xì)胞膜PKC：用勻漿緩沖液含(1%Triton-X100，50 mmol/L Tris-HCl pH7.5,0.32 mmol/L Sucrose,0.25 μg/ml Leupeptin,0.1 μg/ml Aprotinin,1 mmol/L EDTA,1 mmol/L EGTA, 50 mmol/L PMSF)將沉淀懸起，100 000 r/min 4℃，離心1 h，留取上清。

蛋白質(zhì)濃度測(cè)定：采用Bradford(1976)法[10]。

樣品制備及SDS-PAGE電泳提取的樣品蛋白定量后，置于1×SDS上樣緩沖液中，100℃煮沸3min使蛋白變性，每道上樣量為50 μg/20 μl。接通電源，凝膠上所加電壓8 V/cm。顏料前進(jìn)至分離膠后，電壓提高至15 V/cm,繼續(xù)電泳至溴酚蘭達(dá)到分離膠底部。

蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移：電泳后切出含待轉(zhuǎn)移蛋白的凝膠，剪6張同樣大小的濾紙和1張硝酸纖維素膜，將它們浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中，在塑料支架上依次疊放浸濕的海綿、3層濾紙、凝膠、硝酸纖維素膜、3層濾紙和海綿，各層之間精確對(duì)齊且無(wú)氣泡存在，將支架夾扣扣緊后，置于電轉(zhuǎn)移槽中，硝酸纖維素膜一側(cè)接陽(yáng)極，凝膠一側(cè)接陰極，加入轉(zhuǎn)移緩沖液和冰盒，30 V電壓過(guò)夜轉(zhuǎn)移。

封閉：電轉(zhuǎn)移結(jié)束后，將封閉液均勻加至硝酸纖維素膜上，室溫封閉2 h，以封閉無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。轉(zhuǎn)移后凝膠用考馬斯亮蘭染色，檢查蛋白是否轉(zhuǎn)移完全。

抗體的結(jié)合：封閉后的硝酸纖維素膜用PBST漂洗3次，每次5 min。以抗體稀釋液稀釋一抗。取一保鮮膜，四角固定于大平皿上，滴加一抗溶液，將硝纖膜覆蓋在該溶液上(注意：轉(zhuǎn)移面與抗體溶液接觸)，37℃反應(yīng)2 h。洗滌后的膜按同樣方法與二抗溶液反應(yīng)2 h。暗室中顯影目標(biāo)蛋白帶，采用ImageQuantTMTL分析條帶灰度。

2　結(jié)果

2.1MMC母鼠喂養(yǎng)對(duì)仔鼠小腦汞含量的影響MMC 染毒的實(shí)驗(yàn)組仔鼠小腦汞含量均明顯高于對(duì)照組(P<0.001),并且隨母鼠接觸 MMC 劑量的增多而增高(P<0.001) 。 三種濃度的實(shí)驗(yàn)組仔鼠小腦汞含量在出生后均隨時(shí)間的延長(zhǎng)而有不同程度升高,且均明顯高于相應(yīng)對(duì)照組(P<0.001) 。

2.2氯化甲基汞對(duì)仔鼠小腦 PKCδ mRNA 表達(dá)的影響大鼠初出生PKCδ mRNA即可廣泛高水平表達(dá)于新生鼠小腦皮質(zhì)蒲肯野神經(jīng)元。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)新生大鼠小腦顆粒及分子層細(xì)胞PKCδ mRNA表達(dá)量極低。隨生后時(shí)間的延長(zhǎng)，PKCδ表達(dá)水平雖有增高但幅度很小，這與我們以往觀察PKCα mRNA表達(dá)隨生后時(shí)間延長(zhǎng)而遞增的表達(dá)模式不同[6]。我們提取實(shí)驗(yàn)組生后不同時(shí)間仔鼠小腦組織測(cè)定汞含量計(jì)數(shù)PKCδ mRNA陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)隨腦汞含量增加實(shí)驗(yàn)組仔鼠小腦蒲肯野細(xì)胞PKCδmRNA表達(dá)陽(yáng)性率明顯升高(P<0.05)，并且這種表達(dá)變化呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)模式。與對(duì)照組相比，PKCδmRNA陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞在3個(gè)劑量水平氯化甲基汞攝入組分別增加了8.8%，16.9%，24.6%。見(jiàn)圖1。

2.3氯化甲基汞對(duì)仔鼠小腦 PKCδ 蛋白表達(dá)的影響采用Western blot法在蛋白質(zhì)水平檢測(cè)PKCδ腦表達(dá)，研究觀察到與ISH方法檢測(cè)一致的結(jié)果，即PKCδ蛋白在仔鼠初出生后就廣泛高表達(dá)于小腦組織胞漿和胞膜,在生后30 d達(dá)峰值。且實(shí)驗(yàn)組仔鼠小腦組織胞漿和胞膜PKCδ蛋白表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組(見(jiàn)表1及圖2)。

圖1　MMC慢性暴露對(duì)PKCδ mRNA 表達(dá)的影響Fig.1　Time-courses change pattern of PKCδ mRNA expression in postnatal rat cerebellumNote: *.P<0.001.

表1　Western blot法檢測(cè)不同濃度氯化鉀基汞對(duì)仔鼠腦神經(jīng)元胞膜及胞漿PKCδ蛋白表達(dá)條帶灰度值的影響Tab.1　Expression of PKCδ in cytosol and membrane of PND30 rat cerebellum from control and different concentrations of MMC exposure groups by Western blot analysis

圖2　Western blot法檢測(cè)仔鼠小腦神經(jīng)元胞膜及胞漿PKCδ蛋白表達(dá)Fig.2　Representative immunoblots showing protein expression of PKCδ in rat cerebellum from Western blot analysisNote: All postnatal cerebellum samples were from rats of a single litter.The molecular weights for PKCδ subunit is 76 kD.

3　討論

PKC在機(jī)體對(duì)外界刺激產(chǎn)生反應(yīng)的信號(hào)通路中起重要作用，是信號(hào)通路的中心分子，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡及癌變，與細(xì)胞信息傳遞、細(xì)胞分泌、細(xì)胞膜離子通道調(diào)節(jié)等重要生理過(guò)程。PKCδ 作為PKC家族中的關(guān)鍵分子，發(fā)揮著重要的生理學(xué)功能，它是一類鈣離子依賴性的 PKC 亞類蛋白,處于增殖分化期的神經(jīng)細(xì)胞中檢測(cè)到PKCδ高表達(dá)，PKCδ低表達(dá)于成熟的神經(jīng)組織, PKCδ的功能與神經(jīng)元細(xì)胞的死亡和/或凋亡密切相關(guān)[11]。本研究中我們?cè)趍RNA和蛋白質(zhì)水平上觀察到PKCδ在仔鼠出生即出現(xiàn)高表達(dá)。這一結(jié)果與既往我們研究中觀察到的PKCα的表達(dá)不同[6]。提示PKC不同亞類之間表達(dá)模式不同，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中的作用不同。在本研究MMC 致小腦發(fā)育損傷大鼠模型中,觀察到隨著腦汞含量的增加PKCδ mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào),且這種變化呈劑量依賴性關(guān)系。提示 PKCδ 可能是MMC 致腦發(fā)育損傷的關(guān)鍵靶分子。根據(jù)以往MMC理化特性及神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育信號(hào)通路的研究成果，我們分析其可能的機(jī)制與以下因素有關(guān)[12-15]：(1)PKCδ 激活后,上調(diào) Fos 蛋白表達(dá),促進(jìn)蛋白酶、核酸內(nèi)切酶的合成和活化,加速細(xì)胞凋亡;(2)作用細(xì)胞色素 C 釋放,誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡及損傷；(3)促進(jìn)TNF-δ 釋放增加,趨化炎細(xì)胞局部浸潤(rùn), 加重腦組織損傷和細(xì)胞壞死凋亡。另外，我們既往的研究還觀察到氯化甲基汞可以誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，提示甲基汞可能具有潛在的抗腫瘤活性，其確切的機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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[收稿2016-01-23]

(編輯張曉舟)

Effects of Methylmercury chloride exposure on PKCδ expression in rat developmental cerebellum

ZHANG Hong-Yu，LIU Zhong-Shan，WANG Tie-Jun，LI Zhi-Chao, GUO Jie.Department of Radiotherapy,Second Hospital,Jilin University,Changchun 130041,China

Objective:To investigate the effect of Methylmercury chloride chronic exposure on PKCδ expression developing cerebellum.Methods: Establishment of cerebellum damage model of developmental rats by chronic MMC exposure.In Situ Hybridization and Western blot analysis were performed to detect the expression of PKC isozyme.Results: PKCδ was expressed at high levels at birth, but no significant change was observed with the increase in the time of birth corresponding to brain Hg2+level, expression of PKCδ in cerebellum of experimental groups was markedly higher than that of control group.Conclusion: Neurotoxicity of Methylmercury chloride exposure might be mediated by PKCδ expression up-regulating in developmental cerebellum.

Methylmercury chloride;Brain development;PKCδ expression

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.024

R135.13文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

1000-484X(2016)08-1192-03

張宏宇(1972年-)，男，藥學(xué)碩士，主治醫(yī)師，主要從事重金屬神經(jīng)毒作用機(jī)制的研究，E-mail:xmj770818@sina.com。

及指導(dǎo)教師：郭杰(1973年-),女,博士,副教授,主要從事惡性腫瘤治療方面的研究, E-mail:guojie@jlu.edu.cn。