詹爐停　溫桂平　趙　敏　依　含　劉江武　郭小怡　林海軍　黃劉女　夏寧邵　鄭子崢

(廈門大學(xué)分子疫苗學(xué)與分子診斷學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心，公共衛(wèi)生學(xué)院，廈門361102)

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復(fù)合前列腺特異性抗原的單克隆抗體制備及化學(xué)發(fā)光法免疫定量檢測試劑研究①

詹爐停溫桂平趙敏②依含②劉江武③郭小怡②林海軍③黃劉女③夏寧邵②鄭子崢②

(廈門大學(xué)分子疫苗學(xué)與分子診斷學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心，公共衛(wèi)生學(xué)院，廈門361102)

①本文為863計(jì)劃資助項(xiàng)目(No.2011AA02A101;2012AA02A307) 。

②廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廈門361102。

③廈門萬泰凱瑞生物技術(shù)有限公司，廈門361000。

目的：獲得特異性檢測復(fù)合前列腺特異性抗原(c-PSA)的單克隆抗體配對，建立基于化學(xué)發(fā)光c-PSA免疫定量試劑。 方法：利用市購c-PSA抗原免疫6周齡雌性BALB/c小鼠，間接法ELISA差異篩選抗c-PSA、游離前列腺特異性抗原(f-PSA)、總前列腺特異型抗原(t-PSA)的抗體，抗體配對后化學(xué)發(fā)光定量檢測血清中c-PSA蛋白。 結(jié)果：獲得抗體配對1A10/7D6-SAE，經(jīng)c-PSA標(biāo)準(zhǔn)品及臨床血清樣本初步篩選，該抗體配對適用于基于化學(xué)法發(fā)光的免疫反應(yīng)定量檢測試劑的開發(fā)；血清陽性樣本與陰性樣本檢測結(jié)果顯示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1)；陽性樣本定量結(jié)果與Siemens公司復(fù)合前列腺特異性抗原測定試劑盒(直接化學(xué)發(fā)光法)的相關(guān)系數(shù)為0.97；線性范圍為0.1～100 ng/ml；檢測靈敏度為0.005 ng/ml。 結(jié)論：成功篩選獲得特異性檢測c-PSA的抗體配對，并開發(fā)c-PSA化學(xué)發(fā)光免疫定量試劑，其檢測能力與國際主流試劑相當(dāng)。

復(fù)合前列腺特異性抗原；單克隆抗體；化學(xué)發(fā)光；定量試劑

前列腺癌(Carcinoma of prostate，PCa)是威脅老年男性健康的主要腫瘤，發(fā)病率不斷上升，早期診斷是進(jìn)行根治性治療的關(guān)鍵[1]。PCa早期診斷和篩檢主要靠直腸指檢、直腸B超、血清前列腺特異性抗原的檢測，結(jié)合針刺活檢組織病理結(jié)果確診[2]。1979年Wang等從前列腺組織中分離和提純前列腺特異性抗原(Prostate specific antigen， PSA)[3]，1980年P(guān)apsidero等[4]在晚期前列腺癌患者的血清中檢測出PSA，成為前列腺癌篩選的重要指標(biāo)，廣泛應(yīng)用于臨床[5]。但PSA特異性低，在鑒別炎癥、良惡性腫瘤上存在一定的誤差[6]。血清t-PSA免疫反應(yīng)性的主要形成物包括游離PSA(Free prostate specific antigen，f-PSA)(20%)和復(fù)合PSA(Complexed prostate specific antigen,c-PSA)(80%)[7]。聯(lián)合t-PSA及f-PSA/t-PSA的比值作為前列腺癌輔助診斷，可一定程度上提高靈敏度和特異性[8]，但f-PSA在血清中含量低、不穩(wěn)定，容易帶來誤差，因此，該方法對4～10 ng/ml灰區(qū)內(nèi)的患者仍難以做出確切鑒別診斷[9]。c-PSA主要由PSA與α1抗胰蛋白酶(α1-antichymotrypsin，ACT)結(jié)合形成，較f-PSA血清中含量高、穩(wěn)定。研究表明，c-PSA可提高PCa診斷的靈敏度，與傳統(tǒng)的t-PSA及計(jì)算f-PSA/t-PSA的比值相比，對前列腺癌的檢測準(zhǔn)確度有較大提高[10]。因此，c-PSA的定量檢測結(jié)合t-PSA及f-PSA/t-PSA檢測，有助于灰區(qū)前列腺癌診斷特異性的提高[11]，減少不必要的活體組織檢查[12]。

化學(xué)發(fā)光免疫診斷技術(shù)因其具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)[13]，被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥、化學(xué)分析等領(lǐng)域中[14]。該診斷技術(shù)與全自動化學(xué)發(fā)光分析儀器相結(jié)合，可大大提高醫(yī)院診斷效率[15]。目前國內(nèi)尚無特異性檢測c-PSA化學(xué)發(fā)光免疫定量試劑，且國外試劑價(jià)格昂貴，不利于大范圍的推廣。

本研究利用市購c-PSA抗原免疫小鼠，篩選得到c-PSA、t-PSA特異性抗體，進(jìn)一步通過抗體配對及調(diào)試，建立復(fù)合型前列腺特異性抗原化學(xué)發(fā)光定量檢測試劑，其與Siemens公司的復(fù)合前列腺特異性抗原測定試劑盒(直接化學(xué)發(fā)光法)的相關(guān)性高，為臨床檢驗(yàn)及診斷提供良好的依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物BALB/c、F1品系小鼠購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司，飼養(yǎng)于分子疫苗學(xué)與分子診斷學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室SPF級動物房內(nèi)，本實(shí)驗(yàn)遵循《實(shí)驗(yàn)動物保護(hù)條例》。

1.1.2細(xì)胞小鼠骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0細(xì)胞由廈門萬泰公司饋贈，培養(yǎng)于含10% 胎牛血清、50 μg/ml青霉素、50 μg/ml鏈霉素的1640HT培養(yǎng)基(pH7.2)中，5% CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。

1.1.3主要試劑及試劑盒弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購自美國Sigma公司；RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；優(yōu)級胎牛血清(FBS)購自德國PAA公司；96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板購自美國COSTAR公司；復(fù)合前列腺特異性抗原、游離前列腺特異性抗原購自美國Fitzgerald公司；西門子復(fù)合前列腺特異性抗原測定試劑盒(直接化學(xué)發(fā)光法)購自美國西門子公司。

1.2方法

1.2.1動物免疫初次免疫選取6周齡BALB/c雌性小鼠皮下多點(diǎn)注射弗氏完全佐劑乳化后的免疫原c-PSA，劑量為50 μg，體積為200 μl。2周后30 μg的抗原與弗氏不完全佐劑乳化后皮下加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)2次后小鼠血清抗體滴度達(dá)到平臺期，脾臟沖擊免疫20 μg，進(jìn)行融合實(shí)驗(yàn)。每次免疫前眼底采血，放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱 30 min，12 000 r/min高速離心 10 min后，取血清-80 ℃保存，利用間接法 ELISA檢測血清c-PSA及f-PSA抗體滴度。

1.2.2融合篩選及單克隆抗體制備無菌條件下取小鼠脾臟細(xì)胞研磨成脾細(xì)胞懸液，使用PEG 1450促進(jìn)脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合；用c-PSA、f-PSA包板，通過常規(guī)酶聯(lián)免疫吸附法ELISA差異篩選特異性針對c-PSA陽性、f-PSA陽性及t-PSA陽性細(xì)胞株，有限稀釋法進(jìn)行克隆化，獲得的穩(wěn)定細(xì)胞株擴(kuò)增、腹腔注射F1品系小鼠腹腔，7 d后收集腹水，硫酸銨沉淀法、Protein A柱純化得到單克隆抗體?？贵w進(jìn)行12%的SDS-PAGE分析，觀察樣品純度。

1.2.3標(biāo)本相關(guān)性分析用45份前列腺癌病患血清樣本南京軍區(qū)福州總醫(yī)院提供。

1.2.4化學(xué)發(fā)光法免疫分析采用磁珠法標(biāo)記包被抗體，吖啶酯法標(biāo)記檢測抗體，室溫平衡封閉好的微孔板，加入50 μl磁珠標(biāo)記1A10抗體和25 μl抗原或待測物及50 μl緩沖液，磁力板上靜置室溫孵育15 min使磁珠完全吸附，pH7.4含0.05%TWEEN-20的PBS(PBST)洗3次后吸干，加入50 μl 1%吖啶酯標(biāo)記的抗體緩沖液7D6-SAE 50 μl(1:500)，磁力板上靜置室溫孵育10 min使磁珠完全吸附，PBST洗3次吸干；微孔板中加入200 μl洗滌液，轉(zhuǎn)移至2 ml玻璃發(fā)光管中，磁力板上靜置室溫孵育10 min使磁珠完全吸附，吸干上清，加入激發(fā)A液100 μl，上機(jī)檢測再加入激發(fā)B液100 μl，檢測發(fā)光值。

1.3數(shù)據(jù)分析方法采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS13.0對檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間差異采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1c-PSA蛋白、f-PSA蛋白免疫原性的檢測市購c-PSA、f-PSA抗原包板，用市購c-PSA抗體ELISA檢測抗原的反應(yīng)性，結(jié)果如圖1所示，c-PSA與c-PSA抗體具有較好的反應(yīng)性，表明購買的c-PSA抗原性好。

2.2小鼠多抗血清效價(jià)動態(tài)分析c-PSA抗原免疫小鼠后通過ELISA檢測多抗血清的效價(jià)，結(jié)果顯示(圖2)加強(qiáng)免疫兩針后血清抗c-PSA的滴度達(dá)到平臺期，最后一針進(jìn)行脾臟免疫加強(qiáng)，并進(jìn)行細(xì)胞融合。

圖1　c-PSA與f-PSA抗原的鑒定Fig.1　Detection of antigen c-PSA and f-PSA

圖2　c-PSA免疫鼠多抗血清監(jiān)測Fig.2　Immunogenicity of c-PSA in miceNote: Prim.Primary immune;Boost 1.First boost immune;Boost 2.Second boost immune;Fusion.Spleen immune.

2.3單克隆抗體性質(zhì)鑒定對小鼠開展融合篩選，獲得8株單克隆抗體。3株針對c-PSA及5株針對t-PSA，通過c-PSA標(biāo)準(zhǔn)品及陽性臨床血清樣本的初步篩選，其中單抗7D6、1A10可以較好形成抗體配對進(jìn)行樣品的檢測。使用抗體分型檢測試劑對單克隆抗體進(jìn)行分析，其中7D6為IgG 1亞型，1A10為IgG 2b亞型；c-PSA、f-PSA抗原檢測單抗的EC50結(jié)果如圖3所示。

2.4化學(xué)發(fā)光定量檢測試劑的建立及臨床應(yīng)用初步評價(jià)

2.4.1定量檢測試劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立利用市購的Siemens公司的c-PSA校準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，其校準(zhǔn)品的濃度梯度為0.05、0.25、2、5、12.5、25、50、100 ng/ml。采用Prism GraphPad 5軟件進(jìn)行4參數(shù)擬合分析，2次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的R2為0.998 4、0.998 0(見圖4)。

圖3　PSA單抗性質(zhì)鑒定Fig.3　Property identification of PSA antibodiesNote: A.SDS-PAGE of purified mAb7D6 and 1A10;M.Pre-stained protein molecular weight marker;Lane 1.Purified mAb 7D6;Lane 2.Purified mAb 1A10;B.Isotype analysis of mAbs;C.ELISA EC50 test of c-PSA.

圖4　c-PSA定量檢測試劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立Fig.4　Calibration curve establishment of c-PSA quantitative detection reagent

表1　靈敏度分析Tab.1　Analytical sensitivity assay

圖5　抗體配對臨床樣品的檢測分析及與Siemens試劑的比較Fig.5　Quantification assay of clinical samples and comparability with Siemens′KitNote: A.Scatter plot of clinical samples detection(*.P<0.000 1);B.The correlation analysis of 1A10-7D6-SAE detection and Siemens′ Kit.

2.4.3抗體配對臨床樣品檢測的分析本試劑對45份健康人血清樣本及45份前列腺病患組血清樣本的c-PSA進(jìn)行定量分析，與對照組相比病患組血清中的c-PSA顯著升高，組間比較差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1)。采用Siemens公司的c-PSA直接化學(xué)發(fā)光試劑盒對45份前列腺病患組血清樣本進(jìn)行定量檢測，同時(shí)使用本方法對該血清樣本進(jìn)行定量，兩種試劑檢測的c-PSA定量值取 Log10后進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如圖5所示，其相關(guān)系數(shù)達(dá)0.97，說明本方法與Siemens試劑檢測結(jié)果的相關(guān)性良好。

3　討論

血清總前列腺特異性抗原(t-prostate specific antigen，t-PSA)是目前發(fā)現(xiàn)最有用的前列腺腫瘤標(biāo)志物[16]。t-PSA具有極高的器官特異性，但不具疾病特異性[17]。f-PSA在血清中含量低、不穩(wěn)定，檢測結(jié)果波動大[18]。因此，依靠檢測t-PSA及f-PSA/t-PSA的比值作為輔助診斷具有局限性，難以對重疊部分做出確切鑒別診斷，尤其是4～10 ng/ml這個灰色區(qū)域[19]。更多的研究表明，c-PSA可提高PCa診斷的準(zhǔn)確度[20,21]，因此，c-PSA檢測指標(biāo)輔助診斷PCa已成為研究熱點(diǎn)。研發(fā)c-PSA高靈敏度的定量診斷試劑盒具有重要的意義，但目前國內(nèi)尚無特異性的針對c-PSA反應(yīng)性好的診斷試劑作為前列腺癌早期檢測，只有外購的Siemens公司的直接化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒[22,23]，因其價(jià)格昂貴，不利于大范圍的推廣。

本研究采用市購高純度的c-PSA抗原免疫小鼠，監(jiān)測血清滴度，待血清滴度達(dá)到平臺期后脾臟免疫，進(jìn)行脾細(xì)胞與雜交瘤細(xì)胞融合，間接法ELISA差異篩選抗c-PSA、f-PSA、t-PSA的抗體并獲得多株單克隆抗體。成功得到一對特異性配對抗體1A10-7D6，并建立c-PSA化學(xué)發(fā)光免疫定量試劑進(jìn)一步在臨床標(biāo)本上的評估結(jié)果顯示，使用該c-PSA化學(xué)發(fā)光免疫定量試劑對病患組及健康人尿液樣本的檢測結(jié)果具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1)；其靈敏度為0.005 ng/ml；線性范圍為0.1～100 ng/ml。其與國際主流檢測試劑Siemens直接化學(xué)發(fā)光法檢測試劑盒具有很好的相關(guān)性(R2)且檢測能力相當(dāng)。

總之，我們獲得檢測血清中天然c-PSA得特異性單克隆抗體配對，建立化學(xué)發(fā)光法的檢測試劑，臨床血清標(biāo)本初步評估結(jié)果顯示該試劑具有很好的檢測能力，相對于外購，大大降低c-PSA檢測成本，有助于國內(nèi)c-PSA化學(xué)發(fā)光免疫定量試劑的推廣，提高前列腺癌病人輔助診斷效率。

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[收稿2015-12-31修回2016-03-09]

(編輯張曉舟)

Generation of monoclonal antibodies against complexed prostate specific antigen and development of an antibody-based chemiluminescence immune quantifica-tion assay

ZHAN Lu-Ting,WEN Gui-Ping,ZHAO Min,YI Han,LIU Jiang-Wu,GUO Xiao-Yi,LIN Hai-Jun,HUANG Liu-Nü,XIA Ning-Shao,ZHENG Zi-Zheng.State Key Laboratory of Molecular Vaccinology and Molecular Diagnostics,School of Public Health,National Institute of Diagnostics and Vaccine Development of Infectious Diseases,Xiamen University,Xiamen 361102,China

Objective:To construct a chemiluminescense immune quantification assay based one paired mAbs against complexed prostate specific antigen(c-PSA).Methods: Six week-old female BALB/c mice were immunized with the commercial c-PSA antigen.After serum titer reaching a platform stage,the spleen was immunized and fused with mouse myeloma cell lines(Sp2/0).The hybridoma were screened by indirect ELISA,and eight generated antibodies were paired to obtain a quantitative analysis of the chemical luminescence.Results: 7D6 specifically recognized c-PSA,while 1A10 recognized total PSA(t-PSA).And the paired antibody 1A10/7D6 were determined to successfully construct a chemiluminescense immune response quantitative detection method through the detection of c-PSA standard and clinical serum samples.had,positive samples have statistically significant difference(P<0.000 1)with negative samples.And the correlation coefficient R2was 0.97 between our c-PSA quantitative results and that of the Siemens c-PSA chemiluminescense immunoassay kit.The detection linear range was 0.1-100 ng/ml,and the sensitivity was 0.005 ng/ml.Conclusion: The paired monoclonal antibodies specifically detecting c-PSA were generated and a c-PSA chemiluminescense immunoassay were developed in this study.The detection capability of our method was comparable with that of the international commercial kit.

Complexed prostate specific antigen(c-PSA);Monoclonal antibody;Chemiluminescense;Quantification reagent

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.019

R392.33文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

1000-484X(2016)08-1171-05

詹爐停(1990年-)，女，在讀碩士，主要從事腫瘤標(biāo)志物篩查診斷，呼吸道合胞病毒動物模型等方面的研究，E-mail:734873058@qq.com。

及指導(dǎo)教師：鄭子崢(1982年-)，男，博士，助理教授，主要從事戊型肝炎病毒及呼吸道合胞病毒感染機(jī)制研究，E-mail：zhengzizheng@xmu.edu.cn。