周曉璐　王國川　譚安超　劉杰麟　張　華

(貴州醫(yī)科大學附屬人民醫(yī)院輸血科，貴陽550002)

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胱硫醚-β-合成酶在腦缺血-再灌注大鼠模型中表達變化的研究

周曉璐王國川①譚安超劉杰麟②張華①

(貴州醫(yī)科大學附屬人民醫(yī)院輸血科，貴陽550002)

①貴州醫(yī)科大學附屬人民醫(yī)院檢驗科，貴陽550002。

②貴州醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院免疫教研室，貴陽550004。

目的：觀察缺血-再灌注(Ischemia-reperfusion,IR)大鼠模型腦組織中胱硫醚-β-合酶(Cystathionine β-synthase，CBS)表達的變化及意義。方法：采用改良線栓法制備大鼠大腦中動脈栓塞(Middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型。分別應用RT-PCR及Western blot法檢測SHAM組大鼠、I組大鼠以及IR組3 h、6 h、12 h和24 h大鼠腦內(nèi)CBS mRNA和CBS蛋白的表達變化；采用ELISA法檢測大鼠血中同型半胱氨酸含量變化；采用CBS抑制劑羥胺抑制CBS活性后，Western blot法檢測氧化應激相關(guān)蛋白HO-1的表達，并用光鏡觀察腦組織的病理學變化。結(jié)果：IR大鼠腦組織CBS mRNA和蛋白表達水平顯著高于假手術(shù)組(P<0.01)，于再灌注12 h表達至峰值。和假手術(shù)組相比，血中同型半胱氨酸含量在再灌注12 h時水平最低(5.73±1.17 vs 2.88±0.93,F=25.56,P=0.001)。應用HA抑制CBS活性后，CBS及氧化應激相關(guān)蛋白HO-1表達顯著減少，光鏡下神經(jīng)元損傷進一步加重。結(jié)論：缺血-再灌注后，腦組織中CBS表達上調(diào)可能對神經(jīng)元產(chǎn)生保護效應。

腦卒中；缺血-再灌注；同型半胱氨酸；胱硫醚-β-合成酶；氧化應激

腦血管疾病尤其是腦卒中，是導致人類死亡的第三常見疾病，也是成人致殘的主要原因。其發(fā)病逐漸年輕化且發(fā)病率漸高，已成為家庭和社會的負擔。因此，對引發(fā)卒中的危險因素進行識別和干預，進而降低發(fā)病率和死亡率就顯得尤為重要[1]。近年來多項研究證實，高同型半胱氨酸(Homocysteine，HCY)血癥可作為腦卒中的獨立危險因素[2,3]。HCY是蛋氨酸脫甲基形成的含硫氫基的氨基酸；體內(nèi)的HCY可被胱硫醚-β-合酶(Cystathionine β-synthase，CBS)催化后縮合為胱硫醚[4]。若CBS的含量或活性發(fā)生變化，會引起同型半胱氨酸血漿濃度異常。本研究動態(tài)觀察了腦缺血-再灌注(Ischemia-reperfusion,IR)大鼠模型腦組織中CBS的變化，為探索其在IR腦損傷中的作用提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器與試劑RIPA裂解液購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司，Trizol RNA 提取試劑以及CBS和β-actin引物購自美國Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TOYOBO公司，實時熒光定量PCR試劑盒購自美國KAPA公司，HCY ELISA試劑盒、CBS抗體和HO-1抗體購自美國Abcam公司，β-actin-HRP和HRP二抗購自美國Santa Cruz公司，羥胺(Hydroxyla mine，HA)購自美國Sigma公司。微孔板檢測儀(SpectraMax M2)購自加拿大Molecular Devices公司。

1.1.2實驗動物分組健康SD大鼠30只，體重250～280 g，鼠齡3～4個月，雌雄不拘，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司。每個分組5只，隨機分成:(1)SHAM組：即假手術(shù)對照組，對大鼠進行10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)腹腔注射麻醉后僅暴露頸總動脈不進行血管夾閉；(2)I組：即單純?nèi)毖M，對大鼠行麻醉手術(shù)后夾閉血管使缺血2 h；(3)IR組：即缺血再灌注組，夾閉血管使大鼠缺血2 h后松開血管夾使恢復血流，根據(jù)再灌注時間又分為再灌注3、6、12和24 h組；(4)HA組，缺血2 h再灌注6 h后，按照12.5 mg/kg的劑量腹腔注射CBS抑制劑HA[5]，再灌注至12 h。實驗結(jié)束時處死大鼠，眼眶取血及開顱取腦后進行相關(guān)指標的檢測。

1.2方法

1.2.1動物模型制備參照Belayev等[6]改良的Longa方法，選用頸外動脈插入線栓法制備大鼠大腦中動脈栓塞(Middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型。術(shù)中嚴密觀察，保持大鼠肛溫在36.5～37.5℃。

1.2.2神經(jīng)功能評價經(jīng)麻醉的大鼠清醒后，其神經(jīng)功能評定參考Longa 5分制評分標準[7]。0分：無神經(jīng)損傷癥狀；1分：不能完全伸展對側(cè)前爪；2分：向右側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：向右側(cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識喪失。

1.2.3腦組織中總mRNA的提取和CBS cDNA的RT-PCR不同時間點取的腦組織暫時放于-196℃液氮罐保存，樣本收齊后，腦組織總mRNA提取操作按照Trizol試劑說明書進行。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，將提取的mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。β-actin引物序列為F:5′-ATGGATGACGATAT-CGCTGCG-3′和R:5′-TCGTCCCAGTTGGTGACA-ATG-3′；CBS引物序列為F:5′-GAACCAGACGGAGCAAACAG-3′和R:5′-TGTAGAGGACTTTGCAGACT-3′。用1%瓊脂糖凝膠對RT-PCR產(chǎn)物進行電泳分離后凝膠成像照相。用Bandscan5.0凝膠圖像處理軟件進行灰度分析，CBS mRNA相對表達量=CBS擴增產(chǎn)物條帶灰度值/β-actin擴增產(chǎn)物條帶灰度值。

1.2.4蛋白提取和Western blot檢測用RIPA裂解液裂解組織收取蛋白上清液。定量30 μg總蛋白，并用10% 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，濕轉(zhuǎn)法將目的蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯膜。用含有5%脫脂牛奶的TBST室溫封閉2 h后孵育一抗，4℃搖床輕搖過夜；用TBST洗膜3次后，室溫孵育辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)標記二抗1 h。ECL化學發(fā)光后，測定反應條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計算各種蛋白的相對表達量。

1.2.5ELISA驗證血清HCY的表達按照ELISA試劑盒說明書進行操作，檢測各組大鼠血中HCY的含量。1.2.6腦組織學檢查大鼠腦組織用10 %中性甲醛固定后進行石蠟包埋，制成5 μm厚切片行HE染色，光鏡下觀察腦組織病理變化。

2　結(jié)果

2.1大鼠神經(jīng)功能評定結(jié)果IR組大鼠麻醉清醒后均出現(xiàn)明顯的眼球下陷，肢體無力等癥狀，神經(jīng)功能評分為平均為(3.40±0.55)分，且肢體癱瘓癥狀以缺血2 h再灌注24 h最明顯；I組2只不能伸展前肢，2只出現(xiàn)向左側(cè)劃圈，1只出現(xiàn)向左傾倒，神經(jīng)功能評分為(1.80±0.84)分；HA組出現(xiàn)1只不能伸展前肢，1只出現(xiàn)向左側(cè)劃圈，3只出現(xiàn)向左傾倒，神經(jīng)功能評分為(2.40±0.89)分；而假手術(shù)組動物則無明顯的神經(jīng)功能障礙。

2.2腦組織中CBS mRNA表達的變化CBS mRNA在SHAM組和I組大鼠腦組織中表達無差異(P>0.05)。與SHAM組相比，腦組織中的CBS mRNA在缺血-再灌注3 h后開始上調(diào)(P<0.01)，12 h表達至峰值(P<0.01)，見圖1。

2.3腦組織中CBS蛋白表達的變化Western blot實驗結(jié)果顯示，CBS蛋白在SHAM組和I組大鼠腦組織中表達無差異(P>0.05)。與SHAM組相比，腦組織中的CBS蛋白在缺血-再灌注6 h后開始上調(diào)(P<0.01)，12 h表達至峰值(P<0.01)，見圖2。應用HA抑制CBS，至再灌注12 h時，CBS的表達量相

圖1　缺血-再灌注各時間點大鼠腦組織中CBS mRNA的表達Fig.1　Expression of CBS mRNA in rat brain during cerebral ischemia-reperfusionNote: Compare with SHAM group，*.P<0.05,**.P<0.01.

圖2　缺血-再灌注各時間點大鼠腦組織中CBS 蛋白的表達Fig.2　Expression of CBS protein in rat brain during cerebral ischemia-reperfusionNote: Compare with SHAM group，*.P<0.05,**.P<0.01.

圖3　各組大鼠腦組織中CBS和HO-1的表達Fig.3　Expression of CBS and HO-1 in rat brain between different groupsNote: Compare with SHAM group，*.P<0.05,**.P<0.01.

圖4　各組大鼠大腦皮質(zhì)的組織形態(tài)學改變(HE染色，×400)Fig.4　Morphological changes of cerebral cortex in different groups(HE staining,×400)

表1　各組大鼠缺血-再灌注時血中HCY含量的變化Tab.1　Concentration of plasma HCY in rat during cerebral ischemia-reperfusion

較于IR組顯著下調(diào)，同時觀察到HO-1發(fā)生協(xié)同性變化，差異有統(tǒng)計學意義，見圖3。

2.4血HCY含量的變化SHAM組和I組大鼠血中HCY含量沒有統(tǒng)計學差異。與SHAM組相比，缺血-再灌注12 h后血中HCY顯著下調(diào)(5.73±1.17 vs 2.88±0.93,F=25.56,P=0.001)；應用HA抑制CBS活性，血中HCY含量則無明顯改變(P>0.05)，見表1。

2.5腦組織形態(tài)學的變化光鏡下可見SHAM組腦組織結(jié)構(gòu)清晰，未發(fā)現(xiàn)病理性改變。I組腦組織病理損傷輕，少量神經(jīng)元胞核、胞體增大，著色變淺。與SHAM組相比，IR組大腦皮質(zhì)部分神經(jīng)病理損傷進一步加重，細胞周圍出現(xiàn)水腫裂隙。應用HA抑制CBS活性，光鏡下可見HA組較IR組病變減輕，固縮的神經(jīng)元數(shù)目減少，見圖4。

3　討論

根據(jù)世界各國死亡報告統(tǒng)計表明，全球每年死于腦卒中者約59.8%為缺血性腦卒中[8]。持續(xù)腦缺血可引起神經(jīng)細胞不可逆的損傷從而導致腦功能的降低或損壞，而短暫性腦缺血后，機體會做出防御反應，主動產(chǎn)生神經(jīng)保護作用相關(guān)因子或大分子蛋白，這種內(nèi)在對抗機制使機體能耐受一定程度的缺血損傷[9]。本研究運用大鼠大腦中動脈栓塞(MCAO)模型，觀察腦缺血-再灌注腦組織中CBS含量的動態(tài)變化。研究發(fā)現(xiàn)，缺血-再灌注后CBS水平呈時間依賴性增加，在12 h時可達高峰，相反血中HCY水平則降至最低，表明缺血-再灌注發(fā)生時，體內(nèi)CBS和HCY可能參與了疾病過程；對IR大鼠使用CBS抑制劑HA后，CBS表達量減少，HCY水平較未使用HA大鼠有顯著升高，且HO-1的表達則減少，提示CBS在腦卒中的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了舉足輕重的作用，細胞氧化應激亦可能參與其中。

IR發(fā)生后，腦組織內(nèi)誘導產(chǎn)生大量的誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)及其產(chǎn)物NO，同時血液中超氧陰離子等各種自由基含量也急劇上升，NO與超氧陰離子快速結(jié)合生成氧化性更強的過氧亞硝基陰離子(ONOO-)，使腦內(nèi)的自由基反應進一步增強，損傷加重[10]。組織細胞可產(chǎn)生多種抗氧化酶抵御氧化性損傷，其中血紅素氧合酶(Hemeoxygenase，HO)亞型HO-1是細胞對抗應激反應和抗氧化損傷的重要組成部分。Robert等[11]研究指出，由CBS缺乏引起的高半胱氨酸血癥和肝臟細胞的氧化應激相關(guān)。Han等[12]則進一步證實，在熱驚厥小鼠模型中使用CBS抑制劑HA后，HO-1的表達下調(diào)，細胞抗氧化損傷能力減弱。此外，王瑜玲等[13]應用大鼠肢體缺血-再灌注模型觀察大腦皮層和海馬區(qū)CBS表達量的變化，發(fā)現(xiàn)12 h時CBS的表達量最高，其調(diào)控的具有神經(jīng)元保護作用的硫化氫(H2S)水平相應增高；當抑制CBS的表達時，光鏡下可見神經(jīng)元的病變進一步加重，證實CBS對神經(jīng)元有一定的保護效應。CBS作為同型半胱氨酸代謝的限速酶，其含量和活性的變化直接決定了血液中HCY的水平。Baumbach等[14]通過檢測CBS基因缺陷鼠中HCY的含量，發(fā)現(xiàn)相比于野生型CBS+/+鼠，CBS+/-鼠中HCY的水平升高了近60%，同時觀察到小鼠大腦血管壁顯著增厚，提示CBS及其調(diào)控的HCY在血管疾病的發(fā)病中發(fā)揮了重要作用。

1969年McCully[15]首次提出高同型半胱氨酸與心腦血管疾病存在關(guān)聯(lián)，此后，大量研究表明高同型半胱氨酸血癥是腦卒中的獨立危險因素。HCY是一種含巰基的氨基酸，是甲硫氨酸代謝的中間產(chǎn)物，在正常情況下HCY維持在較低水平(5～15 mmol/L)，其生成和代謝保持動態(tài)平衡[16]。HCY每升高50 μmol/L，腦血管病的風險將增加50%。CBS參與同型半胱氨酸的代謝，在CBS的催化下，絲氨酸與同型半胱氨酸結(jié)合使之清除。CBS水平明顯降低可引起高同型半胱氨酸血癥，后者進一步促進動脈硬化的形成。高HCY致腦卒中的發(fā)病機制可能是多方面的，HCY可促使過氧化氫和氧自由基生成，對血管內(nèi)皮細胞造成損傷和毒性作用；其次，它還可以促進動脈平滑肌細胞的增生；通過加速低密度脂蛋白氧化、增加泡沫細胞的形成和激活血小板黏附、聚集，亦可導致脈粥樣硬化和梗死[17]。

本研究初步證實了CBS表達上調(diào)在缺血-再灌注損傷中對神經(jīng)元有保護作用，我們將進一步研究CBS在IR腦損傷過程中確切的抗氧化應激機制。

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[收稿2015-11-16修回2016-01-27]

(編輯張曉舟)

Dynamic change of cystathionine β-synthase during cerebral ischemia-reperfusion and its effect in rats

ZHOU Xiao-Lu,WANG Guo-Chuan,TAN An-Chao,LIU Jie-Lin,ZHANG Hua.Department of Hematology,the Affiliated People′s Hospital of Guizhou Medical University,Guiyang 550002,China

Objective:To observe the dynamic change of cystathionine β-synthase during cerebral ischemia-reperfusion and its effect in rats.Methods: The ischemic model was established with line embolism to block the middle cerebral artery.The reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR) and Western blot assay were used to assess the expression of cystathionine β-synthase(CBS) in SHAM group,I group,and IR group.ELISA assay was performed to detected the homocysteine(HCY) level in plasma.After treating with the inhibitor of cystathionine β-synthase called hydroxyla mine(HA),the expression of hemeoxygenase 1(HO-1) and the pathologic change of the brain was evaluated.Results: As compared to sham group,the expression of CBS was significantly up-regulated in ischemia-reperfusion group at 12 h post-reperfusion.Meanwhile,it existed the lowest level of HCY at 12 h post-reperfusion,comparing to sham grouzp(5.73±1.17 vs 2.88±0.93,F=25.56,P=0.001).When inhibited the activity of CBS via using HA,the down-regulation of HO-1 protein and further damage in neuron were observed.Conclusion: Cystathionine β-synthase serves as an protective factor during cerebral ischemia-reperfusion.

Stroke;Ischemia-reperfusion;Homocysteine;Cystathionine β-synthase;Oxidative stress

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.012

R743.31文獻標志碼A

1000-484X(2016)08-1141-04

周曉璐(1984年-)，女，碩士，主管技師，主要從事免疫學、輸血檢驗方面的研究，E-mail：zhouxiaolu293@163. com。

及指導教師：劉杰麟(1963年-)，男，博士，教授，主要從事基礎(chǔ)免疫學方面的研究，E-mail：ljll282@163.com。

張華(1970年-)，女，博士，主任技師，主要從事臨床免疫學方面的研究，E-mail：zhanghua937@163.com。