余　潔　駱曉蓉

(重慶三峽中心醫(yī)院婦兒分院兒內(nèi)一科，萬州404000)

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木犀草素對肥大細胞脫顆粒影響及機制的研究

余潔駱曉蓉①

(重慶三峽中心醫(yī)院婦兒分院兒內(nèi)一科，萬州404000)

目的：探討木犀草素(Luteolin)的抗I型變態(tài)反應的作用機制。方法：通過建立DNP-BSA-IgE激發(fā)致敏的大鼠RBL-2H3細胞模型，分別采用MTT法檢測不同濃度(5、15、25 μmol/L)Luteolin對RBL-2H3肥大細胞活性的影響；ELISA法檢測不同濃度Luteolin對RBL-2H3細胞分泌β-hexosa minidase(β-HEX)及細胞因子TNF-α影響；Flou-4AM熒光探針檢測細胞內(nèi)Ca2+濃度變化；Western blot檢測AKT,P-AKT的表達。結果：成功建立致敏的細胞模型,低濃度的Luteolin對RBL-2H3細胞活性無明顯影響；不同濃度Luteolin刺激RBL-2H3細胞后，對β-HEX和TNF-α的釋放抑制作用呈線性相關，且細胞內(nèi)Ca2+明顯減少；Western blot結果顯示隨著Luteolin濃度的增加AKT磷酸化水平明顯下降。結論：Luteolin呈劑量依賴性抑制RBL-2H3肥大細胞脫顆粒，且通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)Ca2+濃度與AKT活性參與其中。

木犀草素;肥大細胞;脫顆粒;Ⅰ型變態(tài)反應;過敏性鼻炎與支氣管哮喘

過敏性鼻炎與支氣管哮喘是兒童常見的慢性炎癥性疾病，均屬于Ⅰ型超敏反應性疾病，兩者組成一個疾病的統(tǒng)一體，在流行病學、免疫病理生理等方面有密切聯(lián)系，常以相互影響的方式并存于同一患兒，嚴重影響患者及其家庭的生活質(zhì)量[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)過敏性鼻炎與支氣管哮喘患者都存在肥大細胞的活化以及嗜酸性粒細胞的浸潤[4,5]。

肥大細胞活化脫顆粒是Ⅰ型超敏反應過程中的關鍵步驟，抑制肥大細胞活化脫顆?？梢杂行У慕档脱装Y反應的強度，進而抑制過敏性哮喘反應[6]，因而近年來治療Ⅰ型超敏反應疾病的藥物主要圍繞抑制肥大細胞脫顆粒而產(chǎn)生。Luteolin是存在于多種植物中的天然黃酮類化合物，具有抗菌，抗病毒，抗腫瘤，抗過敏等多種藥理活性[7]，本研究通過在體外構建DNP-BSA-IgE激發(fā)致敏的大鼠RBL-2H3細胞模型，通過不同濃度的Luteolin作用于RBL-2H3細胞，觀察其對肥大細胞活化脫顆粒的影響并探討其可能機制，為治療兒童過敏性鼻炎及支氣管哮喘藥物的開發(fā)提供新的思路。

1　材料與方法

1.1主要材料DNP-BSA，MTT，anti-DNP IgE購自美國Sigma公司；Luteolin，P-AKT購自美國Santa Cruz公司；大鼠β-hexosa minidase和 TNFα ELISA檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；Flou-4AM Ca2+熒光探針購自美國Invitrogen公司；一抗AKT,一抗β-actin購自美國Bioworld公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)大鼠嗜堿性粒細胞性白血病細胞RBL-2H3細胞購自中國科學院上海細胞庫，采用由含15%胎牛血清，1%雙抗(100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素)的MEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d傳代一次，取對數(shù)生長期細胞用于后續(xù)實驗。實驗分組為:Blank組(正常細胞)，Control組(致敏模型細胞未加藥處理)，Luteolin(5、15、25 μmol/L)濃度處理組。

1.2.2MTT法取對數(shù)生長期RBL-2H3細胞，血球計數(shù)板計數(shù)，以每孔2×104/100 μl濃度接種于96孔板中，5% CO2,37℃ 培養(yǎng)過夜，吸去培養(yǎng)基后PBS清洗，分別加入無血清培養(yǎng)基稀釋的不同濃度(5、15、25 μmol/L)的Luteolin于孵箱中培養(yǎng)24 h后，吸去培養(yǎng)基，并每孔加入10 μl MTT和 90 μl無血清培養(yǎng)基，37℃孵育4 h后，加入100 μl DMSO于酶標儀上570 nm處檢測各組OD值。

1.2.3ELISA法檢測β-HEX和TNFα的釋放消化收集2×105個/ ml細胞量，接種于24孔細胞培養(yǎng)板過夜，加入anti-DNP IgE 0.3 μg/ml培養(yǎng)箱中孵育過夜使其致敏后,Tyrode′ s buffer 清洗2～3次，將Luteolin按5、15、25 μmol/L濃度溶于Tyrode′ s buffer，5%CO2,37℃孵育30 min后，加入DNP-BSA(30 μg/ml) 40 μl繼續(xù)孵育1.5 h活化肥大細胞，冰浴10 min終止反應。β-HEX及TNFα釋放率的檢測步驟按照ELISA試劑盒說明書操作。按以下公式計算樣品的β-HEX釋放率(%):β-HEX(%)=(上清樣品酶活性A 值-空白對照上清酶活性A 值)/(總酶活性A 值)×100%。

1.2.4Ca2+influx assay消化收集2×105個/ml細胞量，接種于24孔細胞培養(yǎng)板過夜，加入anti-DNP IgE 0.3 μg/ml培養(yǎng)箱中孵育過夜使其致敏后,Tyrode′s buffer 清洗2～3次，加入含有Fluo-4AM(5 μmol/L)孵育30 min后，清洗細胞并加入不同濃度(5、15、25 μmol/L)的Luteolin孵育5%CO2,37℃孵育30 min后，再次清洗后加入40 μl DNP-BSA(30 μg/ml)，孵育1.5 h后，使用熒光顯微鏡觀察并計算平均熒光強度。

1.2.5Western blot 將anti-DNP IgE致敏的RBL-2H3細胞，5%CO2，37℃孵育過夜后，加入不同濃度的Luteolin作用30 min，洗凈并加入DNP-BSA(30 μg/ml)40 μl孵育1.5 h后，收集細胞提取蛋白，采用BCA法測蛋白濃度，取50 μg/孔蛋白樣品上樣，經(jīng)SDS-PAGE電泳后，將目的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，在5%脫脂奶粉或BSA-TBST于室溫封閉2 h，分別加入一抗(AKT、P-AKT、β-actin)4℃過夜后，TBST清洗3次并分別與相應HRP標記的二抗雜交2 h，ECL化學發(fā)光并顯影。

2　結果

2.1對RBL-2H3細胞活性的影響MTT結果顯示，Luteolin在5、15、25 μmol/L 濃度作用于RBL-2H3細胞24 h后，對細胞的活性無明顯影響，(P>0.05，表1)差異無統(tǒng)計學意義。

2.2對RBL-2H3細胞活化脫顆粒釋放β-HEX及TNF-α影響

2.2.1Luteolin抑制RBL-2H3細胞活化脫顆粒釋放β-HEX實驗結果顯示Luteolin在5、15、25 μmol/L濃度作用RBL-2H3細胞時，β-HEX的釋放率明顯減少，分別為[(54.75 ± 2.04)%，(34.59 ± 3.24)%,(23.19 ± 3.03)%],且隨著濃度的增加,β-HEX的釋放率呈劑量依賴性明顯減少，如圖1所示，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05,P<0.01)。

2.2.2Luteolin抑制RBL-2H3細胞活化脫顆粒釋放TNF-α如圖2所示，隨著Luteolin濃度的增加，TNF-α的釋放濃度與模型Control組相比顯著減少，且呈劑量依賴性，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.3對RBL-2H3細胞內(nèi)Ca2+影響如圖3所示，與模型Control組相比，Luteolin濃度梯度組中Ca2+熒光強度明顯減弱，提示Luteolin可有效抑制細胞外Ca2+的攝入。

2.4對RBL-2H3細胞內(nèi)AKT、P-AKT表達的影響Western blot結果條帶光密度分析顯示，Luteolin濃度梯度組與Control組相比，P-AKT蛋白的表達量隨著濃度的增加逐漸減少(圖4)，提示Luteolin可能通過降低AKT活性，進而抑制肥大細胞RBL-2H3脫顆粒的發(fā)生。

表1　不同濃度Luteolin對肥大細胞RBL-2H3細胞活力的影響Tab.1　Effect of cell viability at different concentrations of Luteolin pretreated RBL-2H3 ±s,n=3)

圖1　ELISA檢測不同濃度Luteolin對RBL-2H3細胞釋放β-HEX的影響Fig.1　Effect of different concentration on β-HEX release was detected by ELISA assayNote: *.P<0.05,**.P<0.01,compare with control group.

圖2　ELISA檢測不同濃度Luteolin對RBL-2H3細胞釋放TNF-α的影響Fig.2　Effect of different concentration on TNF-α release was detected by ELISA assayNote: *.P<0.05,compare with control group.

3　討論

肥大細胞是Ⅰ型超敏反應性炎癥的主要啟動細胞，特異性抗原通過與肥大細胞膜表面高特異性受體(FcεRI)結合，使之發(fā)生交聯(lián)，進而啟動活化信號，誘導肥大細胞脫顆粒并釋放組胺、β-HEX、白三烯，TNF-α等多種生物活性介質(zhì)，這些介質(zhì)通過作用上皮、內(nèi)皮、神經(jīng)、平滑肌細胞等進而引起多種癥狀和綜合征的發(fā)生[8,9]。大鼠RBL-2H3細胞是常用的研究Ⅰ型超敏反應機制的重要細胞模型，本研究通過在體外構建DNP-BSA-IgE激發(fā)致敏的大鼠RBL-2H3細胞模型，進而探討Luteolin對肥大細胞活化脫顆粒的影響，研究發(fā)現(xiàn)通過不同濃度的Luteolin作用致敏的肥大細胞后，隨著Luteolin濃度的增高，β-HEX的釋放率明顯減少，且呈劑量依賴性。β-HEX是肥大細胞脫顆粒的重要指標，參與糖蛋白、糖脂、氨基多糖的降解[10]。提示Luteolin可有效抑制肥大細胞的活化脫顆粒，在對細胞因子TNF-α的檢測結果進一步驗證了這一現(xiàn)象。

圖3　Fluo-4AM檢測不同濃度Luteolin對RBL-2H3細胞內(nèi)Ca2+的影響Fig.3　Effect of intracellular Ca2+ was detected by fluo-4AM when pretreated with different concentration of Luteolin in RBL-2H3 cells

圖4　Western blot檢測不同濃度Luteolin對RBL-2H3細胞P-AKT和AKT蛋白表達的影響Fig.4　Expression of P-AKT and AKT levels were detected by Western blot when pretreated with different concentration of Luteolin in RBL-2H3 cells

近幾年通過對肥大細胞活化脫顆?，F(xiàn)象機制的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)cεRI交聯(lián)導致細胞內(nèi)Lyn、Fyn 和Syk蛋白酪氨酸激酶活化，形成肥大細胞脫顆粒的啟始信號，進而引起Ca2+/CaM、DAG/PKC,Rho GTPase三條主要信號轉(zhuǎn)導途徑的級聯(lián)反應，促進肥大細胞脫顆粒的發(fā)生[11]。Ca2+參與了細胞內(nèi)眾多的生理生化反應，肥大細胞脫顆?，F(xiàn)象的發(fā)生依賴于細胞內(nèi)Ca2+濃度的增加，研究發(fā)現(xiàn)當胞漿內(nèi)Ca2+濃度升高時,Ca2+與CaM結合引起CaM構型發(fā)生改變,繼而激活CaM蛋白激酶,CaM蛋白激酶可激活微管蛋白、肌球蛋白輕鏈參與囊泡的轉(zhuǎn)運及定向[12]，進而促進生物活性因子的釋放。在本研究中，通過Flou-4AM Ca2++熒光探針檢測Luteolin作用于肥大細胞后細胞內(nèi)的Ca2+濃度明顯減低，提示Luteolin可能通過影響細胞內(nèi)Ca2+濃度變化進而抑制肥大細胞活化脫顆粒的發(fā)生。PI3K是細胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導分子，其介導的AKT信號途徑的激活可引起肥大細胞脫顆粒釋放組胺、IL6等多種炎性細胞因子[13]。本研究通過Western blot檢測Luteolin刺激肥大細胞后，AKT及P-AKT蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)隨著Luteolin濃度的增加，P-AKT蛋白表達呈劑量依賴性減少，提示Luteolin可通過抑制AKT活性，進而阻斷細胞內(nèi)PI3K/AKT信號途徑，進一步說明Luteolin可能通過阻斷PI3K/AKT信號途徑抑制RBL-2H3肥大細胞活化脫顆粒。

綜上所述，Luteolin呈劑量依賴性抑制RBL-2H3肥大細胞脫顆粒，其可能通過影響細胞內(nèi)Ca2+濃度與AKT活性參與其中，而其具體的作用機制，有待于我們進一步的研究，本實驗為Luteolin可能作為一種治療藥物用于Ⅰ型超敏反應引起的過敏性鼻炎及支氣管哮喘提供一定的實驗依據(jù)。

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[收稿2015-11-02修回2015-11-17]

(編輯許四平)

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《中國免疫學雜志》被國際著名檢索機構收錄通知

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1)美國《化學文摘(網(wǎng)絡版)》(CA);

2)美國《劍橋科學文摘(自然科學)》(CSA(NS),Cambridge Scientific Abstracts(Natural Science));

3)波蘭《哥白尼索引》(IC, Index of Copurnicus);

4)《日本科學技術振興機構(中國文獻數(shù)據(jù)庫)》(JST, Japan Science & Technology Agency(Chinese Bibliographic Database))；

5)美國《烏利希期刊指南(網(wǎng)絡版)》(UPD，Ulrich's Periodicals Directory)；

6)英國《國際農(nóng)業(yè)與生物科學研究中心》(CABI，Centre for Agriculture and Bioscience International);

7)WHO西太平洋地區(qū)醫(yī)學索引(Western Pacific Region Index Medicus,WPRIM)；

8)英國《公共健康研究數(shù)據(jù)庫》(Global Health)。

《中國免疫學雜志》編輯部

Effect of Luteolin on mast cell degranulation and its mechanism of action

YU Jie,LUO Xiao-Rong.Department of Internal Medicine,Women and Children′s Hospital of Chongqing Three Gorges Central Hospital,Wanzhou 404000,China

Objective:To investigate the effect of Luteolin on the degranulation function of RBL-2H3 mast cells and its mechanism of action.Methods: DNP-BSA-IgE was used to establish the sensitized cell model in RBL-2H3 cells.Cell viability was exa mined by MTT assay at different concentrations(5，15，25 μmol/L)of Luteolin pretreated RBL-2H3 cells.The effect of Luteolin on β-hexosa minidase(β-hex)and TNF-α was evaluated by ELISA.The change of Ca2+influx was detected by Flou-4AM calcium ion fluorescent probe.The expression of AKT and P-AKT were detected by Western blot.Results: The sensitized cell model was established successfully.Cell viability had not significantly changes stimulated by different concentrations of Luteolin,and a significantly inhibition role showed the release of β-hex and TNF-α from RBL-2H3 cells.The concentration of intracellular Ca2+was significantly decreased.However,the Western blot results showed that the level of Phosphorylation AKT was decreased.Conclusion: Luteolin suppress RBL-2H3 cell degranulation in dose dependence,which may via impacting the Ca2+influx and the activity of AKT.

Luteolin;Mast cell;Degranulation;Ⅰ type allergic reaction;Allergic rhinitis and Bronchial asthma

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.015

R725.6R915文獻標志碼A

1000-484X(2016)08-1153-04

①,E-mail:xrl12@sina.com。

余潔(1980年-)，女,碩士，主治醫(yī)師, 主要從事兒童呼吸系統(tǒng)疾病臨床及研究，E-mail:yujiewfp@126.com。