程群英　鄒春標(biāo)

(遂昌縣婦幼保健所檢驗(yàn)科，麗水323300)

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流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)紅細(xì)胞滲透脆性有效性分析

程群英鄒春標(biāo)①

(遂昌縣婦幼保健所檢驗(yàn)科，麗水323300)

①遂昌縣婦幼保健所男性婚檢科，麗水323300。

紅細(xì)胞滲透脆性試驗(yàn)(RBC fragility test)是利用不同濃度的低張氯化鈉(Sodium chloride，NaCl)溶液來(lái)測(cè)定紅血球細(xì)胞膜滲透壓的耐受性。當(dāng)紅血球處于低張溶液中時(shí)，水分會(huì)移入細(xì)胞內(nèi)，使得紅血球膨脹，隨著NaCl濃度降低，紅血球逐漸脹大破裂而釋出血紅素，出現(xiàn)溶血(Hemolysis)現(xiàn)象。然而，紅血球細(xì)胞膜滲透壓的耐受性跟細(xì)胞表面積與體積比(Surface area to volume ratio，S/V)有關(guān)，S/V 比值較大之紅血球?qū)Φ蛷埲芤旱哪褪苄暂^高，相反地，比值較小者對(duì)低張溶液的耐受性較低，容易導(dǎo)致紅血球破裂，即紅細(xì)胞滲透脆性增加[1，2]。

臨床上，紅細(xì)胞滲透脆性試驗(yàn)常應(yīng)用于遺傳性球形紅血球增多癥(Hereditary spherocytosis)的輔助診斷，由于球狀紅血球S/V比值較小，在低張溶液中承受水分移入細(xì)胞內(nèi)脹大的能力較正常雙凹盤(pán)狀紅血球差，因此紅細(xì)胞滲透脆性相對(duì)增加[3]。對(duì)于輕度遺傳性球形紅血球增多癥的病人，若將其血液檢體于37℃孵育24 h后進(jìn)行紅細(xì)胞滲透脆性試驗(yàn)，可增加其敏感度，但目前實(shí)驗(yàn)室常用的孵育型紅細(xì)胞滲透脆性試驗(yàn)在測(cè)試效率和準(zhǔn)確性方面差強(qiáng)人意，急需尋找新的測(cè)試方法進(jìn)行紅細(xì)胞滲透脆性試驗(yàn)。

本文在以上文獻(xiàn)研究的基礎(chǔ)上，利用流式細(xì)胞儀的方法，探測(cè)紅血球細(xì)胞膜上的Band 3，與傳統(tǒng)紅細(xì)胞滲透脆性試驗(yàn)需要2 d的操作時(shí)間相比較，使用流式細(xì)胞儀的檢查在2 h之內(nèi)即可完成，可以針對(duì)遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥患者做快速的檢查。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1對(duì)象本研究的對(duì)象為本院內(nèi)科診斷的各類病人，總共33例，其中男性為15例，女性為18例，年齡在12～47歲，各類貧血疾病組，共20例，其中男性8例，女性12例，遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥(Hereditary Spherocytosis)組，共8例，其中男性4例，女性4例，以及健康正常人組，共5例，男3例，女2例。

1.1.2儀器設(shè)備①酸堿指示計(jì)：Jenco micrecom-puter pH-VISION 6071;②離心機(jī)：Kubota 5400，Kubota KA-1000;③微量離心機(jī)：Qualitron DW-41;④混合器：Thermolyne Maxi-Mix II Type 37600 Mixter;⑤光學(xué)顯微鏡：Olympus BH2;⑥電子天秤：Mettler PJ 300;⑦電磁加熱攪拌器：Thermolyne Nuova II stir plate;⑧流式細(xì)胞儀：Backman Coulter Epics XL;⑨載玻片：Menzel-Glaser SuperFrost Micrescope Slides;⑩蓋玻片。

1.2方法

1.2.1試劑處理①周邊血全血(Whole blood)：以 EDTA 作為抗凝劑，采取各種貧血疾病的病人與正常人的周邊全血做為實(shí)驗(yàn)材料；②全白血球(Total White Blood Cell)：將采集到病人與正常人周邊血液，以3 000 r/min轉(zhuǎn)速(Kubota KA-1000)，離心15 min后，取血漿與紅血球中間Buffy coat 的白血球細(xì)胞。由于會(huì)吸取到部分紅血球，因此加入2次去離子水(ddH2O)混合作用 10 s，再加入等量的 2 倍 PBS 混合均勻來(lái)溶解紅血球，以300 r/min離心5 min，去除上清液，重復(fù)此步驟數(shù)次，直到沉淀物完全去除紅血球?yàn)橹?。③單核?Mononuclear Cell)：將10 ml血液(若不足則以1倍 PBS 補(bǔ)足至 10 ml)，緩慢加在 5 ml 的 HISTOPAQUE-1077 之上，以400 r/min離心30 min后，試管中之液體將分為三層，上二層中間白色霧狀環(huán)，即為單核球-淋巴球?qū)?。吸取所得的白血球?倍 PBS ，300 r/min離5 min方式洗滌一次，若看到紅色顆粒存在，表示有紅血球細(xì)胞殘留，則以加入二次去離子水混合作用 10 s，再加入等量的 2 倍 PBS 混合均勻方式溶解紅血球，以 300 r/min離心5 min，去除上清液，重復(fù)此步驟2～3次，直到沉淀物完全去除紅血球?yàn)橹埂?/p>

1.2.2實(shí)驗(yàn)方法①網(wǎng)狀紅血球的計(jì)數(shù)：取待測(cè)周邊血全血，滴一滴于5 ml 圓底離心管中，取等量Reticulocyte stain(Sigma)均勻混合，取少量做成血液抹片，快速風(fēng)干，使用光學(xué)顯微鏡以×100油鏡觀察計(jì)數(shù)。網(wǎng)狀紅血球細(xì)胞中會(huì)見(jiàn)到藍(lán)色的RNA 殘留顆粒。計(jì)算1 000顆紅血球細(xì)胞中，所見(jiàn)得網(wǎng)狀紅血球的數(shù)目，最后換算成百分比。所得的結(jié)果以﹪表示；②紅血球母細(xì)胞的計(jì)數(shù)：將取得之周邊血全血，取適量做成血液抹片，快速風(fēng)干，以流式細(xì)胞染色法染色-染色45 s，再加上兩倍體積染色90 s，以自來(lái)水輕輕將染劑沖洗干凈，置于光學(xué)顯微鏡下，以×100油鏡觀察。計(jì)算方法為：計(jì)算100 顆白血球的同時(shí)，所見(jiàn)到紅血球母細(xì)胞的數(shù)目，以Cell /100WBC表示；③紅血球 Band 3的測(cè)定：以EDTA 做為抗凝劑取得病人之周邊血全血，300 r/min離心15 min后，取最下層紅血球部分，以1 倍PBS 洗滌(離心轉(zhuǎn)速3 000 r/min，5 min)，制成洗滌濃縮紅血球(Wash packed RBC)。取5 μl的洗滌濃縮紅血球與25 μl 0.5 mg/ml的 EMA混合，置于室溫下避光反應(yīng)1 h。去上清液后，以0.5% BSA-PBS 洗滌3次(以Qualitron DW-41 微量離心機(jī)最高轉(zhuǎn)速、離心10 s)，加入500 μl 的1 倍PBS 制成細(xì)胞懸浮液。取此細(xì)胞懸浮液100 μl，再加入1.4 ml的1倍PBS，以流式細(xì)胞儀(Flow Cytometer)測(cè)定；④網(wǎng)狀紅血球 Band 3 的測(cè)定：以EDTA 做為抗凝劑取得病人之周邊血全血10 μl，與50 μl 0.5 mg/ml 的EMA 混合，至于室溫下避光反應(yīng)1 h。去上清液后，以0.5% BSA-PBS 洗滌3次(以Qualitron DW-41 微量離心機(jī)最高轉(zhuǎn)速、離心10 s)。將細(xì)胞轉(zhuǎn)置于5 ml 圓底離心管中，利用細(xì)胞穿透試劑組進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)RNA 的染色，使用的染劑為0.01%之PY 50 μl，置于室溫下避光反應(yīng)30 min，以1 倍PBS、300 g、5 min，洗滌1次，以適量的1 倍PBS 制成細(xì)胞懸浮液，以流式細(xì)胞儀(Flow Cytometer)測(cè)定；⑤流式細(xì)胞儀的設(shè)定：流式細(xì)胞儀設(shè)定探測(cè)終止條件為，當(dāng)所探測(cè)到的細(xì)胞總數(shù)達(dá)到10 萬(wàn)顆時(shí)即終止；或者當(dāng)細(xì)胞數(shù)不足時(shí)，流式細(xì)胞儀的探測(cè)時(shí)間達(dá)5 min后終止。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析皆使用t-test作為比較的方法。

2　結(jié)果

2.1建立測(cè)定網(wǎng)狀紅血球band 3 含量的方法首先觀察流式細(xì)胞儀下血球分布情形：首先先看全血檢體中，各種血球在流式細(xì)胞儀下的分布情形。依流式細(xì)胞儀正向激光(FS，forward scatter，測(cè)細(xì)胞大小)與側(cè)向激光(SS，side scatter，測(cè)細(xì)胞顆粒性)來(lái)看，細(xì)胞大致的分布結(jié)果如圖1所示。

在決定打洞的時(shí)間上，分別采用3 min、4 min、5 min做實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，在3 min與4 min的部分并無(wú)多大的差別，但是如果打洞5 min，在大部分的實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，細(xì)胞都會(huì)破裂，如圖2所示。又雖然3 min與4 min的細(xì)胞分布情形相似，為避免打洞時(shí)間過(guò)短而造成打洞不完全的情形，因此在往后實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，皆以4 min作為打洞的反應(yīng)時(shí)間。

圖1　流式細(xì)胞儀FS/SS 血球分布圖Fig.1　Flow cytometry FS/SS blood cell distribution map

圖2　不同打洞時(shí)間對(duì)細(xì)胞分布的影響Fig.2　Effects of different time on cellular distribution holes

圖3　HS 病人Band 3表現(xiàn)情形Fig.3　HS patient Band 3 performance situationsNote: A,B,C,D,E are five different hereditary spherocytosis patients,no blood relationship between each other.N is number of experiments,MFI Band performance was measured on amount of average of three patients with red blood cells.

圖4　各種貧血患者Band 3的統(tǒng)計(jì)圖Fig.4　All kinds of anemia in patients with charts of Band 3Note: All patients anemia Band3 measured values for statistical comparison of the MFI,Clearly see HS patients Band3 measured the MFI value than other anemia disease Low.

表1　紅血球Band 3表現(xiàn)量的比較Tab.1　Comparison of amount of erythrocyte Band 3 performance

圖2A為全血(Whole Blood)細(xì)胞分布圖，可以見(jiàn)到大部分的細(xì)胞為紅血球。圖2B為全白血球(Total WBC)分布圖，可以明顯見(jiàn)到四群細(xì)胞，依細(xì)胞大小以及顆粒性可大致看出單核球(Monocyte)與淋巴球(Lymphocyte)的分布。圖2C則為紅血球細(xì)胞分布圖。

2.2各種病人紅血球band 3含量的比較接下來(lái)我們用此方法來(lái)評(píng)估所選病人的紅血球band 3的表現(xiàn)情形，圖3為遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥病人紅血球Band 3的表現(xiàn)，從圖3中可以看到，遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥病人所測(cè)得的結(jié)果約在40MFI上下，明顯較低于正常人與貧血癥患者。將所有檢體整理如圖4所示，可以明顯看出遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥的患者，其紅血球細(xì)胞膜上Band 3的表現(xiàn)量與其他種類的貧血疾病相較之下有較低的現(xiàn)象，如表1所示。

表2　網(wǎng)狀紅血球Band 3表現(xiàn)量Tab.2　Reticulocyte Band 3 Performance Measures

2.3各種貧血病人網(wǎng)狀紅血球與成熟紅血球band 3 含量的比較通過(guò)前文建立好的測(cè)量網(wǎng)狀紅血球Band 3的方式，分別針對(duì)網(wǎng)狀紅血球與成熟紅血球來(lái)測(cè)定，將所得結(jié)果加以比較整理如表2所示。發(fā)現(xiàn)無(wú)論是哪一種血液疾病，網(wǎng)狀紅血球Band 3的熒光表現(xiàn)量皆比成熟紅血球來(lái)的高。

3　討論

造成遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥的原因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)蛋白的缺失。無(wú)論是屬于細(xì)胞膜表面蛋白的缺失，或者是細(xì)胞骨架蛋白的缺失，球形血球的形成，都必須經(jīng)過(guò)一段時(shí)間，在體內(nèi)循環(huán)，經(jīng)由腎臟、脾臟等器官之后，受到環(huán)境壓力之后再漸漸形成為小型的小球形血球。即使不是細(xì)胞膜表面蛋白Band3缺失，也會(huì)在此過(guò)程中釋放出含有Band3的顆粒，因此以EMA方法測(cè)得紅血球細(xì)胞膜表面Band3表現(xiàn)量會(huì)比正常人或者其他貧血癥來(lái)得低。網(wǎng)狀紅血球是屬于初期剛釋放至血液循環(huán)中的紅血球，可視為周邊循環(huán)血中紅血球最原始的狀態(tài)。所以研究網(wǎng)狀紅血球細(xì)胞膜表面Band 3表現(xiàn)的情形，對(duì)于遺傳性球形紅細(xì)胞或者是其他蛋白缺失造成的紅細(xì)胞病變有相當(dāng)?shù)膸椭?。過(guò)去的文獻(xiàn)中并無(wú)特別針對(duì)網(wǎng)狀紅血球提出分析其細(xì)胞膜表面Band 3含量的方法[4，5]，因此在本論文中建立的一套利用流式細(xì)胞儀的方式，快速探測(cè)網(wǎng)狀紅血球Band 3表現(xiàn)量的方法，有其在研究上使用的價(jià)值。然而因?yàn)榫W(wǎng)狀紅血球從骨髓中釋放到周邊血液之后，經(jīng)過(guò)1～2 d就會(huì)完全成為成熟的紅血球，因此此方法的限制是必須從病人體內(nèi)取得檢體后24 h內(nèi)操作。

在使用流式細(xì)胞儀測(cè)定遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥的結(jié)果中，遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥的患者，其紅血球細(xì)胞膜表面Band 3 表現(xiàn)量明顯較其他疾病或正常人低，若能加以分析其靈敏度與準(zhǔn)確性，便能利用此方法取代傳統(tǒng)的紅血球滲透脆性試驗(yàn)。也由于此方法所需要的檢體數(shù)量極少，故也可以用以做為新生兒遺傳性疾病篩檢之用。另外在測(cè)得Band3 的結(jié)果與臨床血液檢查的結(jié)果比較之下，于表2中首先可以見(jiàn)到，再生不良性貧血病人檢體的MCV 值平均較正常人為有意義的升高，若將其Band 3 MFI 表現(xiàn)量跟normal 群組比較之下，也是有一定程度的上升。因此高M(jìn)CV還是會(huì)影響到紅血球細(xì)胞膜上Band 3 的表現(xiàn)量，這與先前發(fā)表的報(bào)告所述[6，7]，Band 3 的表現(xiàn)與細(xì)胞大小無(wú)關(guān)的論點(diǎn)并不相符。

再以其他貧血患者血液學(xué)檢查來(lái)做比較，自體免疫性溶血癥的病人，MCV值較正常人來(lái)的高，其Band 3 MFI 表現(xiàn)量似乎也較正常人為高，雖然統(tǒng)計(jì)上來(lái)說(shuō)是沒(méi)有意義，但是整體上是有MCV值越大，MFI值越高的趨勢(shì)。在乙型海洋性貧血癥的患者與后天溶血性貧血患者的結(jié)果來(lái)看，二者的MCV 值都比正常人來(lái)的小，但是其紅血球細(xì)胞膜上Band 3 表現(xiàn)量并沒(méi)有降低的現(xiàn)象。這又與先前MCV值與Band 3的量有關(guān)的說(shuō)法矛盾[8]。猜測(cè)可能是因?yàn)镸CV 所測(cè)得為平均紅血球容積，雖然是細(xì)胞大小的指標(biāo)，但是Band 3 平均散布在紅血球細(xì)胞膜表面，影響其表現(xiàn)量多寡應(yīng)是取決于血球細(xì)胞膜表面積，而MCV值所測(cè)的是平均血球容積，代表的是血球的體積，而雖然體積相同卻會(huì)因?yàn)樾螤畈煌胁煌谋砻娣e。所以雖然遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥患者的MCV值與正常人比較之下并沒(méi)有差別，但是其Band 3表現(xiàn)量卻明顯低于一般血球細(xì)胞。推測(cè)細(xì)胞變形成圓形導(dǎo)致表面積下降，因此無(wú)法以MCV值來(lái)討論遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥。但是若單取實(shí)驗(yàn)中MCV值較高的病人來(lái)做比較，結(jié)果又可以明顯看出，MCV高的病人(MCV>100 fl)，其Band 3的表現(xiàn)量也相對(duì)較高，顯示MCV值相對(duì)較高的血球，與Band 3的含量上升有著某種關(guān)系存在。

在成功建立探測(cè)網(wǎng)狀紅血球細(xì)胞膜上Band 3 的方法之后，針對(duì)各種血液疾病病人的周邊血液做網(wǎng)狀紅血球Band 3 的分析，結(jié)果如表3所示，網(wǎng)狀紅血球的Band 3表現(xiàn)量，約是成熟紅血球的兩倍，換算成比值來(lái)看，可以發(fā)現(xiàn)一個(gè)有趣的現(xiàn)象。在Leukemia 病人檢體測(cè)得的結(jié)果，其Ret/RBC Band 3的比值相對(duì)較小，而此等疾病是在骨髓造血上發(fā)生的問(wèn)題，因此Band 3的變化可能可以作為骨髓內(nèi)紅血球系細(xì)胞形成過(guò)程的指標(biāo)。

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[收稿2015-12-28修回2016-03-18]

(編輯許四平)

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.021

R556.6文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

1000-484X(2016)08-1179-04

程群英(1971年-)，女，主管檢驗(yàn)師 ，主要從事臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)方面的研究。