魯明騫　孔慶志　許新華　盧宏達　趙華山　周　剛　徐冰清　郭　蓉

(三峽大學第一臨床醫(yī)學院腫瘤研究所&湖北省宜昌市中心人民醫(yī)院腫瘤內科，宜昌443000)

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鼻咽癌MKK4蛋白表達與-1044A/T多態(tài)性的相關性分析①

魯明騫孔慶志②許新華盧宏達②趙華山周剛徐冰清郭蓉

(三峽大學第一臨床醫(yī)學院腫瘤研究所&湖北省宜昌市中心人民醫(yī)院腫瘤內科，宜昌443000)

①本文為湖北省自然科學基金面上項目(2014CFB675)、湖北省教育廳重點項目(D20141205)和2012年宜昌市科技研究與開發(fā)項目(A12301-03)。

②武漢市中心醫(yī)院&武漢市腫瘤研究所，武漢430061。

目的：探討鼻咽癌組織中MKK4蛋白的表達與-1044A/T多態(tài)性的相關性。方法：90例鼻咽癌患者，運用免疫組化法測定MKK4蛋白的表達，以聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性法(PCR-RFLP)檢測其基因-1044A/T位點單核苷酸多態(tài)性。結果：鼻咽癌組織中MKK4蛋白表達(-)為24.4%(22/90)，(+)為15.6%(14/90)，(++)為34.4%(31/90)，(+++)為25.6%(23/90)。低表達(-/+)患者共36例，-1044AA基因型占22例(61.11%)，AT基因型占12例(33.33%)，TT基因型占2例(5.56%)，AT+TT基因型共占14例(38.89%)；高表達患者共54例，其中AA基因型占38例(70.37%)，AT基因型占15例(27.78%)，TT基因型占1例(1.85%)，AT+TT基因型共占16例(29.63%)。低表達與高表達發(fā)生T基因變異無統計學意義(Z=0.323,P=0.747)。結論：MKK4蛋白表達的高低與-1044A/T啟動子基因多肽性無明顯相關性。

鼻咽癌；MKK4蛋白；1044A/T；多態(tài)性

鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)好發(fā)于我國南方各省，世界上80%的鼻咽癌患者發(fā)生在中國，占頭頸部惡性腫瘤的首位[1]。鼻咽癌的發(fā)生受多重因素的影響，其中信號傳導在鼻咽癌的發(fā)生和發(fā)展中具有重要的作用，MKK4(Mitogen-activated protein kinase kinase 4)作為絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases，MAPKs)信號傳導通路的組成部分，在受到外界因素刺激后，能將細胞外信號傳導至細胞內，對腫瘤細胞的生長、增殖、凋亡和轉移等有一定的調節(jié)作用[2-4]。單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism，SNP)在惡性腫瘤的發(fā)病、治療與預后等方面的研究是目前的熱點，目前關于MKK4啟動子區(qū)-1044A/T多態(tài)性與鼻咽癌的關系尚未見相關報道，本研究將探討鼻咽癌MKK4蛋白的表達與其啟動子區(qū)1044A/T多肽性的關系，為鼻咽癌的早期發(fā)現、早期診斷和早期治療等提供一種分子理論依據。

1　材料與方法

1.1一般資料收集2009年1月至2014年12月我院鼻咽癌患者90例，其中男性54例、女性36例，年齡22～73歲，平均年齡(45.3±5.2)歲。病理科有完整的石蠟組織標本，同時抽取患者外周靜脈血2 ml待測。

1.2方法

1.2.1將石蠟組織標本制備成4 μm厚的連續(xù)切片，經脫蠟、水化、高溫高壓抗原修復后，滴加MKK4單克隆抗體(1∶80) (購于杭州華安生物技術有限公司)，4℃過夜，37℃復溫45 min，PBS洗滌2 min，共3次，滴加生物素化二抗，37℃ 20 min，PBS洗滌2 min，共3次，加試劑SABC，37℃作用20 min，PBS洗滌5 min，共4次，加用DAB顯色劑，然后在顯微鏡下進行觀察。陰性對照以PBS代替。

1.2.2MKK4基因-1044A/T基因型測定采用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態(tài)性法(PCR-RFLP)測定MKK4-1044A/T (rs3809728)的基因型，外周靜脈血2 ml，離心(10 000 r/min×10 min)后取白細胞的沉淀，用QIAGEN公司的FlexiGene DNA kit試劑盒提取凍血DNA，提取樣本500 μl，稀釋至20～30 ng/L。自設上游引物為5′-TTGGGTTTGG AACAAGAAGG-3′(forward)，下游引物為5′-CAGCCTTGCCTAAAATGGAA-3′(reverse)。起始高溫變性(94℃×5 min)，35個循環(huán)適溫延伸(94℃×30 s)，低溫退火(72℃×60 s)，最后擴增階段(72℃×10 min)。用核酸內切酶TSP509 I消化擴增好的片段(65℃過夜)，然后置于2% 瓊脂糖凝膠分離，隨機選取2個SNP位點提純片段10%的片段進行測序確定效果。

1.3統計學方法所有數據用SPSS13.0統計軟件進行分析處理。采用直接計數法計算基因型及等位基因頻率。如果方差不齊，采用兩獨立樣本的Wilcoxon秩和檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

免疫組化結果表明，MKK4蛋白在鼻咽癌組織中陰性表達率為24.44%(22/90)，陽性表達率為75.56%(68/90)，其中(+)為14人，占15.56%，(++)為31人，占34.44%，(+++)為23人，占25.56%。低表達(-/+)共36例(40%)，高表達(++/+++)共54例(60%)。見圖1、表1。

通過聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性法(PCR-RFLP)檢測鼻咽癌患者啟動子-1044A/T基因型。采用核酸內切酶Sml I處理后，-1044TT基因型共產生了70 bp和152 bp兩條帶，-1044AA基因型產生了分子量為222 bp一條帶，而雜合子共產生了70、152和222 bp三條帶(見圖2)。所有的結果均由經驗豐富的實驗者采用單盲法評價，隨機選取2個SNP位點提純片段10%的片段進行測序確定效果。其中AA基因型占60例(66.67%)，AT基因型占27例(30.00%)，TT基因型占3例(3.33%)，AT+TT基因型共占30例(33.33%)。見表2。

90例鼻咽癌患者中，低表達(-/+)患者共36例，-1044AA基因型占22例(61.11%)，AT基因型占12例(33.33%)，TT基因型占2例(5.56%)，AT+TT基因型共占14例(38.89%)；MKK4蛋白高表達患者共54例，其中AA基因型占38例(70.37%)，AT基因型占15例(27.78%)，TT基因型占1例(1.85%)，AT+TT基因型共占16例(29.63%)。低表達與高表達發(fā)生T基因變異無統計學意義。Z=0.323,P=0.747，見表3。

表1　MKK4蛋白在鼻咽癌組織的表達Tab.1　MKK4 protein expression in nasopharyngeal carcinoma

表2　鼻咽癌患者啟動子-1044A/T基因型情況Tab.2　Distribution of patients with nasopharyngeal carc-inoma SNP -1044A/T

圖1　MKK4的免疫組化切片Fig.1　Immunohistochemical analysis of MKK4Note: A.Nasopharyngeal carcinoma tissue;B.Chronic inflammation nasopharyngeal tissue.

表3　1044A/T基因型與蛋白表達的關系Tab.3　1044A/T relationship with expression of differe-nt genotypes

圖2　MKK4 -1044A>T 基因擴增產物凝膠電泳結果Fig.2　Result of PCR-RFLP for MKK4 -1044A T gene

3　討論

鼻咽癌是頭部最常見的惡性腫瘤，好發(fā)于我國及東南亞國家，尤其以廣東省最多見，發(fā)病率達20/10萬～30/10萬，而歐洲、北美洲和大洋洲國家的發(fā)病率較低，低于1/10萬[1]。鼻咽癌的發(fā)生與EB病毒感染、化學和遺傳因素等有關，由于這些細胞外信號的刺激，可激活蛋白激酶，如MAPK、蛋白激酶C、蛋白激酶A、鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶(CAMK)等等。目前研究認為MAPK信號傳導通路是最重要的蛋白激酶信號傳導通路之一，而MKK4作為MAPK信號傳導通路的重要組成部分，可能是多種上游致癌應激信號途徑的匯聚點，是癌基因Ras信號傳導通路的中心環(huán)節(jié)，對細胞的增殖、炎癥反應、細胞凋亡起著非常重要的調節(jié)作用[5]，能同時磷酸化并激活JNK通路和p38通路。MKK4蛋白的表達高低與多種惡性腫瘤惡性程度相關[6-8]，有研究認為MKK4在胃癌中表達越高，其無復發(fā)生存及總生存率越低[9]，但有學者在乳腺癌及胰腺癌的研究中，卻得到了相反的實驗結果[10，11]。本研究的結果顯示，鼻咽癌組織中MKK4蛋白表達(-)為24.44%(22/90)，(+)為15.56%(14/90)，(++)為34.44%(31/90)，(+++)為25.56%(23/90)，低表達(-/+)共36例(40%)，高表達(++/+++)共54例(60.00%)，前期結果研究發(fā)現在有淋巴結轉移、分化程度較差的組織中的MKK4蛋白的表達率明顯低于無淋巴結轉移、分化程度相對較好的組織，具有統計學差異(P<0.05)[12]。

單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymor-phism，SNP)是由于單個堿基的轉換、缺失和插入，導致的在不同個體間的可檢測的DNA序列中單個堿基的差異[13]。癌基因、抑癌基因、基質金屬蛋白酶、細胞因子及其受體等相關基因的SNP變化均與惡性腫瘤有著明顯的相關性，而這些多態(tài)性的研究最常見的是關于基因啟動子區(qū)域的探索。目前研究發(fā)現MDM2 SNP309T/G、Fas-SNP 1377G/A和FasL-SNP 844T/C、SNP-1298A/C、1304A/T等基因多態(tài)與鼻咽癌的發(fā)病風險相關，特別是在早期及吸煙患者中更明顯[14-16]。而SNP-139 GG、-939 AA和-1082 A/G多態(tài)性與鼻咽癌的遺傳易感性相關[17]。Farhat等[18]在-18啟動子SNP-607 C/A 和-137 G/A多態(tài)性研究發(fā)現其多態(tài)性的變化對鼻咽癌的發(fā)生和發(fā)展具有重要的促進作用。本研究通過聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性法(PCR-RFLP)檢測90例鼻咽癌患者啟動子-1044A/T基因型，其中AA基因型占60例(66.67%)，AT基因型占27例(30.00%)，TT基因型占3例(3.33%)，AT+TT基因型共占30例(33.33%)。MKK4蛋白低表達(-/+)患者共36例，-1044AA基因型占22例(61.11%)，AT基因型占12例(33.33%)，TT基因型占2例(5.56%)，AT+TT基因型共占14例(38.89%)；MKK4蛋白高表達患者共54例，其中AA基因型占38例(70.37%)，AT基因型占15例(27.78%)，TT基因型占1例(1.85%)，AT+TT基因型共占16例(29.63%)。低表達與高表達發(fā)生T基因變異無統計學意義(Z=0.323,P=0.747)。本研究發(fā)現對于多態(tài)性位點-1044AT,攜帶-1044AA、-1044AT及-1044TT各基因型鼻咽癌患者與MKK4蛋白表達含量的差別無統計學意義。

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[收稿2015-10-20修回2016-03-17]

(編輯張曉舟)

Correlation between MKK4 protein expression and -1044A/T polymorphism in Nasopharyngeal carcinoma

LU Ming-Qian,KONG Qing-Zhi,XU Xin-Hua,LU Hong-Da,ZHAO Hua-Shan,ZHOU Gang,XU Bing-Qing，GUO Rong.Three Gorges University Oncology Institute,the First College of Clinical Medical Science,China Three Gorges University,Department of Oncology,Yichang Central People′s Hospital,Yichang 443000,China

Objective:Discussion MKK4 protein expression in nasopharyngeal carcinoma and -1044A/T polymorphism correlation.Methods: 90 patients with nasopharyngeal carcinoma,MKK4 protein expression was determined by immunohistochemical staining,polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) to detect the gene -1044A/T sites monocytes nucleotide polymorphism.Results: MKK4 protein expression in nasopharyngeal carcinoma (-) was 24.4% (22/90),(+) was 15.6% (14/90),(++) was 34.4% (31/90),(+++) was 25.6% (23/90).Low expression (-/+) patients with a total of 36 cases,-1044AA genotype accounted for 22 cases (61.11%),AT genotype accounted for 12 cases (33.33%),TT genotype accounted for two cases (5.56%),AT + TT gene type accounted for 14 cases (38.89%).The patients with high MKK4 expression of 54 cases,of which accounted for 38 cases of AA genotype (70.37%),AT genotype accounted with 15 cases (27.78%),TT genotype accounted for one case (1.85%),AT + TT genotype accounted for 16 cases (29.63%).Low expression and high expression of T gene mutation occurs no significant (Z=0.323,P=0.747).Conclusion: MKK4 protein expression correlated with -1044A/T gene promoter polymorphisms was no significant correlation.

Nasopharyngeal carcinoma;MKK4 protein;1044A/T；Polymorphism

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.011

R739.62文獻標志碼A

1000-484X(2016)08-1137-04

魯明騫(1973年-)，男，博士，副主任醫(yī)師，主要從事腫瘤中西醫(yī)結合臨床及基礎研究。

及指導教師：孔慶志(1952年-)，男，教授，博士生導師，主要從事腫瘤中西醫(yī)結合臨床及基礎研究。