徐祖才　張莎莎　梁　濤　王　靜　彭　燕　張　駿

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遵義563003)

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夏天無注射液參與腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)保護(hù)的NF-κB介導(dǎo)機(jī)制①

徐祖才張莎莎②梁濤王靜③彭燕張駿

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遵義563003)

①本文為國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81460191)及貴州省科學(xué)技術(shù)基金(黔科合J字[2011]2270)。

②共同第一作者,濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 健康體檢管理部，濱州256603。

③遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 預(yù)防保健科，遵義563003。

目的：探討夏天無注射液參與腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)保護(hù)的NF-κB介導(dǎo)機(jī)制。方法：隨機(jī)將雄性SD大鼠分為假手術(shù)組、模型組、夏天無注射液1.0 ml/kg的低劑量組、2.5 ml/kg的中劑量組、5 ml/kg的高劑量組及NF-κB抑制劑(BAY11-7082)組。腦缺血再灌注24 h后，2,3,5氯化三苯基四唑(TTC)染色檢測各組大鼠腦梗死重量百分比；免疫組織化學(xué)技術(shù)及Western blot技術(shù)檢測各組的磷酸化NF-κB表達(dá)變化。結(jié)果：TTC發(fā)現(xiàn)：不同劑量的夏天無注射液及BAY可以減輕腦梗死的總量，其中，高劑量組、中劑量組及抑制劑組之間效果無差異，但三者效果均較低劑量組明顯；免疫組化發(fā)現(xiàn)：主要在模型組中的海馬CA1區(qū)細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)磷酸化NF-κB 表達(dá)，而CA3區(qū)的表達(dá)量較少。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)：不同劑量的夏天無注射液可以模擬BAY11-7082的作用，降低磷酸化NF-κB蛋白的表達(dá)量。結(jié)論：夏天無注射液可能減輕大鼠腦缺血再灌注后梗死程度，其機(jī)制可能是通過抑制NF-κB的過度磷酸化。

夏天無注射液;腦缺血再灌注;NF-κB;神經(jīng)保護(hù)

卒中是全球范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡的第二大常見疾病，約占11.9%，平均每年約670萬人死于卒中，其中缺血性腦卒中約占80%～90%[1]。與缺血性卒中相關(guān)的研究不乏提示炎癥相關(guān)因子的重要作用[2]。氧糖剝奪所引起的缺血中心區(qū)神經(jīng)細(xì)胞死亡，造成神經(jīng)損傷，而炎癥主要導(dǎo)致缺血半暗帶神經(jīng)細(xì)胞死亡[3]。炎癥細(xì)胞的產(chǎn)生及炎癥因子的釋放進(jìn)一步加重神經(jīng)細(xì)胞損傷及增加梗死面積[4]。NF-κB(Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activat-ed B cells)廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi),其在B淋巴細(xì)胞中檢測到，對多種基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控[5,6]。NF-κB是炎癥反應(yīng)中一種重要的蛋白復(fù)合物，它可以被許多炎性分子激活，進(jìn)而啟動炎性細(xì)胞因子的表達(dá)及細(xì)胞凋亡，且與腦損傷相關(guān)[7]，注射用夏天無總堿對大鼠局灶性腦缺血損傷具有治療作用，其機(jī)制可能與保護(hù)神經(jīng)元、抗神經(jīng)元凋亡以及調(diào)控突觸可塑性有關(guān)[8]。隨著對腦缺血再灌注損傷及夏天無研究的研究,抗炎治療能否成為治療缺血性腦損傷的靶點(diǎn)，越來越受到關(guān)注。本研究擬通過造模后肌肉注射夏天無注射液及尾靜脈注射NF-κB抑制劑BAY 11-7082[9]，通過對腦梗死的重量的測定，免疫組化及免疫印跡對NF-κB進(jìn)行檢測，揭示夏天無注射液對缺血再灌注腦損傷所起到的神經(jīng)保護(hù)作用及其發(fā)生機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑江西天施康提供夏天無注射液，從碧云天生物技術(shù)公司購買BAY 11-7082，自基因科技上海有限公司購買抗鼠/兔通用型免疫組化檢測試劑盒，自美國Sigma公司購買抗兔和抗小鼠IgG-HRP以及三羥甲基氨基甲烷(Tris)、牛血清白蛋白(BSA)和G-250考馬斯亮藍(lán)等Western blot所需試劑，自美國Santa公司購買兔抗磷酸化NF-κB抗體及小鼠抗β-actin抗體一抗。

1.2方法

1.2.1腦缺血再灌注大鼠模型制備及分組腹腔注射3.5 ml/kg的10%的水合氯醛進(jìn)行麻醉，將四肢和頭部予以固定，對頸部備皮，行2.0 cm左右的正中切口，先后分離出右頸總動脈(Common carotid artery，CCA)、頸外動脈(External carotid artery，ECA)及頸內(nèi)動脈(Internal carotid artery，ICA)，結(jié)扎ECA近心端，在頸總動脈分叉處約4 mm 處開小口，把MCAO栓線圓頭端經(jīng)CCA進(jìn)入ICA，直至遇阻力停止，均入線長約18～20 mm，對頸內(nèi)動脈結(jié)扎，縫合手術(shù)處，將栓線留置切口外以便拔除。栓塞2 h后將栓線頭端拉至頸內(nèi)、外動脈分叉處，即可再灌注,進(jìn)行評分，評分標(biāo)準(zhǔn)如下：0分，無神經(jīng)損害癥狀；1分，左側(cè)前爪不能完全伸展；2分，向左側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分，行走時(shí)向左側(cè)傾倒；4分，不能自發(fā)行走。評分>2分,即認(rèn)為造模成功，納入正式實(shí)驗(yàn)。假手術(shù)組處理步驟同上，但MCAO栓線進(jìn)線深度限于10 mm，不阻塞大腦中動脈血流。隨機(jī)選擇清潔級SD雄性大鼠60只(250～300 g),購于第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心[許可證號：SCXK(渝)2007-0005]。隨機(jī)分為模型組，假手術(shù)、夏天無注射液1.0 ml/kg的低劑量組、2.5 ml/kg的中劑量組、5 ml/kg的高劑量組及NF-κB抑制劑BAY 11-7082(10 mg/kg)組，尾靜脈注射,各組大鼠均在缺血再灌注前0.5 h用藥(各組大鼠n=5)。

1.2.2TTC檢測不同組大鼠腦梗死體積變化缺血再灌注后24 h，斷頭取腦后，迅速將組織放入-20℃冰箱，15 min后取出，用手術(shù)刀片沿冠狀面自前向后于腦前極與視交叉連線中點(diǎn)處、視交叉處．漏斗柄部、漏斗柄與后葉尾極之間將腦組織均勻切為5等份，將腦片置于1%的TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)中，避光孵育 30 min(37℃)，10 min后翻面。染色后正常腦組織呈現(xiàn)紅色，呈蒼白色的為梗死腦組織，其間界限分明。0%甲醛避光固定，24 h后取出，依次排列后拍照，后分離蒼白色的梗死區(qū)和紅色的非梗死區(qū)，后再稱重[梗死重量百分比計(jì)算法如下：梗死重量百分比(%)=蒼白區(qū)重量/全腦重量×100%]。

1.2.3取材切片及免疫組化腦缺血再灌注24 h后，將大鼠麻醉固定，迅速開胸，將心臟暴露，由左心室插入透灌針至主動脈，剪開右心耳，先用生理鹽水灌注沖洗，當(dāng)流出的液透亮，改用4%多聚甲醛灌流固定，直至大鼠頸部僵硬，斷頭取腦，并迅速將腦組織在4%多聚甲醛中固定過夜，后進(jìn)行石蠟包埋，切片。組化前，現(xiàn)對切片常規(guī)脫蠟水化，3%H2O2室溫避光孵育10 min，滴加磷酸化NF-κB一抗(1：200，陰性對照使用PBS)，4℃過夜，滴加二抗(37℃孵育30 min)，清洗后滴加DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，Leica光學(xué)顯微鏡觀察免疫組化結(jié)果，拍照記錄。

1.2.4Western blot取海馬組織勻漿，加入裂解液(含PMSF，pH7.4)后離心。將上清加入RIPA(含蛋白酶抑制劑)稀釋蛋白沉淀，分裝并凍存于-80℃冰箱。按BCA 法,定量至5 μg/ μl，加入等量×2上樣緩沖液，置于沸水中煮沸變性(約5～10 min)，于-20℃冰箱凍存?zhèn)溆谩Ａ姿峄疦F-κB蛋白測定：等量蛋白樣品(每個(gè)泳道20 μl)經(jīng)10%SDS-聚丙烯酸胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，以濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。將已轉(zhuǎn)膜凝膠置于考馬斯亮藍(lán)染液(約30 min)，脫色液予以洗滌，測凝膠內(nèi)蛋白是否轉(zhuǎn)移完全，后將PVDF 膜置于封閉液內(nèi)(37℃，約1.5 h)，再加稀釋好的一抗磷酸化NF-kB(1∶5 000)，4 ℃冰箱中過夜，再用TBST液洗膜，加人二抗(抗兔IgG-HRP，1∶5 000)，(37℃，孵育約1 h)，后洗膜，再用BeyoECL Plus顯色，膠片曝光顯影，所得結(jié)果使用Quantity one進(jìn)行分析。

2　結(jié)果

2.1不同劑量的ICDP均可減輕腦缺血再灌注大鼠腦梗死程度 TTC結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖1、2及表1)：假手術(shù)組中未見明顯腦梗死灶；模型組中，大鼠腦梗死程度較重(20.34±1.29)，然而，高(8.08±1.36)、中(8.57±1.49)和低(13.44±0.99)劑量的ICD及NF-κB 的抑制劑BAY 11-7082(8.64±1.49)均可使得相應(yīng)組別大鼠腦梗死程度減輕。

2.2免疫組化檢測不同劑量ICDP對腦缺血再灌注大鼠腦海馬組織磷酸化NF-κB影響如圖3所示(×400)，磷酸化NF-κB主要表達(dá)在細(xì)胞胞核中，在胞漿中表達(dá)量較少，主要表達(dá)部位在大鼠腦海馬組織的CA1區(qū)，而少量在CA3區(qū)，并且，在模型組中表達(dá)最為明顯，而在假手術(shù)組、不同劑量ICDP干預(yù)組及BAY 11-7082組中細(xì)胞核中表達(dá)不明顯。

圖1　腦缺血后腦組織切片TTC染色Fig.1　TTC staining of brain sections after cerebral infarctionNote: A.Model group;B.Sham surgery group;C.ICDP-H(5 ml/kg) group;D.ICDP-M( 2.5 ml/kg) group;E.ICDP-L(1 ml/kg) group;F.BAY 11-7082(10 mg/kg) group.

圖2　不同劑量ICDP對大鼠腦缺血再灌注腦梗死重量的影響±s，n=5)Fig.2　Effect of ICDP on brain infarct weight in ischemia-reperfusion injury of rat ±s，n=5)Note: *.P<0.05.

2.3ICDP對腦缺血再灌注大鼠腦組織 NF-κB蛋白印跡的檢測Western blot檢測結(jié)果表明，假手術(shù)組可少量表達(dá)NF-κB蛋白(0.30±0.03)；與模型組比較(1.05±0.05)，夏天無高(0.57±0.02)、中(0.59±0.03)、低(0.62±0.03)劑量組及BAY 11-7082組(0.42±0.01)蛋白表達(dá)明顯減少(P<0.01)(圖4及表2)。

表1　不同組別大鼠腦缺血再灌注腦梗死重量重復(fù)測量方差分析結(jié)果Tab.1　ANOVA for repeated measurements in brain infarct weight after ischemia-reperfusion in different groups

圖3　ICDP對大鼠腦缺血再灌注損傷腦組織磷酸化NF-κB p65表達(dá)的影響Fig.3　Effect of ICDP on expression of phosphorylated NF-κB p65 in ischemia-reperfusion injury of rat brainNote: A.BAY 11-7082(10 mg/kg) group;B.ICDP-L(1 ml/kg) group;C.ICDP-M( 2.5 ml/kg) group;D.ICDP-H(5 ml/kg) group;E.Sham surgery group;F.Model group.

圖4　ICDP對缺血再灌注大鼠腦組織p-NF-κB表達(dá)的影響Fig.4　Effect of ICDP at expression of p-NF-κB in ischemia-reperfusion injury of rat ±s，n=5 )Note: *.P<0.05；#.P<0.05.

表2　不同組別大鼠腦缺血再灌注后腦組織p-NF-κB重復(fù)測量方差分析結(jié)果Tab.2　ANOVA for repeated measurements in expression of p-NF-κB in ischemia-reperfusion injury in different groups

3　討論

本實(shí)驗(yàn)所用模型可模擬人腦缺血再灌注損傷過程，選用ICDP進(jìn)行中藥治療，并以NF-κB信號通路的特異性抑制劑BAY11-7082為對照，從大鼠腦梗死體積及NF-κB磷酸化水平的變化，來檢測ICDP的療效。腦組織缺血后造成損傷的因素較多，可以表現(xiàn)為興奮性氨基酸毒性作用、鈣超載、自由基反應(yīng)、炎癥和細(xì)胞凋亡[10,11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果對于對夏天無注射液對腦缺血再灌注后神經(jīng)保護(hù)機(jī)制的研究具有重大意義。其中TTC染色可清晰、直觀的顯示腦組織的梗死區(qū)域，且發(fā)現(xiàn)了ICDP各劑量組同BAY 11-7082組一樣，可使得大鼠腦梗死體積縮小。其結(jié)果表明ICDP可以顯著減輕大鼠缺血再灌注后腦損傷，具有神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)制可能與NF-κB信號通路相關(guān)。

已有研究表明NF-κB對參與了缺血性腦卒中損傷[12]。NF-κB包含 IκB 依賴性的經(jīng)典和非經(jīng)典途徑[13]。當(dāng)感受到各種細(xì)胞內(nèi)外因素時(shí)，IκB激酶活化，繼而磷酸化及泛素化，并釋放出多個(gè)NF-κB二聚體，消除了IκB的抑制作用[14,15]。具核定位功能的p50協(xié)助RelA(p65)核轉(zhuǎn)移，繼而翻譯及修飾，NF-κB二聚體進(jìn)一步活化，與目的基因及特定DNA序列結(jié)合，調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄[16]。Bay11-7082可通過抑制IkB磷酸化，而抑制NF-κB的活化，從而發(fā)揮其生物學(xué)效能[17]。本實(shí)Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)Bay11-7082和ICDP各劑量組均可明顯抑制NF-κB磷酸化。免疫組化發(fā)現(xiàn)磷酸化NF-κB主要在胞核中表達(dá)，而ICDP及Bay11-7082均抑制了磷酸化NF-κB 的核轉(zhuǎn)移。

NF-κB信號通路與甲狀腺癌及血液系統(tǒng)相關(guān)疾病之間具有相關(guān)性，并且，其BAY 11-7082能有效抑制碘131誘導(dǎo)的NF-κB相關(guān)的細(xì)胞凋亡，且能改變血小板的形狀及其播散狀態(tài)，從而起到相應(yīng)的療效[18]。通過本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，抑制過度磷酸化的NF-κB可以較好地保護(hù)缺血再灌注后腦組織的損傷，因此，本研究為尋求腦缺血后再灌注損傷的臨床治療新策略提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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[收稿2016-01-25修回2016-04-21]

(編輯許四平)

Study of mechanism on NF-κB mediates injection coryadlis decumbens pers participated in neuroprotection after ischemia reperfusion of rats

XU Zu-Cai，ZHANG Sha-Sha，LIANG Tao，WANG Jing，PENG Yan，ZHANG Jun.Department of Neurology，Affiliated Hospital of Zunyi Medical College，Zunyi 563003,China

Objective:To investigate themechanism on NF-κB mediates the injection coryadlis decumbens pers(ICDP) participated in neuroprotection after ischemia reperfusion of rats.Methods: The SD rats were rando mly divided into several groups as follows:Sham operation group,Model group,1.0 ml/kg ICDP group(Low-dose,ICDP-L),2.5 ml/kg ICDP group(Middle-dose,ICDP-M),5 ml/kg ICDP group(High-dose,ICDP-H),and NF-κB inhibitor group(BAY11-7082).24 h after anesthetize，the volume of infarct sections in different groups were detected by TCC staining,and the phosphorylated NF-κB expression in rats brain was observed by immunohistochemistry and Western blot.Results: The TTC staining showed that different concentration of ICDP and BAY11-7082 could reduce the brain infarction volume significantly.There was no significant different effect among the ICDP-H group,ICDP-M group and inhibitor group,however,the effect in these three groups was more effective than that in the ICDP-M group.In addition,the results of immunohistochemistry indicated that phosphorylated NF-κB p65 expressed in brain tissue located mainly at the nucleus neuronal cells in the CA1 region of hippocampusin model rats,and the expression of phosphorylated NF-κB were significantly reduced inICDP groups and BAY11-7082 group.Conclusion: The ICDP can reduce brain infarct volume after ischemia reperfusion of rats.The neuralprotection mechanism of ICDP may relative toinhibits thehyperphosphorylation of NF-κB.

Injection coryadlis decumbens pers；Cerebral ischemia reperfusion；NF-κB；Neuroprotection

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.023

R743.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

1000-484X(2016)08-1187-05

徐祖才(1981年-)，男，博士，副主任醫(yī)師，主要從事腦血管病及癲癇發(fā)病機(jī)制研究。

及指導(dǎo)教師：張駿(1964年-)，男，主任醫(yī)師，主要從事腦血管病機(jī)制研究，E-mail：zyzj8586@163.com。