王曉娜　任來峰　趙安江　楊萬霞　任云青

(山西醫(yī)科大學汾陽學院，汾陽032200)

?

3-甲基腺嘌呤對喜樹堿誘導的宮頸癌Hela細胞凋亡的影響①

王曉娜任來峰趙安江楊萬霞任云青

(山西醫(yī)科大學汾陽學院，汾陽032200)

①本文為山西省自然科學基金(No.2014021037-9)、山西醫(yī)科大學汾陽學院博士啟動基金(No.1301)和山西醫(yī)科大學汾陽學院科研項目基金(No.1422)資助的課題。

目的：本研究探討自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)對喜樹堿(Camptothecin,CPT)誘導的Hela細胞凋亡的影響。方法：用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT方法)檢測CPT對Hela細胞作用的最佳藥物濃度和時間，以及不同藥物對Hela細胞增殖活性的影響；用免疫印跡及免疫熒光檢測不同藥物作用于Hela細胞后，Hela細胞自噬標志蛋白微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)、p62及凋亡相關蛋白的變化；DAPI核染色觀察細胞凋亡。結果：CPT作用于Hela細胞后，Hela細胞增殖活性明顯下降，并且可誘導自噬現(xiàn)象的發(fā)生。CPT和3-MA聯(lián)合作用較單獨CPT作用Hela細胞的增殖活性降低，細胞自噬水平下降，凋亡率明顯升高。結論：CPT在誘導Hela細胞凋亡的同時可誘導自噬，通過3-MA抑制自噬可增強Hela細胞對CPT作用的敏感性。

3-甲基腺嘌呤；喜樹堿；自噬；凋亡；Hela細胞

宮頸癌是全世界發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，嚴重威脅女性的生命健康[1]?；熢谥型砥趯m頸癌及復發(fā)轉移宮頸癌患者治療中發(fā)揮重要作用，然而腫瘤耐藥已經(jīng)成為化療失敗、腫瘤復發(fā)的主要原因[2]。因此，探討如何抑制腫瘤細胞耐藥性的發(fā)生或增強化療藥物的抗癌活性成為臨床治療腫瘤的重要課題。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，多種化療藥物可引起腫瘤細胞的自噬反應，自噬在腫瘤化療中可能發(fā)揮促凋亡或促生長作用，可能與腫瘤細胞耐藥有關[3]。喜樹堿(Camptothecin,CPT)是以拓撲異構酶Ⅰ為作用靶點的抗腫瘤藥物，臨床上已被用于卵巢癌、宮頸癌、結直腸癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌及腦瘤的治療[4]。本實驗以宮頸癌Hela細胞為細胞模型，通過將自噬抑制劑3-MA與CPT聯(lián)合使用，觀察抑制自噬對CPT誘導Hela細胞凋亡的影響，探討自噬與CPT化療作用間的關系，為宮頸癌治療提供新的策略。

1　材料與方法

1.1實驗材料人宮頸癌Hela細胞株和喜樹堿(Sigma)由四川大學華西第二醫(yī)院發(fā)育與干細胞研究所劉聰教授惠贈；高糖DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司；胎牛血清購自Gibco公司；3-MA及氯喹(CQ)購自Selleck公司；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)及二甲基亞砜(DMSO)均購自北京索萊寶公司；抗α-tubulin 抗體、HRP標記的抗鼠和抗兔二抗、Cyc3標記的抗兔二抗均購于Sigma公司；抗LC3B、caspase-2抗體購自Cell Signaling Technology公司；抗p62及PARP抗體購自Abcam公司；細胞核染料DAPI購自Vector公司；ECL化學發(fā)光劑購自Millipore公司；細胞培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)板購自Corning公司；酶標儀(Eon)購自BioTek公司；熒光顯微鏡(DM4000)購自Leica公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)與傳代宮頸癌Hela細胞接種于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液的高糖DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2進行培養(yǎng)，每隔2日更換新鮮細胞培養(yǎng)液，待細胞長至70%～80%匯合度時，用0.25%胰酶進行消化處理。

1.2.2MTT細胞增殖活性的檢測收集對數(shù)期細胞，調整細胞濃度為6×104～7×104個/ml，接種于96孔板，每孔100 μl；待細胞完全貼壁后，加入作用藥物，對照組加DMSO，每組設立5個復孔；放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)8、32、56 h，終止培養(yǎng)前4 h加入10 μl MTT溶液(濃度為5.0 mg/ml)；終止培養(yǎng)后，輕輕吸棄孔內培養(yǎng)基，每孔加入150 μl DMSO，低速振蕩10 min，待結晶充分溶解，在570 nm測量各孔的吸光度值，計算各孔平均OD值，以對照組細胞活性為100%，計算各孔的細胞抑制率，細胞抑制率=(對照組OD值-實驗組OD值)/對照組OD值×100%。檢測不同濃度CPT對Hela細胞增殖活性的影響，CTP濃度分別設為0.5、1.0、2.0 μmol/L；為檢測3-MA與CPT聯(lián)合對Hela細胞增殖活性的影響，將細胞分為4組，分別為對照組(DMSO)、CPT組(1.0 μmol/L)、3-MA(1.0 mmol/L)、CPT(1.0 μmol/L)+3-MA(1.0 mmol/L)聯(lián)合組。

1.2.3免疫熒光檢測將對數(shù)期Hela細胞用胰酶消化離心，調整細胞濃度，將Hela細胞接種于小載玻片上，待細胞完全貼壁后，分別加入對應藥物，培養(yǎng)16 h，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌一次，加入4%PFA固定10 min或冰甲醇-20℃固定15 min(用于LC3染色),PBS洗滌一次；加入0.3%TritonX-100通透10 min,PBS洗滌一次；免疫熒光封閉液(0.1%TritonX-100+1%BSA)室溫封閉30 min;吸棄封閉液，加入抗LC3B、p62一抗，37℃、30 min，PBS洗滌3次；加入Cyc3標記的抗兔二抗(1∶200)37℃，濕暗盒30 min，PBS洗滌3次；DAPI進行封片，固定，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.4免疫印跡分析取對數(shù)生長期的Hela細胞，消化離心，鋪6孔板，細胞貼壁后，加入相應的藥物，藥物分組同熒光染色分組，作用36 h,收集細胞，加入(強)RIPA裂解液，在冰上裂解15～30 min后，4℃,12 000 r/min,離心10 min，取上清用BCA法進行蛋白濃度的測定，調整蛋白濃度，加入4×loading Buffer煮沸變性10 min得到蛋白樣品。上樣，用12%SDS-PAGE膠進行蛋白電泳，轉移至NC膜上，用5%脫脂奶粉封閉2 h，加入抗LC3B、p62、PARP、caspase-2、α-tubulin，4℃過夜，TBST洗滌3次；加入HRP標記的抗兔二抗、抗鼠二抗，室溫1 h,TBST洗滌3次，每次10 min,加入ECL底物發(fā)光，在暗室進行曝光，顯影、定影，觀察結果。

1.2.5細胞凋亡分析按1.2.3方法收集細胞，用DAPI染細胞核，在熒光顯微鏡下觀察，參考文獻[5]的方法計數(shù)正常細胞與凋亡細胞，計算細胞凋亡率。

2　結果

2.1CPT對宮頸癌Hela細胞的毒性作用CPT具有抑制Hela細胞的增殖活性。選用不同濃度CPT(0.5、1.0、2.0 μmol/L)分別作用Hela細胞12、36、60 h,倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)見圖1A，用MTT檢測CPT對Hela細胞增殖活性影響。CPT對Hela細胞抑制率隨藥物濃度增加及時間延長，呈劑量和時間依賴性(圖1B)。

2.2CPT誘導Hela細胞自噬的產(chǎn)生CPT作用于Hela細胞后，Hela細胞內LC3的熒光強度及LC3-Ⅱ蛋白表達水平升高(圖2A、C)；同時p62的熒光強度及p62蛋白表達水平降低(圖2B、圖4)；氯喹(CQ)與CPT聯(lián)合作用于Hela細胞較單獨CPT或CQ作用，LC3的熒光強度及LC3-Ⅱ蛋白水平明顯升高(圖2A、C)，以上結果表明CPT可誘導Hela細胞產(chǎn)生自噬。

圖1　CPT 對Hela 細胞增殖活性的影響Fig.1　Effect of CPT on Hela cell proliferation activityNote: A.Morphological changes of Hela cells after treated with different concentrations of CPT for 36 hours(×20)；B.Cell inhibition rate of Hela cells after treated with CPT.

2.33-MA聯(lián)合CPT明顯抑制Hela細胞的增殖單獨使用1 mmol/L 3-MA作用于Hela細胞，Hela細胞的增殖活性無顯著變化(P>0.05)；3-MA與CPT聯(lián)合作用于Hela細胞較單獨3-MA或CPT作用于Hela細胞(36 h,60 h)，Hela細胞的增殖活性明顯降低(P<0.05，圖3A、B)，以上提示3-MA抑制自噬可顯著增強CPT對Hela細胞的毒性作用。

2.43-MA增強CPT誘導的Hela細胞凋亡不同藥物作用于Hela細胞后，Hela細胞的凋亡率不同。單獨使用3-MA或CPT作用于Hela細胞，細胞凋亡率為4.03%±0.70%、8.23%±2.00%，與對照組相比，無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。3-MA與CPT聯(lián)合作用Hela細胞(凋亡率為29.0%±5.10%)與單獨使用CPT或3-MA比較，細胞凋亡率明顯增高(圖3C、D)，提示3-MA增強CPT誘導的Hela細胞凋亡。

2.53-MA抑制自噬增強CPT誘導的Hela細胞凋亡蛋白表達CPT作用于Hela 細胞后，Hela 細胞內LC3Ⅱ蛋白水平增加，p62蛋白水平降低，提示CPT可誘導Hela細胞發(fā)生自噬，同前面結果一致。單獨3-MA或3-MA與CPT聯(lián)合作用于Hela 細胞與單獨CPT作用相比，LC3Ⅱ蛋白水平降低，p62表達增加(圖4)，說明加入3-MA可抑制細胞自噬。

CPT作用于Hela細胞后，總caspase-2蛋白水平降低，cleavage-PARP水平升高，提示CPT作用Hela細胞后可誘導凋亡信號的活化。3-MA與CPT聯(lián)合作用于Hela細胞較單獨CPT作用，cleavage-PARP水平明顯升高，總caspase-2水平降低(圖4)，結果提示3-MA抑制Hela細胞自噬可顯著增強CPT誘導的Hela細胞凋亡蛋白的表達。

圖2　CPT 誘導的Hela 細胞內LC3及p62的變化Fig.2　Changes of LC3 and p62 CPT-induced Hela cellsNote: A.Fluorescence images of LC3B expression in Hela cells(×40);B.Fluorescence images of p62 expression in Hela cells(×20);C.The expressions of LC3Ⅰand LC3Ⅱprotein in Hela cells.

圖3　3-MA聯(lián)合CPT對CPT誘導的細胞死亡的影響Fig.3　Effect of 3-MA in combination with CPT on CPT-induced cell deathNote: A.Morphological changes of Hela cells after treated with different drugs for 36 hours(×20)；B.The proliferation activity of Hela cells treated with different drugs at different time points；C.Morphological changes of Hela cells with nuclear staining after treated with different drugs for 16 hours(×20)；D.Hela cell apoptosis rates.

圖4　不同藥物作用的Hela細胞LC3、p62、PARP、caspase-2、α-tubulin蛋白表達Fig.4　Protein expressions of LC3,p62,PARP,caspase-2,and α-tubulin in Hela cells treated with different drugs

3　討論

在世界范圍內，宮頸癌是女性第4位常見的惡性腫瘤。約85%宮頸癌發(fā)生于發(fā)展中國家，并且在這些國家宮頸癌居癌癥死因的首位[6]?；熢趯m頸癌高危病例和晚期復發(fā)轉移患者的治療中是必不可缺的重要手段，然而宮頸癌細胞對化療藥物產(chǎn)生的耐藥性嚴重地影響了化療藥物的治療效果[2]。因此，尋找逆轉化療耐藥的新方法及靶向治療將為宮頸癌化療耐藥的處理提供新的視角。喜樹堿(CPT)是一種天然五環(huán)的喹啉生物堿，通過抑制DNA拓撲異構酶Ⅰ導致DNA雙鏈在復制時斷裂，從而引起細胞凋亡發(fā)揮其抗腫瘤作用。CPT及衍生物被用于多種腫瘤的治療，包括卵巢癌、宮頸癌、結直腸癌、腺癌、前列腺癌、乳腺癌、腦瘤[4,14]。本實驗以宮頸癌Hela細胞為細胞模型，用不同濃度CPT處理Hela細胞，MTT檢測結果顯示CPT對Hela細胞的毒性作用是時間和劑量依賴性的。

自噬是真核生物普遍存在的現(xiàn)象。在生理條件下，細胞的基礎自噬活性能清除細胞內老化、受損的生物大分子和細胞器等，以維持正常的細胞生物學功能，抑制細胞發(fā)生癌變。但在饑餓、能量缺乏、放化療等代謝應激狀態(tài)下，腫瘤細胞自噬水平升高，通過自噬降解老化的、受損的生物大分子和細胞器等，能獲得能量來源和重建的物質而有助于腫瘤細胞存活。自噬作為細胞對代謝應激壓力(低氧、輻射、營養(yǎng)缺乏等)的適應性反應，可能與腫瘤耐藥有關[7,8]，因此，適當調節(jié)自噬，如抑制腫瘤細胞的保護性自噬，可為腫瘤治療提供一種新的方案[9,10]。3-MA屬特異磷酸肌醇3磷酸激酶(PI3K)抑制劑，在自噬過程的早期階段通過抑制PI3K來阻斷自噬，PI3K的活性對于自噬體形成是必需的[11]。通過加入自噬抑制劑、敲除自噬相關基因抑制自噬可增強腫瘤細胞對多種細胞毒性藥物的敏感性。有研究報道3-MA可加強奧沙利鉑對結直腸癌的療效[12]；在人鼻咽癌及食管癌中，3-MA抑制自噬可增強癌細胞的內質網(wǎng)應激，增加體內外藥物及放療的效果[11,13]。因此，可見自噬對腫瘤細胞的生長具有保護作用，抑制自噬可增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。但也有與上述報道不一致的結果，如Hollomon等[14]研究發(fā)現(xiàn)，通過敲除自噬相關基因Atg5抑制自噬可減弱CPT誘導的骨肉瘤DLM8細胞的死亡作用；An[15]發(fā)現(xiàn)通過3-MA/敲除Beclin-1基因抑制自噬顯著減弱Mimulone(白花泡桐葉成分)誘導的肺癌A549細胞的凋亡，這與在肺癌A549細胞中，通過抑制腫瘤細胞的自噬增強5-氟尿嘧啶誘導的腫瘤細胞死亡相反[16]。因此，腫瘤細胞的自噬作用對腫瘤細胞的凋亡是促進作用還是抑制作用，可能依腫瘤細胞系及使用藥物不同而不同。本實驗中當3-MA與CPT聯(lián)合作用于Hela細胞后，Hela細胞的增殖活性明顯下降和凋亡增加，說明3-MA抑制自噬可增強CPT誘導的Hela細胞凋亡。

本實驗發(fā)現(xiàn)CPT在誘導Hela細胞凋亡的同時可誘導自噬現(xiàn)象的發(fā)生。哺乳動物細胞中微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)有三種，包括LC3A、LC3B和LC3C，它們在自噬過程存在相關的翻譯修飾。LC3蛋白首先在合成后立即在羧基端被Atg4剪切，產(chǎn)生胞漿型LC3-Ⅰ；在自噬過程中，LC3-Ⅰ會被泛素樣體系脂化，產(chǎn)生LC3-Ⅱ，并定位在自噬小體中，因此LC3-Ⅱ可作為反映自噬體形成的指標，但LC3-Ⅱ檢測須同氯喹/E64d抑制“自噬潮”相結合。p62為自噬活化過程中的一個調節(jié)分子，與多泛素化蛋白相互作用促進其聚合并靶向于自噬體，在自噬溶酶體中降解[17,18]。本實驗選用LC3B、p62作為評價自噬的指標，結果顯示CPT作用于Hela細胞可誘導自噬體形成，Hela細胞內LC3熒光強度及LC3-Ⅱ表達水平升高，p62則降低；CQ與CPT聯(lián)合作用于Hela細胞，Hela細胞內LC3熒光強度及LC3-Ⅱ蛋白表達顯著升高。

采用Western blot分析了3-MA抑制自噬對CPT誘導的Hela細胞凋亡蛋白表達的影響。結果顯示，加入3-MA可抑制Hela細胞自噬，LC3Ⅱ蛋白表達降低，p62表達增加；3-MA與CPT聯(lián)合作用于Hela細胞可增強凋亡蛋白的表達，cleavage-PARP蛋白水平顯著升高和總caspase-2蛋白的明顯降低。

總之，CPT可以誘導宮頸癌Hela細胞發(fā)生自噬，且自噬影響CPT對Hela細胞的增殖活性。利用3-MA抑制自噬可顯著增強CPT誘導的細胞凋亡。因此，3-MA聯(lián)合CPT可為臨床治療宮頸癌提供一種新的策略。

[1]Granados LAJ，Lopez JA.Multistep model of cervical cancer:participation of miRNAs and coding genes[J].Int J Mol Sci，2014，15(9)：15700-15733.

[2]劉紅，張國楠.宮頸癌化療耐藥相關問題[J].中國實用婦科與產(chǎn)科雜志，2015，31(3)：198-201.

[3]Sui X，Chen R，Wang Z,etal.Autophagy and chemotherapy resistance:a promising therapeutic target for cancer treatment[J].Cell Death Dis，2013，10(4)：1-11.

[4]Venditto VJ，Simanek EE.Cancer therapies utilizing the camptothecins：a review of the in vivo literature[J].Mol Pharm，2010，7(2)：307-349.

[5]任來峰，唐子執(zhí)，吳惠文，等.HCV NS3/4A基因外來表達對Huh7細胞凋亡及DNA損傷應答的影響[J].中國細胞生物學學報，2014，36(8)：1110-1115.

[6]周暉，盧淮武，彭永排，等.《2015年NCCN宮頸癌臨床實踐指南》解讀[J].中國實用婦科與產(chǎn)科雜志，2015，31(3)：185-191.

[7]Kung CP，Budina A， Balaburski G,etal.Autophagy in tumor suppression and cancer therapy[J].Crit Rev Eukaryot Gene Exp，2011， 21(1)：71-100.

[8]White E，DiPaola RS.The double-edged sword of autophagy modulation in cancer[J].Clin Cancer Res，2009，15(17)：5308-16.

[9]Li X，Xu HL，Liu YX，etal.Autophagy modulation as a target for anticancer drug discovery[J].Acta Pharmacol Sin，2013，34(5)： 612-624.

[10]Rubinsztein DC，Codogno P，Levine B.Autophagy modulation as a potential therapeutic target for diverse diseases[J].Nat Rev Drug Discov，2012，11(9)：709-730.

[11]Chen Y，Li X，Guo L，etal.Combining radiation with autophagy inhibition enhances suppression of tumor growth and angiogenesis in esophageal cancer[J].Mol Med Rep，2015，12(2)：1645-1652.

[12]Tan S，Peng X，Peng W，etal.Enhancement of oxaliplatin-induced cell apoptosis and tumor suppression by 3-methyladenine in colon cancer[J].Oncol Lett，2015，9(5)： 2056-2062.

[13]Song L，Liu H，Ma L，etal.Inhibition of autophagy by 3-MA enhances endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis in human nasopharyngeal carcinoma cells[J].Oncol Lett，2013，6(4)：1031-1038.

[14]Hollomon MG，Gordon N，Santiago-O′Farrill JM，etal.Knockdown of autophagy-related protein 5,ATG5,decreases oxidative stress and has an opposing effect on camptothecin-induced cytotoxicity in osteosarcoma cells[J].BMC Cancer，2013，13(1)：1-27.

[15]An HK，Kim KS，Lee JW，etal.Mimulone-induced autophagy through p53-mediated AMPK/mTOR pathway increases caspase-mediated apoptotic cell death in A549 human lung cancer cells[J].PLoS One，2014，9(12)：1-20.

[16]Pan X，Zhang X， Sun H，etal.Autophagy inhibition promotes 5-fluorouraci-induced apoptosis by stimulating ROS formation in human non-small cell lung cancer A549 cells[J].PLoS One，2013，8(2)：1-9.

[17]Klionsky DJ，Abdalla FC， Abeliovich H，etal.Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy[J].Autophagy， 2012，8(4)：445-544.

[18]Mizushima N，Yoshimori T，Levine B.Methods in mammalian autophagy research[J].Cell，2010，140(3)：313-326.

[收稿2016-03-28修回2016-05-11]

(編輯倪鵬)

·啟事·

本刊誠聘特約審稿人

《中國免疫學雜志》是中國免疫學會會刊,主要報道我國免疫學研究的各項國家科研課題,是全面反映中國免疫學整體水平的主流媒體。為了進一步加快審稿速度,縮短稿件刊用周期,特誠聘特約審稿人數(shù)名,組建審稿專家隊伍,詳情請登錄本刊網(wǎng)站,Web site:www.immune99.com;www.中國免疫學.中國。

《中國免疫學雜志》編輯部

Effect of 3-MA on camptothecin-induced cervical cancer Hela cell apoptosis

WANG Xiao-Na,REN Lai-Feng,ZHAO An-Jiang,YANG Wan-Xia,REN Yun-Qing.Fenyang College of Shanxi Medical University,Fenyang 032200,China

Objective:To explore the effect of autophagy inhibitor 3-methyladenine(3-MA) on camptothecin(CPT)-induced Hela cell apoptosis.Methods: MTT assays were carried out to determine the optimal concentration and time of CPT on Hela cells and the effect of different drugs on Hela cell proliferation activity.After Hela cells were treated with different drugs,the changes of autophagy marker protein(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3),p62 and apoptosis-related protein were detected using Western blot and immunofluorescence(IF).DAPI(nuclear) staining was used to observe cell apoptosis rate.Results: In CPC-treated Hela cells,Hela cell proliferation activity declined dramatically,and autophagy could be induced to occur.Compared with CPT group,the cell proliferation activity was lower in CPT combined with 3-MA group,the level of autophagy decreased,but the apoptosis rate significantly increased.Conclusion: CPT can induce autophagy while inducing Hela cell death.Hela cells chemosensitivity to CPT treatment can be enhanced by 3-MA inhibiting autophagy.

3-methyladenine;Camptothecin;Autophagy;Apoptosis;Hela cells

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.009

R737.33文獻標志碼A

1000-484X(2016)08-1128-05

王曉娜(1990年-)，女，在讀碩士，主要從事宮頸癌治療機制方面的研究，E-mail：18135845975@163.com。

及指導教師：任云青(1964年-)，女，教授，碩士生導師，主要從事生殖免疫、腫瘤免疫方面研究,E-mail:15535875200@163.com。