李　旺　陳艷媛　魏志璋　王宇環(huán)　羅曉玲　高　東

(深圳市合一康生物科技股份有限公司，深圳518045)

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·生物治療·

TLR7激動(dòng)劑替代IFN-γ誘導(dǎo)CIK細(xì)胞殺傷腫瘤的研究①

李旺陳艷媛魏志璋王宇環(huán)羅曉玲高東

(深圳市合一康生物科技股份有限公司，深圳518045)

①本文為深圳市基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(JCYJ20130326110139687, CXZZ20140509144527788)。

目的：探討TLR7激動(dòng)劑(Toll like receptor 7 agonist,Tlr7a)替代IFN-γ體外培養(yǎng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷性細(xì)胞(Cytokine-induced killer cell,CIK)抗腫瘤的免疫效應(yīng)。方法：分離健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞，在體外誘導(dǎo) CIK。分兩組:CIK組和Tlr7a-CIK組。對(duì)各組分別進(jìn)行免疫殺傷性研究，檢測(cè)細(xì)胞免疫表型并分析對(duì)K562腫瘤細(xì)胞的殺傷活性。結(jié)果：CD56+細(xì)胞在Tlr7a-CIK組顯著增加(P<0.05)，Tlr7a-CIK組殺傷活性較CIK組顯著增強(qiáng)(P<0.05)。結(jié)論：Tlr7a可以替代IFN-γ促進(jìn)CIK細(xì)胞殺傷腫瘤。

免疫細(xì)胞；Toll樣受體7 激動(dòng)劑；抗腫瘤；白血病

細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(Cytokine-induced killer cells,CIK)是在體外用人外周血單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)過CD3單克隆抗體與多種細(xì)胞因子共孵育后培養(yǎng)獲得的一群異質(zhì)性細(xì)胞[1]，主要表達(dá)CD3+CD56+T細(xì)胞抗原[2]，具有非主要組織相容性復(fù)合體(MHC)限制性的特點(diǎn)，且增殖力強(qiáng)、殺瘤活性高[3]。從CIK細(xì)胞的基礎(chǔ)研究到臨床試驗(yàn)都已經(jīng)驗(yàn)證了其安全性和可行性，有良好的應(yīng)用前景[4]。Toll樣受體(Toll like receptor,Tlr)作為固有免疫和獲得性免疫的橋梁，被相應(yīng)配體激活后，可誘導(dǎo)多種免疫細(xì)胞因子及趨化因子的分泌，激活固有免疫，擴(kuò)大T細(xì)胞和B細(xì)胞的效應(yīng)[5]。研究證明，一種咪唑喹啉類的Tlr7a能刺激T細(xì)胞的增殖分化，刺激免疫細(xì)胞產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫效應(yīng)，聯(lián)合化療、放療或免疫療法來治療腫瘤[6]。本研究將自主研發(fā)的一種具有強(qiáng)免疫活性的嘌呤類Tlr7a作為刺激劑[7]，替代IFN-γ誘導(dǎo)更具殺傷效應(yīng)的CIK細(xì)胞，進(jìn)行惡性腫瘤殺傷的研究,為臨床應(yīng)用免疫效應(yīng)細(xì)胞抗腫瘤治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1主要儀器和試劑IMDM 培養(yǎng)基(Iscove′s Modified Dulbecco′s medium,IMDM)和胎牛血清均為美國Gibco公司產(chǎn)品；人淋巴細(xì)胞分離液、CD3單抗、細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ、IL-1為美國Sigma公司產(chǎn)品；CD3、CD4、CD8、CD56等單克隆抗體和流式細(xì)胞儀(Flow C6)均為美國 Becton Dickinson 公司產(chǎn)品；CCK8試劑盒為日本同仁化學(xué)研究所產(chǎn)品；人紅白血病細(xì)胞(K562)為中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫產(chǎn)品。

1.1.2實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)分為兩組，實(shí)驗(yàn)組是添加Tlr7a但不加IFN-γ的Tlr7a-CIK組，對(duì)照組為添加了IFN-γ的普通CIK組。

1.2方法

1.2.1CIK的體外誘導(dǎo)與擴(kuò)增取健康志愿者外周血，將全血細(xì)胞經(jīng)密度梯度離心獲得單個(gè)核細(xì)胞，用含有各種細(xì)胞因子的IMDM 培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，接種到培養(yǎng)瓶中，放置于37℃、5%CO2孵育箱。體外誘導(dǎo)CIK細(xì)胞：調(diào)整細(xì)胞密度為(1～2)×106ml-1，加入各種細(xì)胞因子達(dá)到相應(yīng)終濃度：CD3單克隆抗體(50 ng/ml)、IL-1(100 U/ml)、IL-2(1 000 U/ml)，Tlr7a-CIK組補(bǔ)加Tlr7a(10 μmol/L)，CIK組補(bǔ)加IFN-γ(1 000 U/ml)，每隔2～3 d補(bǔ)液1次，調(diào)整密度至(1～2)×106ml-1。培養(yǎng)15 d后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。

1.2.2細(xì)胞表面抗原檢測(cè)對(duì)培養(yǎng)15 d的四組細(xì)胞表面抗原進(jìn)行檢測(cè)，即CD3、CD4、CD8、CD56 的表達(dá)情況。

1.2.3細(xì)胞毒活性檢測(cè)(CCK8法)CIK 細(xì)胞培養(yǎng)15 d后，收集細(xì)胞懸液，按不同濃度等級(jí)(3復(fù)孔)加到 96 孔板中(按效應(yīng)細(xì)胞∶靶細(xì)胞為5∶1、10∶1、20∶1)，靶細(xì)胞為白血病細(xì)胞株(K562細(xì)胞)。在37℃、5%CO2箱中共孵育18 h后，每孔200 μl體系中加入CCK8 試劑20 μl，繼續(xù)孵育4 h。用酶標(biāo)檢測(cè)儀測(cè)定波長為450 nm 處吸光度(A值)，并計(jì)算殺傷率，計(jì)算公式為：殺傷率=[1-(實(shí)驗(yàn)組A 值-效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照A 值) /靶細(xì)胞對(duì)照組A值]×100%。

2　結(jié)果

2.1細(xì)胞表面抗原檢測(cè)通過檢測(cè)兩組細(xì)胞表面的免疫表型(見表1和圖1)發(fā)現(xiàn)，兩組細(xì)胞均表達(dá)CD3，與對(duì)照組相比，Tlr7a-CIK組的CD3+CD4+細(xì)胞基本一致、CD3+CD8+細(xì)胞略有下降，而有強(qiáng)細(xì)胞毒作用的CD3+CD56+、CD3-CD56+細(xì)胞明顯增加，即表達(dá)CD56+的細(xì)胞顯著增加(P<0.05)。

2.2細(xì)胞毒活性檢測(cè)將兩組細(xì)胞分別作為效應(yīng)細(xì)胞，對(duì)白血病細(xì)胞株(K562細(xì)胞)進(jìn)行殺傷實(shí)驗(yàn)，并做CCK8檢測(cè)。結(jié)果(圖2)表明兩種CIK細(xì)胞均具有殺傷活性，在5∶1和10∶1效靶比下，殺傷能力無顯著性差異，但Tlr7a-CIK組有增強(qiáng)趨勢(shì)；在20∶1效靶比下，Tlr7a-CIK組細(xì)胞的殺傷活性顯著增強(qiáng)(P<0.05)。

表1　細(xì)胞免疫表型分析Tab.1　Immunophenotyping ±s)

圖1　細(xì)胞免疫表型分析(n=3)Fig.1　Immunophenotype analysis(n=3)Note: *.P<0.05,Compared with CIK group respectively.

圖2　細(xì)胞毒性分析(E∶T =效應(yīng)細(xì)胞∶K562細(xì)胞)Fig.2　Cytotoxicity analysis(E：T =Effectors：K562 cells)Note: *.P<0.05,Compared with CIK group respectively.

3　討論

近年來隨著生活方式的改變以及自然環(huán)境的惡化，加上醫(yī)療技術(shù)的提高，腫瘤檢出人數(shù)呈上升趨勢(shì)，腫瘤已成為嚴(yán)重威脅人類健康的重要疾病之一。由于腫瘤具有較高的損害性和較高的病死率，抗腫瘤藥物以及治療手段不斷被開發(fā)和應(yīng)用，研究證明Tlr7a在體內(nèi)可以殺傷腫瘤，提高機(jī)體免疫能力[8]，但是化療容易產(chǎn)生不良反應(yīng)，細(xì)胞治療就成為輔助腫瘤治療的一種重要手段，CIK細(xì)胞回輸治療成為一種有效的細(xì)胞免疫治療方法[9]。研究證明通過雞尾酒式的聯(lián)合療法可以治療腫瘤，如化療聯(lián)合細(xì)胞療法治療乳腺癌、肺癌和非小細(xì)胞肺癌等[10-12]。魏緒倉等[13]在研究中發(fā)現(xiàn)，體外CIK可以很好地殺傷血液病等腫瘤細(xì)胞，殺傷作用強(qiáng)，可以作為臨床有效治療白血病的一種治療手段。劉清池等[14]在臨床研究中發(fā)現(xiàn)，DC和CIK細(xì)胞聯(lián)合化療能夠抑制白血病相關(guān)基因，促進(jìn)四色流式細(xì)胞微小殘留白血病免疫表型組合(Four-color combination flow cytom-etric immunophenotype of minimal residual leukemia,CFIM)轉(zhuǎn)陰、提高微小殘留白血病(Minimal residual leukemia,MRL)清除率、改善患者免疫功能、延長緩解期，DC-CIK回輸無嚴(yán)重不良反應(yīng)。

腫瘤免疫治療中，CIK細(xì)胞作為重要的免疫效應(yīng)細(xì)胞，其能夠分泌較多的Th1類細(xì)胞因子，如IL-12、IFN-γ等，以調(diào)節(jié)體內(nèi)其他細(xì)胞因子的分泌以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對(duì)CIK殺傷作用的敏感性，起到抑制腫瘤和殺傷腫瘤的作用[15]。研究證明Tlr7a刺激DC-CIK產(chǎn)生高效的殺傷腫瘤效果[16]?？赡苁荰lr7a通過NF-κB通路刺激免疫細(xì)胞分泌多種免疫細(xì)胞因子及趨化因子，如IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、IL-18、TNF-α/β和TNF-γ等，引發(fā)抗原呈遞細(xì)胞上的MHC分子和共刺激信號(hào)上調(diào)以及激活CIK和自然殺傷細(xì)胞(NK)，擴(kuò)大免疫效應(yīng)[17]，但是Tlr7a促進(jìn)CIK 細(xì)胞毒性、增強(qiáng)殺傷腫瘤活性的具體免疫效應(yīng)機(jī)制尚未完全明了，有待進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果顯示，Tlr7a誘導(dǎo)的CIK細(xì)胞可表達(dá)更多的CD3+CD56+、CD3-CD56+細(xì)胞，即產(chǎn)生了大量的NK細(xì)胞樣淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞，使抗白血病細(xì)胞的免疫效應(yīng)進(jìn)一步增強(qiáng)，且在殺傷腫瘤效果上比普通培養(yǎng)的CIK更好。本研究結(jié)果表明，在免疫細(xì)胞培養(yǎng)中，TLR7激動(dòng)劑可以替代IFN-γ的作用，可以誘導(dǎo)刺激非MHC限制性的更強(qiáng)細(xì)胞毒作用的CIK/NK細(xì)胞，增加了對(duì)白血病細(xì)胞的殺傷作用，為臨床治療腫瘤的應(yīng)用打下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，提供更有效的治療手段。

[1]Schmidt-Wolf IG,Negrin RS,Kiem HP,etal.Use of a SCID mouse/human lymphoma model to evaluate cytokine-induced killer cells with potent antitumor cell activity[J].J Exp Med,1991,174(1):139-149.

[2]Hongeng S,Petvises S,Worapongpaiboon S,etal.Generation of CD3+CD56+cytokine-induced killer cells andtheircytotoxicity in vitro against pediatric cancer cells[J].Int J Hematol,2003,77(2):175-179.

[3]Kim HM,Lim J,Yoon YD,etal.Anti-tumor activity of ex vivo expanded cytokine-induced killer cells against human hepatocellular carcinoma[J].Int Immunopharmacol,2007,7(13):1793-1801.

[4]Niam M,Linn YC,Fook CS,etal.Clinical scale expansion of cytokine-induced killer cells is feasible from healthy donors and patients with acute and chronic myeloid leukemia at various stages of therapy[J].Exp Hematol,2011,39(9):897-903.

[5]AkiraS,Takeda K,KaishoT.Toll-like receptors:critical proteins linking innate and acquired immunity[J].Nat Immunol,2001,2(8):675-680.

[6]Zhou Z,Yu X,Zhang J,etal.TLR7/8 agonists promote NK-DC cross-talk to enhance NK cell anti-tumor effects in hepatocellular carcinoma[J].Cancer Lett,2015,369(2):298-306.

[7]Dong G,Diao YW,Li W,etal.Toll-like receptor 7 inactive ligands enhanced cytokine induction by conjugation to weak antigens[J].Chem Med Chem,2015,10(6):977-980.

[8]Wolska A,Cebula-Obrzut B,Smolewski P,etal.Effects of Toll-like receptor 7 and Toll-like receptor 9 signaling stimulators and inhibitors on chronic lymphocytic leukemia cells ex vivo and their interactions with cladribine[J].Leuk Lymphoma,2013,54(6):1268-1278.

[9]Linn YC,Yong HX,Niam M,etal.A phase I/II clinical trial of autologous cytokine-induced killer cells as adjuvant immunotherapy for acute and chronic myeloid leukemia in clinical remission[J].Cytotherapy,2012,14(7):851-859.

[10]徐龍,謝曉冬,杜成,等.自體CIK細(xì)胞對(duì)化療后晚期乳腺癌患者影響的臨床對(duì)照研究[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2012,12(32):6316-6320.

[11]樊永麗,趙華,于津浦,等.胃癌患者術(shù)后化療聯(lián)合CIK免疫治療的臨床療效[J].中國腫瘤生物治療雜志,2012,19(2):168-174.

[12]羅虎,羅丹,宮亮,等.聯(lián)合CIK細(xì)胞與化療對(duì)比單純化療治療中晚期非小細(xì)胞肺癌的Meta分析[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2012,34(20):2119-2121.

[13]魏緒倉,翟欣輝，韓秀蕊，等.DC-CIK細(xì)胞的生物學(xué)活性及體外抗白血病作用的研究[J].免疫血液學(xué)，2008,16(5):1150-1153.

[14]劉清池，張慧敏，張玉娜，等.DC-CIK細(xì)胞清除微小殘留白血病的臨床研究[J].中國腫瘤生物治療雜志,2013,20(4):398-403.

[15]Marten A,Ziske C,Schottker B,etal.Interactions between dendritic cells and cytokine-induced killer cells lead to an activation of both populations[J].J Immunother,2001,24(6): 502-510.

[16]Zhou Z,Yu X,Zhang J,etal.TLR7/8 agonists promote NK-DC cross-talk to enhance NK cell anti-tumor effects in hepatocellular carcinoma[J].Cancer Lett,2015,369(2):298-306.

[17]Kawai T,Akira S.The role of pattern-recognition receptors in innate immunity:update on Toll-like receptors[J].Nat Immunol,2010,11(5):373-384.

[收稿2016-01-20修回2016-05-16]

(編輯倪鵬)

Investigation for anti-tumor effects of CIK cells induced by TLR7 agonist instead of IFN-γ

LI Wang,CHEN Yan-Yuan,WEI Zhi-Zhang,WANG Yu-Huan,LUO Xiao-Ling,GAO Dong.Shenzhen Hornetcorn Biotechnology Company,Ltd.,Shenzhen 518045,China

Objective:To investigate the immune effects of CIK cells induced by Toll like receptor 7 agonist (Tlr7a) instead of IFN-γ on killing lymphoma cells in vitro.Methods: Mononuclear cells were isolated from healthy human peripheral blood.CIK were induced by Tlr7a in vitro instead of IFN-γ.Two groups were divided as follows:CIK group,Tlr7a-CIK group.Then the main investigation on immune effects included immune phenotype was detected respectively,and cytotoxicity of the effectors was analyzed.Results: In Tlr7a-CIK group,the amount of CD56+cells was more than CIK group (P<0.05),and the cytotoxicity was also stronger (P<0.05).Conclusion: Tlr7a instead of IFN-γ could promote the immune effects of CIK cells on killing tumor cells in vitro.

Immune cells;Toll like receptor 7 agonist;Antitumor;Leukemia

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.016

R733.71文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

1000-484X(2016)08-1157-03

李旺(1988年-)，男，碩士，研發(fā)工程師，主要從事免疫藥理與免疫治療方面的研究，E-mail：Liwangwait@163.com。

及指導(dǎo)教師：高東(1978年-)，男，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事免疫藥理與免疫治療方面的研究，E-mail:gaodong5211@126.com。