余　潔　駱曉蓉

(重慶三峽中心醫(yī)院婦兒分院兒內(nèi)一科，萬州404000)

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木犀草素對肥大細(xì)胞脫顆粒影響及機制的研究

余潔駱曉蓉①

(重慶三峽中心醫(yī)院婦兒分院兒內(nèi)一科，萬州404000)

目的：探討木犀草素(Luteolin)的抗I型變態(tài)反應(yīng)的作用機制。方法：通過建立DNP-BSA-IgE激發(fā)致敏的大鼠RBL-2H3細(xì)胞模型，分別采用MTT法檢測不同濃度(5、15、25 μmol/L)Luteolin對RBL-2H3肥大細(xì)胞活性的影響；ELISA法檢測不同濃度Luteolin對RBL-2H3細(xì)胞分泌β-hexosa minidase(β-HEX)及細(xì)胞因子TNF-α影響；Flou-4AM熒光探針檢測細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化；Western blot檢測AKT,P-AKT的表達(dá)。結(jié)果：成功建立致敏的細(xì)胞模型,低濃度的Luteolin對RBL-2H3細(xì)胞活性無明顯影響；不同濃度Luteolin刺激RBL-2H3細(xì)胞后，對β-HEX和TNF-α的釋放抑制作用呈線性相關(guān)，且細(xì)胞內(nèi)Ca2+明顯減少；Western blot結(jié)果顯示隨著Luteolin濃度的增加AKT磷酸化水平明顯下降。結(jié)論：Luteolin呈劑量依賴性抑制RBL-2H3肥大細(xì)胞脫顆粒，且通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度與AKT活性參與其中。

木犀草素;肥大細(xì)胞;脫顆粒;Ⅰ型變態(tài)反應(yīng);過敏性鼻炎與支氣管哮喘

過敏性鼻炎與支氣管哮喘是兒童常見的慢性炎癥性疾病，均屬于Ⅰ型超敏反應(yīng)性疾病，兩者組成一個疾病的統(tǒng)一體，在流行病學(xué)、免疫病理生理等方面有密切聯(lián)系，常以相互影響的方式并存于同一患兒，嚴(yán)重影響患者及其家庭的生活質(zhì)量[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)過敏性鼻炎與支氣管哮喘患者都存在肥大細(xì)胞的活化以及嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤[4,5]。

肥大細(xì)胞活化脫顆粒是Ⅰ型超敏反應(yīng)過程中的關(guān)鍵步驟，抑制肥大細(xì)胞活化脫顆粒可以有效的降低炎癥反應(yīng)的強度，進(jìn)而抑制過敏性哮喘反應(yīng)[6]，因而近年來治療Ⅰ型超敏反應(yīng)疾病的藥物主要圍繞抑制肥大細(xì)胞脫顆粒而產(chǎn)生。Luteolin是存在于多種植物中的天然黃酮類化合物，具有抗菌，抗病毒，抗腫瘤，抗過敏等多種藥理活性[7]，本研究通過在體外構(gòu)建DNP-BSA-IgE激發(fā)致敏的大鼠RBL-2H3細(xì)胞模型，通過不同濃度的Luteolin作用于RBL-2H3細(xì)胞，觀察其對肥大細(xì)胞活化脫顆粒的影響并探討其可能機制，為治療兒童過敏性鼻炎及支氣管哮喘藥物的開發(fā)提供新的思路。

1　材料與方法

1.1主要材料DNP-BSA，MTT，anti-DNP IgE購自美國Sigma公司；Luteolin，P-AKT購自美國Santa Cruz公司；大鼠β-hexosa minidase和 TNFα ELISA檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Flou-4AM Ca2+熒光探針購自美國Invitrogen公司；一抗AKT,一抗β-actin購自美國Bioworld公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)大鼠嗜堿性粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞RBL-2H3細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，采用由含15%胎牛血清，1%雙抗(100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素)的MEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d傳代一次，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于后續(xù)實驗。實驗分組為:Blank組(正常細(xì)胞)，Control組(致敏模型細(xì)胞未加藥處理)，Luteolin(5、15、25 μmol/L)濃度處理組。

1.2.2MTT法取對數(shù)生長期RBL-2H3細(xì)胞，血球計數(shù)板計數(shù)，以每孔2×104/100 μl濃度接種于96孔板中，5% CO2,37℃ 培養(yǎng)過夜，吸去培養(yǎng)基后PBS清洗，分別加入無血清培養(yǎng)基稀釋的不同濃度(5、15、25 μmol/L)的Luteolin于孵箱中培養(yǎng)24 h后，吸去培養(yǎng)基，并每孔加入10 μl MTT和 90 μl無血清培養(yǎng)基，37℃孵育4 h后，加入100 μl DMSO于酶標(biāo)儀上570 nm處檢測各組OD值。

1.2.3ELISA法檢測β-HEX和TNFα的釋放消化收集2×105個/ ml細(xì)胞量，接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板過夜，加入anti-DNP IgE 0.3 μg/ml培養(yǎng)箱中孵育過夜使其致敏后,Tyrode′ s buffer 清洗2～3次，將Luteolin按5、15、25 μmol/L濃度溶于Tyrode′ s buffer，5%CO2,37℃孵育30 min后，加入DNP-BSA(30 μg/ml) 40 μl繼續(xù)孵育1.5 h活化肥大細(xì)胞，冰浴10 min終止反應(yīng)。β-HEX及TNFα釋放率的檢測步驟按照ELISA試劑盒說明書操作。按以下公式計算樣品的β-HEX釋放率(%):β-HEX(%)=(上清樣品酶活性A 值-空白對照上清酶活性A 值)/(總酶活性A 值)×100%。

1.2.4Ca2+influx assay消化收集2×105個/ml細(xì)胞量，接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板過夜，加入anti-DNP IgE 0.3 μg/ml培養(yǎng)箱中孵育過夜使其致敏后,Tyrode′s buffer 清洗2～3次，加入含有Fluo-4AM(5 μmol/L)孵育30 min后，清洗細(xì)胞并加入不同濃度(5、15、25 μmol/L)的Luteolin孵育5%CO2,37℃孵育30 min后，再次清洗后加入40 μl DNP-BSA(30 μg/ml)，孵育1.5 h后，使用熒光顯微鏡觀察并計算平均熒光強度。

1.2.5Western blot 將anti-DNP IgE致敏的RBL-2H3細(xì)胞，5%CO2，37℃孵育過夜后，加入不同濃度的Luteolin作用30 min，洗凈并加入DNP-BSA(30 μg/ml)40 μl孵育1.5 h后，收集細(xì)胞提取蛋白，采用BCA法測蛋白濃度，取50 μg/孔蛋白樣品上樣，經(jīng)SDS-PAGE電泳后，將目的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，在5%脫脂奶粉或BSA-TBST于室溫封閉2 h，分別加入一抗(AKT、P-AKT、β-actin)4℃過夜后，TBST清洗3次并分別與相應(yīng)HRP標(biāo)記的二抗雜交2 h，ECL化學(xué)發(fā)光并顯影。

2　結(jié)果

2.1對RBL-2H3細(xì)胞活性的影響MTT結(jié)果顯示，Luteolin在5、15、25 μmol/L 濃度作用于RBL-2H3細(xì)胞24 h后，對細(xì)胞的活性無明顯影響，(P>0.05，表1)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2對RBL-2H3細(xì)胞活化脫顆粒釋放β-HEX及TNF-α影響

2.2.1Luteolin抑制RBL-2H3細(xì)胞活化脫顆粒釋放β-HEX實驗結(jié)果顯示Luteolin在5、15、25 μmol/L濃度作用RBL-2H3細(xì)胞時，β-HEX的釋放率明顯減少，分別為[(54.75 ± 2.04)%，(34.59 ± 3.24)%,(23.19 ± 3.03)%],且隨著濃度的增加,β-HEX的釋放率呈劑量依賴性明顯減少，如圖1所示，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。

2.2.2Luteolin抑制RBL-2H3細(xì)胞活化脫顆粒釋放TNF-α如圖2所示，隨著Luteolin濃度的增加，TNF-α的釋放濃度與模型Control組相比顯著減少，且呈劑量依賴性，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3對RBL-2H3細(xì)胞內(nèi)Ca2+影響如圖3所示，與模型Control組相比，Luteolin濃度梯度組中Ca2+熒光強度明顯減弱，提示Luteolin可有效抑制細(xì)胞外Ca2+的攝入。

2.4對RBL-2H3細(xì)胞內(nèi)AKT、P-AKT表達(dá)的影響Western blot結(jié)果條帶光密度分析顯示，Luteolin濃度梯度組與Control組相比，P-AKT蛋白的表達(dá)量隨著濃度的增加逐漸減少(圖4)，提示Luteolin可能通過降低AKT活性，進(jìn)而抑制肥大細(xì)胞RBL-2H3脫顆粒的發(fā)生。

表1　不同濃度Luteolin對肥大細(xì)胞RBL-2H3細(xì)胞活力的影響Tab.1　Effect of cell viability at different concentrations of Luteolin pretreated RBL-2H3 ±s,n=3)

圖1　ELISA檢測不同濃度Luteolin對RBL-2H3細(xì)胞釋放β-HEX的影響Fig.1　Effect of different concentration on β-HEX release was detected by ELISA assayNote: *.P<0.05,**.P<0.01,compare with control group.

圖2　ELISA檢測不同濃度Luteolin對RBL-2H3細(xì)胞釋放TNF-α的影響Fig.2　Effect of different concentration on TNF-α release was detected by ELISA assayNote: *.P<0.05,compare with control group.

3　討論

肥大細(xì)胞是Ⅰ型超敏反應(yīng)性炎癥的主要啟動細(xì)胞，特異性抗原通過與肥大細(xì)胞膜表面高特異性受體(FcεRI)結(jié)合，使之發(fā)生交聯(lián)，進(jìn)而啟動活化信號，誘導(dǎo)肥大細(xì)胞脫顆粒并釋放組胺、β-HEX、白三烯，TNF-α等多種生物活性介質(zhì)，這些介質(zhì)通過作用上皮、內(nèi)皮、神經(jīng)、平滑肌細(xì)胞等進(jìn)而引起多種癥狀和綜合征的發(fā)生[8,9]。大鼠RBL-2H3細(xì)胞是常用的研究Ⅰ型超敏反應(yīng)機制的重要細(xì)胞模型，本研究通過在體外構(gòu)建DNP-BSA-IgE激發(fā)致敏的大鼠RBL-2H3細(xì)胞模型，進(jìn)而探討Luteolin對肥大細(xì)胞活化脫顆粒的影響，研究發(fā)現(xiàn)通過不同濃度的Luteolin作用致敏的肥大細(xì)胞后，隨著Luteolin濃度的增高，β-HEX的釋放率明顯減少，且呈劑量依賴性。β-HEX是肥大細(xì)胞脫顆粒的重要指標(biāo)，參與糖蛋白、糖脂、氨基多糖的降解[10]。提示Luteolin可有效抑制肥大細(xì)胞的活化脫顆粒，在對細(xì)胞因子TNF-α的檢測結(jié)果進(jìn)一步驗證了這一現(xiàn)象。

圖3　Fluo-4AM檢測不同濃度Luteolin對RBL-2H3細(xì)胞內(nèi)Ca2+的影響Fig.3　Effect of intracellular Ca2+ was detected by fluo-4AM when pretreated with different concentration of Luteolin in RBL-2H3 cells

圖4　Western blot檢測不同濃度Luteolin對RBL-2H3細(xì)胞P-AKT和AKT蛋白表達(dá)的影響Fig.4　Expression of P-AKT and AKT levels were detected by Western blot when pretreated with different concentration of Luteolin in RBL-2H3 cells

近幾年通過對肥大細(xì)胞活化脫顆?，F(xiàn)象機制的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)cεRI交聯(lián)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Lyn、Fyn 和Syk蛋白酪氨酸激酶活化，形成肥大細(xì)胞脫顆粒的啟始信號，進(jìn)而引起Ca2+/CaM、DAG/PKC,Rho GTPase三條主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的級聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)肥大細(xì)胞脫顆粒的發(fā)生[11]。Ca2+參與了細(xì)胞內(nèi)眾多的生理生化反應(yīng)，肥大細(xì)胞脫顆?，F(xiàn)象的發(fā)生依賴于細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的增加，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)胞漿內(nèi)Ca2+濃度升高時,Ca2+與CaM結(jié)合引起CaM構(gòu)型發(fā)生改變,繼而激活CaM蛋白激酶,CaM蛋白激酶可激活微管蛋白、肌球蛋白輕鏈參與囊泡的轉(zhuǎn)運及定向[12]，進(jìn)而促進(jìn)生物活性因子的釋放。在本研究中，通過Flou-4AM Ca2++熒光探針檢測Luteolin作用于肥大細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度明顯減低，提示Luteolin可能通過影響細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化進(jìn)而抑制肥大細(xì)胞活化脫顆粒的發(fā)生。PI3K是細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，其介導(dǎo)的AKT信號途徑的激活可引起肥大細(xì)胞脫顆粒釋放組胺、IL6等多種炎性細(xì)胞因子[13]。本研究通過Western blot檢測Luteolin刺激肥大細(xì)胞后，AKT及P-AKT蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)隨著Luteolin濃度的增加，P-AKT蛋白表達(dá)呈劑量依賴性減少，提示Luteolin可通過抑制AKT活性，進(jìn)而阻斷細(xì)胞內(nèi)PI3K/AKT信號途徑，進(jìn)一步說明Luteolin可能通過阻斷PI3K/AKT信號途徑抑制RBL-2H3肥大細(xì)胞活化脫顆粒。

綜上所述，Luteolin呈劑量依賴性抑制RBL-2H3肥大細(xì)胞脫顆粒，其可能通過影響細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度與AKT活性參與其中，而其具體的作用機制，有待于我們進(jìn)一步的研究，本實驗為Luteolin可能作為一種治療藥物用于Ⅰ型超敏反應(yīng)引起的過敏性鼻炎及支氣管哮喘提供一定的實驗依據(jù)。

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[收稿2015-11-02修回2015-11-17]

(編輯許四平)

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《中國免疫學(xué)雜志》被國際著名檢索機構(gòu)收錄通知

根據(jù)國際檢索機構(gòu)給中國科學(xué)技術(shù)期刊編輯學(xué)會國際交流工作委員會、中國高?？萍计诳芯繒ν饴?lián)絡(luò)委員會發(fā)來的電子郵件及其附件統(tǒng)計整理,《中國免疫學(xué)雜志》被以下八種國際重要檢索系統(tǒng)列為來源期刊：

1)美國《化學(xué)文摘(網(wǎng)絡(luò)版)》(CA);

2)美國《劍橋科學(xué)文摘(自然科學(xué))》(CSA(NS),Cambridge Scientific Abstracts(Natural Science));

3)波蘭《哥白尼索引》(IC, Index of Copurnicus);

4)《日本科學(xué)技術(shù)振興機構(gòu)(中國文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫)》(JST, Japan Science & Technology Agency(Chinese Bibliographic Database))；

5)美國《烏利希期刊指南(網(wǎng)絡(luò)版)》(UPD，Ulrich's Periodicals Directory)；

6)英國《國際農(nóng)業(yè)與生物科學(xué)研究中心》(CABI，Centre for Agriculture and Bioscience International);

7)WHO西太平洋地區(qū)醫(yī)學(xué)索引(Western Pacific Region Index Medicus,WPRIM)；

8)英國《公共健康研究數(shù)據(jù)庫》(Global Health)。

《中國免疫學(xué)雜志》編輯部

Effect of Luteolin on mast cell degranulation and its mechanism of action

YU Jie,LUO Xiao-Rong.Department of Internal Medicine,Women and Children′s Hospital of Chongqing Three Gorges Central Hospital,Wanzhou 404000,China

Objective:To investigate the effect of Luteolin on the degranulation function of RBL-2H3 mast cells and its mechanism of action.Methods: DNP-BSA-IgE was used to establish the sensitized cell model in RBL-2H3 cells.Cell viability was exa mined by MTT assay at different concentrations(5，15，25 μmol/L)of Luteolin pretreated RBL-2H3 cells.The effect of Luteolin on β-hexosa minidase(β-hex)and TNF-α was evaluated by ELISA.The change of Ca2+influx was detected by Flou-4AM calcium ion fluorescent probe.The expression of AKT and P-AKT were detected by Western blot.Results: The sensitized cell model was established successfully.Cell viability had not significantly changes stimulated by different concentrations of Luteolin,and a significantly inhibition role showed the release of β-hex and TNF-α from RBL-2H3 cells.The concentration of intracellular Ca2+was significantly decreased.However,the Western blot results showed that the level of Phosphorylation AKT was decreased.Conclusion: Luteolin suppress RBL-2H3 cell degranulation in dose dependence,which may via impacting the Ca2+influx and the activity of AKT.

Luteolin;Mast cell;Degranulation;Ⅰ type allergic reaction;Allergic rhinitis and Bronchial asthma

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.015

R725.6R915文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

1000-484X(2016)08-1153-04

①,E-mail:xrl12@sina.com。

余潔(1980年-)，女,碩士，主治醫(yī)師, 主要從事兒童呼吸系統(tǒng)疾病臨床及研究，E-mail:yujiewfp@126.com。