李凝旭　涂　艷　沈　瑩　覃艷瓊　雷　超　柳湘潔

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院老年病科，武漢430070)

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·中醫(yī)中藥與免疫·

淫羊藿和女貞子提取物對(duì)骨質(zhì)疏松癥大鼠性激素功能水平的影響①

李凝旭涂艷沈瑩覃艷瓊雷超柳湘潔

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院老年病科，武漢430070)

①本文為華中科技大學(xué)自主創(chuàng)新基金(2013QN127)。

目的：探討淫羊藿和女貞子提取物對(duì)骨質(zhì)疏松癥(OP)大鼠性激素功能水平的影響。方法：50只3月齡雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、提取物低劑量組、提取物中劑量組、提取物高劑量組共5組，每組10只，除正常組外，其他4組以維甲酸灌喂15 d制作OP模型，造模成功后正常組和模型組灌服生理鹽水，提取物低劑量組、中劑量組和高劑量組分別按50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg灌服淫羊藿和女貞子提取物混合物，均持續(xù)3周。測(cè)量各組骨密度(BMD)，左側(cè)股骨切片采用蘇木精和伊紅(HE)染色觀察股骨病理學(xué)改變并測(cè)定骨小梁組織形態(tài)相關(guān)參數(shù)，免疫組織化學(xué)分析激素受體蛋白表達(dá)。結(jié)果：正常組股骨全部、股骨上端、股骨下端BMD顯著高于模型組，提取物中劑量組和高劑量組股骨全部、股骨上端、股骨下端BMD顯著高于模型組，提取物低劑量組股骨全部BMD顯著高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；與模型組比較，提取物各組骨小梁數(shù)量有了顯著增加，完整性、連續(xù)性明顯好轉(zhuǎn)，相關(guān)參數(shù)比較結(jié)果顯示，正常組Tb.N、Tb.Ar、Tb.Th顯著大于模型組，Tb.Sp顯著小于模型組，提取物中劑量組和高劑量組Tb.N、Tb.Ar、Tb.Th顯著大于模型組，Tb.Sp顯著小于模型組，提取物低劑量組，Tb、Ar、Tb、Th顯著大于模型組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；正常組AR、ER蛋白表達(dá)量明顯高于模型組，而提取物高劑量組AR、ER蛋白表達(dá)量較模型組顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論：淫羊藿和女貞子提取物能夠增加維甲酸誘導(dǎo)的OP大鼠BMD，逆轉(zhuǎn)骨組織病理結(jié)構(gòu)，上調(diào)性激素受體蛋白表達(dá)，對(duì)維甲酸誘導(dǎo)的OP大鼠具有潛在的保護(hù)作用。

淫羊藿-女貞子；維甲酸；骨質(zhì)疏松癥；骨密度；性激素受體

骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis，OP)是一種臨床常見的全身性、慢性骨骼疾病，以全身性骨量減少和骨組織顯微結(jié)構(gòu)破壞為特征，好發(fā)于絕經(jīng)后女性和老年人[1]。由于OP患者骨的脆性增加，骨折的風(fēng)險(xiǎn)大大增加，特別是腕關(guān)節(jié)、髖關(guān)節(jié)和脊柱[2]。而隨著人口老齡化的加劇，OP的發(fā)病率逐漸上升，其對(duì)老年人的健康和社會(huì)構(gòu)成的威脅也日益嚴(yán)重，對(duì)OP的預(yù)防和治療迫在眉睫。眾所周知，骨骼是一種對(duì)雄激素和雌激素非常敏感的內(nèi)分泌組織，而性激素在骨骼健康維護(hù)中扮演著重要的角色。雄激素和雌激素水平與骨代謝、骨密度(Bone mineral density，BMD)和骨質(zhì)疏松性骨折密切相關(guān)[3]。已有研究證實(shí)，激素替代療法(Hormone replacement therapy，HRT)可以有效預(yù)防絕經(jīng)后婦女和中老年人OP和骨折的發(fā)生[4]，但是長時(shí)間服用會(huì)增加乳腺癌、冠心病、血栓栓塞和陰道出血發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[5]。出于對(duì)HRT副作用的擔(dān)憂，人們開始將抗骨質(zhì)疏松藥的重心轉(zhuǎn)移到了天然產(chǎn)物上。

中醫(yī)認(rèn)為“腎主骨”，骨骼健康與腎臟功能密切相關(guān)，而腎虛被認(rèn)為是骨和關(guān)節(jié)疾病的根源[6]。淫羊藿和女貞子分別是中國古代醫(yī)學(xué)中補(bǔ)充腎陽和腎陰的藥物，長期用于增強(qiáng)骨骼功能和治療OP。由于OP是一種慢性病癥，需要長期服藥，中醫(yī)認(rèn)為，補(bǔ)陽藥性質(zhì)溫燥，不適合長期服用，如果能與補(bǔ)益腎精的藥物配伍，以陰中求陽，能達(dá)到“陰陽相濟(jì)之妙用”[7]。淫羊藿-女貞子是平補(bǔ)腎中陰陽之藥對(duì)，其復(fù)方在OP的治療中具有多年的歷史，能夠顯著調(diào)節(jié)Ⅰ型膠原代謝水平，改善骨代謝。已有研究證實(shí)，淫羊藿-女貞子藥對(duì)抗骨質(zhì)疏松的效果主要依賴于淫羊藿總黃酮，女貞子環(huán)烯醚萜總苷和總黃酮[8，9]，但其具體的作用機(jī)制還有待深入探討。

研究人員發(fā)現(xiàn)，維生素A過多癥會(huì)引起骨吸收加快，骨骼脆弱和自發(fā)性骨折[10]，此外，膳食維生素A高攝入與BMD下降和髖部骨折的風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)[11]，而維甲酸誘導(dǎo)的OP大鼠模型被認(rèn)為是用于藥物治療OP觀察藥理作用和變化的標(biāo)準(zhǔn)模型，因此本研究決定采用維甲酸誘導(dǎo)的OP大鼠模型。毫無疑問，激素水平在骨丟失的改善中扮演了重要的角色，考慮到雌鼠血清雌二醇水平周期性變化，為了避免激素水平變化對(duì)研究結(jié)果的影響，本研究均選擇雄性大鼠。

1　材料與方法

1.1淫羊藿、女貞子提取物的制備 分別取小檗科植物箭葉淫羊藿的干燥根莖和木犀科植物大葉女貞的成熟果實(shí)(均購自湖北省濟(jì)民醫(yī)藥公司)制備提取物，具體為：用1 000 ml 90%濃度的乙醇提取淫羊藿，分別提取3、2、2 h(70℃下回流裝置中)共3次，混合、過濾、濃縮至無酒精沉淀。石油醚萃取3次去除葉綠素，提取物用d-101大孔吸附樹脂洗至無色，90%乙醇洗脫，蒸干得深黃色粉末，即淫羊藿總黃酮(Total flavonoids of Herba Epimedii，TFE)，提取率為2.5%，提取物中淫羊藿苷含量為80%。用1 000 ml 75%濃度的乙醇提取女貞子，分別提取3、2、2 h(70℃下回流裝置中)共3次，混合、過濾、濃縮至無酒精沉淀。AB-8大孔樹脂洗至無色，提取物蒸餾水洗凈后75%乙醇洗脫，蒸干得女貞子環(huán)烯醚萜總苷和總黃酮(Total iridoid and flavonoids of fructus ligustri lucidi，TIFL)，提取率為5%，提取物中齊墩果酸和蘆丁含量超過80%。淫羊藿與女貞子提取物混合以TFE∶TIFL為 2∶3的比例，用去離子水溶解混合物，分別得到5 mg/ml、10 mg/ml和20 mg/ml三種不同濃度的混合液。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 50只健康雄性Wistar大鼠，3月齡，體重220～250 g，購自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(顎)20010-0009]，常規(guī)條件飼養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為正常組(Normal)、模型組(Model)提取物低劑量組(Extracts-L)、提取物中劑量組(Extracts-M)、提取物高劑量組(Extracts-H)5組，每組10只，正常組按70 mg/(kg·d)蒸餾水灌胃15 d，其他4組均先造模，按70 mg/(kg·d)維甲酸灌喂15 d制作骨質(zhì)疏松模型，當(dāng)出現(xiàn)體毛枯疏、進(jìn)食減少、口唇炎、反應(yīng)遲鈍、體重減輕、結(jié)膜充血等不良表征時(shí)視為造模成功，造模成功后正常組和模型組按1 mg/100 g灌服0.9%生理鹽水，提取物低劑量組、中劑量組和高劑量組分別按50、100、200 mg/kg灌服TFE和TIFL提取物混合物，均持續(xù)3周。末次給藥后后24 h麻醉大鼠，收集血液標(biāo)本并用TGL-16B離心機(jī)(湖南星科科學(xué)儀器有限公司)分離獲得血清，-80℃保存。迅速分離出左側(cè)股骨，石蠟包埋，常規(guī)切片。

1.2.2BMD測(cè)量右側(cè)股骨剔除軟組織后置于生理鹽水處理的無菌濕紗布中，采用美國GE公司生產(chǎn)的雙能X線骨密度測(cè)定儀測(cè)定BMD，掃描位置包括股骨全部、股骨上端、股骨下端。掃描分辨率為1.0×1.0 mm，掃描速度是10 mm/s，重復(fù)測(cè)量3次計(jì)算平均值。

1.2.3股骨病理學(xué)改變及相關(guān)參數(shù)測(cè)定左側(cè)股骨切片采用蘇木精和伊紅(Hematoxylin and eosin，HE)染色，BX53顯微鏡(日本奧林巴斯)下觀察組織的結(jié)構(gòu)變化情況，特別是骨小梁的結(jié)構(gòu)和形態(tài)，采用顯微鏡自帶的圖像分析計(jì)算機(jī)系統(tǒng)分析骨小梁組織形態(tài)相關(guān)參數(shù)，包括骨小梁數(shù)量(Trabecular number，Tb.N)、骨小梁面積(Trabecular bone area，Tb.Ar)、骨小梁厚度(Trabecular thickness，Tb.Th)、骨小梁間距(Trabecular separation，Tb.Sp)。

1.2.4免疫組織化學(xué)分析激素受體蛋白表達(dá)鼠抗人雄激素受體(Androgen receptors，AR)抗體以及鼠抗人雌激素受體(Estrogen receptor，ER)均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，切片脫蠟至水，滅活內(nèi)源性過氧化物酶并修復(fù)抗原后蒸餾水沖洗2次，PBS浸泡5 min，滴加Ⅰ抗，PBS沖洗，3 min×3次，順序滴加特異性生物素化第二抗體、過氧化物酶復(fù)合物，分別37℃溫箱孵育30 min，PBS沖洗，3 min×3次，DAB顯色、蘇木素輕度復(fù)染，脫水、封片待檢，B×53顯微鏡(日本奧林巴斯)下觀察，每張切片取連續(xù)5個(gè)高倍視野觀察染色細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均值。

2　結(jié)果

2.1各組BMD比較正常組股骨全部、股骨上端、股骨下端BMD顯著高于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；提取物中劑量組和高劑量組股骨全部、股骨上端、股骨下端BMD顯著高于模型組，提取物低劑量組股骨全部BMD顯著高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見圖1。

2.2各組骨組織病理學(xué)及相關(guān)參數(shù)比較HE染色結(jié)果見圖2A，結(jié)果顯示正常組大鼠骨松質(zhì)部位骨小梁均勻豐富，呈紅褐色，連續(xù)性好，呈網(wǎng)狀致密結(jié)構(gòu)，模型組骨小梁排列稀疏，數(shù)量明顯減少，且部分?jǐn)嗔选⒉徽R，與模型組比較，提取物各組骨小梁數(shù)量有了顯著增加，完整性、連續(xù)性明顯好轉(zhuǎn)，在提取物中劑量組和高劑量組表現(xiàn)的更明顯；相關(guān)參數(shù)比較結(jié)果顯示，正常組Tb.N、Tb.Ar、Tb.Th顯著大于模型組，Tb.Sp顯著小于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提取物中劑量組和高劑量組Tb.N、Tb.Ar、Tb.Th顯著大于模型組，Tb.Sp顯著小于模型組，提取物低劑量組，Tb.Ar、Tb.Th顯著大于模型組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，見圖2。

圖1　各組股骨全部(A)、股骨上端(B)、股骨下端(C)BMD比較Fig.1　Comparison of BMD in whole of femur(A),femur head(B),and femur neck(C) among each groupNote: Compared with model group,*.P<0.05,**.P<0.01.

圖2　各組骨組織病理學(xué)及相關(guān)參數(shù)比較Fig.2　Comparison of bone histomorphometry and trabecular bone parameters among each groupNote: Compared with model group,*.P<0.05,**.P<0.01;A.Representative microscope images of trabecular bone microarchitecture in femurs(×100);B.Comparison of Tb.Ar;C.Comparison of Tb.Th;D.Comparison of Tb.Sp;E.Comparison of Tb.N.

圖3　各組性激素受體蛋白表達(dá)情況比較Fig.3　Comparison of protein expressions of AR and ER among each groupNote: Compared with model group,*.P<0.05,**.P<0.01;A.Expression levels of AR estimated by immunohistochemical analysis(×400);B.Expression levels of ER estimated by immunohistochemical analysis(×400);C.Quantitative analysis of protein expressions of AR and ER.

2.3各組性激素受體蛋白表達(dá)情況比較染色結(jié)果表明，股骨中AR、ER蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，染色呈淡棕色，定量分析表明，正常組AR、ER蛋白表達(dá)量明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而提取物高劑量組AR、ER蛋白表達(dá)量較模型組顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

3　討論

OP 屬于中醫(yī)“骨痹”“骨痿”范疇，中醫(yī)認(rèn)為腎主骨，腎精充實(shí)則骨得其養(yǎng)，骨髓生化有源、堅(jiān)固；腎精虧虛則骨失其養(yǎng)，骨髓化生乏源、骨骼脆弱。因此，OP的病機(jī)為腎虛精虧，治則為從腎論治[6]。淫羊藿和女貞子是臨床治療OP常用的中藥組方，其中淫羊藿堅(jiān)筋骨、溫腎壯陽，女貞子滋補(bǔ)肝腎陰精，加上OP病程較長，需要長期堅(jiān)持服藥，而單純補(bǔ)陽藥淫羊藿性質(zhì)溫燥，不宜長期服用，而兩藥配伍能平補(bǔ)腎中陰陽，發(fā)揮陰陽相濟(jì)的效果[7]，因此本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)將兩種藥配伍使用，而未設(shè)置單用藥物的分組。中草藥發(fā)揮藥效主要依賴于其活性成分，因此本研究選擇淫羊藿總黃酮、女貞子環(huán)烯醚萜總苷和總黃酮作為兩種中草藥的活性成分，研究其抗骨質(zhì)疏松的效果。

本研究采用BMD和股骨病理學(xué)改變及相關(guān)參數(shù)來評(píng)價(jià)淫羊藿、女貞子提取物對(duì)維甲酸誘導(dǎo)的OP大鼠模型藥效。BMD是反映骨質(zhì)量和骨強(qiáng)度指標(biāo)[12]，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常組股骨全部、股骨上端、股骨下端BMD顯著高于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型組BMD下降的原因可能是由于骨代謝增加，骨吸收量大于形成量。提取物中劑量組和高劑量組股骨全部、股骨上端、股骨下端BMD顯著高于模型組，提取物低劑量組股骨全部BMD顯著高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。雖然BMD是骨強(qiáng)度的一個(gè)重要決定性因素，但它并不能反映骨小梁表面的重建[13]，因此本研究還觀察了股骨病理學(xué)改變及相關(guān)參數(shù)來評(píng)價(jià)骨量丟失和骨骼結(jié)構(gòu)的惡化程度。結(jié)果顯示，模型組骨小梁排列稀疏，數(shù)量明顯減少，且部分?jǐn)嗔?、不整齊，Tb.N、Tb.Ar、Tb.Th顯著減小，Tb.Sp顯著增大，提取物各組骨小梁數(shù)量有了顯著增加，完整性、連續(xù)性明顯好轉(zhuǎn)，Tb.Ar、Tb.Th顯著增大，Tb.Sp顯著減小，在提取物中劑量組和高劑量組表現(xiàn)的更明顯。本研究結(jié)果表明，淫羊藿和女貞子提取物可以減少維甲酸誘導(dǎo)的OP大鼠骨質(zhì)流失，增強(qiáng)骨骼強(qiáng)度。

性激素減少是OP發(fā)生的重要原因之一，無論是男性O(shè)P患者或者絕經(jīng)后婦女，雄性激素的減少與骨質(zhì)流失密切相關(guān)[14]。血清睪酮(Testosterone，T)下降引起的骨密度和骨質(zhì)量下降是男性O(shè)P發(fā)生的重要原因。下丘腦-垂體-性腺軸功能障礙會(huì)引起激素分泌障礙，從而引發(fā)OP。性激素只有與受體結(jié)合才能調(diào)節(jié)骨重塑，激素受體AR、ER是依賴配體活化轉(zhuǎn)錄因子的核受體家族成員，能夠作用于靶基因受體反應(yīng)元件，誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄，參與細(xì)胞的增殖和分化。細(xì)胞環(huán)境、與之結(jié)合的配體、募集的輔助調(diào)節(jié)因子等多種因子參與了調(diào)節(jié)激素受體功能，其生物效應(yīng)與多種疾病的發(fā)生、預(yù)后相關(guān)[15,16]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常組AR、ER蛋白表達(dá)量明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明維甲酸誘導(dǎo)的OP大鼠會(huì)引起AR、ER蛋白表達(dá)下降。而提取物高劑量組AR、ER蛋白表達(dá)量較模型組顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這表明，淫羊藿和女貞子提取物可以扭轉(zhuǎn)維甲酸誘導(dǎo)的這種效應(yīng)，上調(diào)AR、ER蛋白的表達(dá)，改善性激素功能。

總而言之，淫羊藿和女貞子提取物能夠增加維甲酸誘導(dǎo)的OP大鼠BMD，逆轉(zhuǎn)骨組織病理結(jié)構(gòu)，上調(diào)性激素受體蛋白表達(dá)，對(duì)維甲酸誘導(dǎo)的OP大鼠具有潛在的保護(hù)作用，有望成為OP預(yù)防和治療的新選擇。然而，其通過影響骨代謝發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用的具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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[收稿2015-12-21修回2016-01-16]

(編輯許四平)

Effect on sex hormone functional of extracts of Herba Epimedii/Fructus Ligustri Lucidi in osteoporosis rats

LI Ning-Xu,TU Yan,SHEN Ying,QIN Yan-Qiong,LEI Chao,LIU Xiang-Jie.Department of Geriatrics,Liyuan Hospital,Tongji Medical Colloge,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430070,China

Objective:To explore the effect on sex hormone functional of extracts of Herba Epimedii/Fructus Ligustri Lucidi in osteoporosis rats.Methods: 50 cases of 3 months Wistar rats were rando mly divided into normal group,model group,extract low dose group(extract-L),extract middle dose group(extract-M),extract high dose group(extract-H),10 cases in each group,in addition to the normal group,other 4 groups were bulided OP model by filling and feeding retinoic acid for 15 d,then normal group and model group were filling physiological saline;extract-L,extract-M,extract-H were respectively feeding extracts of Herba Epimedii/Fructus Ligustri Lucidi at 50 mg/kg,100 mg/kg,200 mg/kg,both for 3 weeks.Measured the bone mineral density(BMD),observed the femoral pathology change of left femur with hematoxylin and eosin(HE) staining,measured trabecular bone tissue morphology related parameters,analyzed the hormone receptor protein expression with immunohistochemistry.Results: The BMD of the whole femur,femur head,and femur neck in normal group were all significantly higher than that of model group,the BMD of the whole femur,femur head,and femur neck in extract-M and extract-H group were all significantly higher than that of model group,the BMD of the whole femur in extract-L group was significantly higher than that of model group,the differences were statistically significant(P<0.05 orP<0.01).The bone trabecular number had significantly increased,integrity,continuity improved significantly,bone histomorphometry such as Tb.Ar,Tb.Th,and Tb.N in model group were decreased,and Tb.Sp was increased,extract-M and extract-H group had remarkable effect on each index,while extract-L group only had a remarkable effect on Tb.Ar and Tb.Th(P<0.05 orP<0.01),compared with model group.The expression of AR,ER in normal groups were significantly higher than that of model group,the expression of AR,ER in extract-H group was significantly higher than that of model group,the differences were statistically significant(P<0.05 orP<0.01).Conclusion: This study demonstrated that the combination with TFE and TIFL had potential protective effects on osteoporosis rats induced by retinoic acid.The combination with TFE and TIFL is able to increase BMD,reverse pathological changes of bone tissue,coordinate hormones of the hypothalamic-pituitary-gonadal axis,and upregulate the expression of sex hormone receptors.

Herba epimedii/fructus ligustri lucidi;Retinoic acid;Osteoporosis;Bone mineral density;Sex hormone receptors

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.013

R285.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

1000-484X(2016)08-1145-05

李凝旭(1977年-)，女，博士，主治醫(yī)師，主要從事老年醫(yī)學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)、骨質(zhì)疏松癥等方面的研究，E-mail：liningxu33@163.com。

及指導(dǎo)教師：柳湘潔(1968年-)，女，主任醫(yī)師，主要從事老年醫(yī)學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)方面的研究，E-mail：liuxiangjie89@163.com。