汪相如　陳蓉明　龔福生　應(yīng)敏剛　鄭秋紅

(福建醫(yī)科大學(xué)教學(xué)醫(yī)院福建省腫瘤醫(yī)院腫瘤分子研究室，生物治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州350014)

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HSP70-TKD誘導(dǎo)的NK細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞遷移的實(shí)驗(yàn)研究①

汪相如陳蓉明龔福生應(yīng)敏剛鄭秋紅

(福建醫(yī)科大學(xué)教學(xué)醫(yī)院福建省腫瘤醫(yī)院腫瘤分子研究室，生物治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州350014)

①本文為福建省醫(yī)學(xué)創(chuàng)新課題(2011-CX-17)。

目的：研究HSP70-TKD誘導(dǎo)的自然殺傷細(xì)胞(NK)體外對(duì)細(xì)胞表面HSP70表達(dá)不同的胰腺癌細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移作用差異。方法：用干細(xì)胞培養(yǎng)基富集人外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)至第10天加入2 μg/ml TKD，4 d后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)NK細(xì)胞表面殺傷性受體CD94/NKG2C的表達(dá)情況；應(yīng)用流式分選將胰腺癌細(xì)胞系Colo357和結(jié)腸癌細(xì)胞系CW2分為HSP70高表達(dá)細(xì)胞亞系Colo+、CW2+和HSP70低表達(dá)細(xì)胞亞系Colo-、CW2-；Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HSP70-TKD誘導(dǎo)的NK細(xì)胞對(duì)這4種細(xì)胞的遷移能力，MTT法檢測(cè)HSP70-TKD誘導(dǎo)的NK細(xì)胞對(duì)這4種細(xì)胞的殺傷活性。結(jié)果：流式結(jié)果顯示NK細(xì)胞在干細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)14天可大量增殖，細(xì)胞純度最高達(dá)(92.50 ±1.25)%； 經(jīng)HSP70-TKD誘導(dǎo)后，NK細(xì)胞表面殺傷性受體CD94/NKG2C的表達(dá)明顯增加；經(jīng)流式分選后，Colo+、Colo-細(xì)胞表面HSP70的表達(dá)分別為(78.2±2.2)%和(27.3±1.2)%,而CW2+、CW2-細(xì)胞表面HSP70的表達(dá)分別為(91.1±2.5)%和(18.2±1.0)%；HSP70-TKD誘導(dǎo)的NK細(xì)胞對(duì)Colo+遷移率為(68.6±2.8)%，明顯高于對(duì)Colo-的遷移率(22.8±1.5)%，NK細(xì)胞對(duì)CW+遷移率為(73.5±2.7)%，明顯高于對(duì)CW2-的遷移率(18.2±1.3)%；HSP70-TKD誘導(dǎo)的NK細(xì)胞對(duì)Colo+、Colo-的殺傷活性有顯著性差異，當(dāng)效靶比為20∶1時(shí)，殺傷活性分別為(61.2±3.0)%、(24.5 ±1.5)%， NK對(duì)CW2+、CW2-的殺傷活性有顯著性差異，當(dāng)效靶比為20∶1時(shí)，殺傷活性分別為(63.8±3.2)%、(22.4±1.8)%。結(jié)論：HSP70-TKD誘導(dǎo)的NK細(xì)胞是一種新型、高效的免疫活性細(xì)胞，在體外易向HSP70表達(dá)陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞遷移。

腫瘤細(xì)胞；HSP70-TKD;NK細(xì)胞；遷移

自然殺傷細(xì)胞(Natural killer cells,NK cells)是一群不同于T 、B 淋巴細(xì)胞的大顆粒淋巴細(xì)胞,分布于外周各淋巴器官及血液循環(huán)系統(tǒng),無(wú)需抗原的預(yù)先刺激與活化即可發(fā)揮細(xì)胞毒效應(yīng),并可分泌多種細(xì)胞因子及趨化因子。NK細(xì)胞不表達(dá)TCR或產(chǎn)生抗體，其細(xì)胞表達(dá)一系列活化性受體及抑制性受體,兩者間的平衡是控制NK 細(xì)胞是否被激活的重要機(jī)制，當(dāng)活化性受體與相應(yīng)的配體結(jié)合，細(xì)胞處于殺傷活化狀態(tài)，而當(dāng)抑制性受體與相應(yīng)的配體結(jié)合，細(xì)胞處于抑制狀態(tài)[1,2]。NK細(xì)胞表面的抑制性受體與自體細(xì)胞表達(dá)的MHCⅠ類分子結(jié)合，因此不會(huì)殺傷自體細(xì)胞，而可殺傷丟失MHCⅠ類分子的腫瘤細(xì)胞[3]。多種腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)HSP70,原發(fā)胰腺癌細(xì)胞有64%細(xì)胞表面表達(dá)HSP70,而相應(yīng)的正常組織卻不表達(dá)HSP70[4]。在體外，細(xì)胞表面表達(dá)的HSP70為NK細(xì)胞表面殺傷性受體CD94/NKG2C的配體，其中C末端的14個(gè)氨基酸序列TKDNNLLGRFELSG(TKD)是暴露在腫瘤的細(xì)胞外介質(zhì)中,是CD94/NKG2C與HSP70的結(jié)合位點(diǎn)[5,6]。本課題的前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HSP70-TKD誘導(dǎo)的NK細(xì)胞對(duì)胰腺癌細(xì)胞裸鼠移植瘤具有明顯的抑制作用，且NK細(xì)胞能浸潤(rùn)到HSP70高表達(dá)的胰腺組織。本文是從體外研究NK細(xì)胞對(duì)細(xì)胞表面HSP70表達(dá)不同的腫瘤細(xì)胞的遷移作用差異,從而探討這種遷移作用的機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑淋巴細(xì)胞分離液由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院研究所提供。干細(xì)胞培養(yǎng)基(Stem cell growth medium，SCGM)購(gòu)自德國(guó)CellGro 公司，IL-2 購(gòu)自上海華新公司，PHA購(gòu)自華美公司,鼠抗人CD3-FITC、CD56-PE、CD94-FITC、Anti-HSP-70/FITC(2 mg/ml) 購(gòu)自上海瑞齊生物科技有限公司，RPMI1640培養(yǎng)基、四甲基偶氮唑鹽(MTT)購(gòu)自Gibco公司,HSP70-TKD 由晶美公司合成，純度>95%，5 μm孔徑有基底膠Transwell小室購(gòu)自BD公司。

1.1.2細(xì)胞株人胰腺癌細(xì)胞Colo357和人結(jié)腸癌細(xì)胞CW2購(gòu)自上海細(xì)胞所。

1.2方法

1.2.1NK細(xì)胞的擴(kuò)增及表型分析采集健康人外周血10 ml，肝素抗凝，PBS 等倍稀釋后，用淋巴細(xì)胞分離液以密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，用SCGM(含5%人AB 血清及600 U/ml IL-2)調(diào)整PBMC 密度至1×106/ml，接種于6 孔板，2 ml /孔，加入500 ng/ml鼠抗人CD3 單抗和50 μg/ml PHA，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)3 d 后，3 000 r/min離心4 min(離心半徑10 cm)，洗去培養(yǎng)基中的鼠抗人CD3 單抗和PHA，再加入SCGM 繼續(xù)培養(yǎng)，每3天半量換液。細(xì)胞培養(yǎng)14 d 后用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞的表型特征，1×106個(gè)細(xì)胞加入10 μl CD3-FITC和CD56-PE，室溫暗處結(jié)合20 min后，PBS 洗滌2次，用500 ml 的PBS 懸浮細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD3/CD56 表達(dá)情況[7]。

1.2.2HSP70-TKD誘導(dǎo)NK細(xì)胞表面CD94/NKG2C的表達(dá)按照以上的方法培養(yǎng)NK細(xì)胞至第10天時(shí)，將細(xì)胞分成誘導(dǎo)組和未誘導(dǎo)組，誘導(dǎo)組加入100 U/ml IL-2和2 μg/ml TKD，未誘導(dǎo)組加入100 U/ml的IL-2，4 d后流式細(xì)胞儀檢測(cè)NK細(xì)胞表面CD94/NKG2C的表達(dá)，1×106個(gè)細(xì)胞分別加入10 μl CD94-FITC，室溫暗處結(jié)合20 min后，PBS 洗滌2 次，用500 ml的PBS 懸浮細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD94/NKG2C 表達(dá)情況。

1.2.3流式細(xì)胞分選HSP70陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞處于對(duì)數(shù)期的人胰腺癌細(xì)胞Colo357和人結(jié)腸癌細(xì)胞CW2經(jīng)胰酶消化，PBS洗滌2次，用PBS將細(xì)胞的濃度調(diào)到107個(gè)/ml，取500 μl的細(xì)胞懸液加入50 μl的Anti-HSP-70/FITC，靜置4 ℃冰箱，避光，孵育30 min，PBS洗滌2次,通過(guò)細(xì)胞濾網(wǎng)后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)并分選HSP70+和HSP70-細(xì)胞群,流式分選陽(yáng)性的HSP70+和HSP70-細(xì)胞后進(jìn)行回測(cè)，檢測(cè)HSP70+的百分比。

1.2.4Transwell小室檢測(cè)NK細(xì)胞對(duì)HSP70+和HSP70-細(xì)胞群的遷移能力將孔徑為5 μm的基底膠Transwell小室放入24孔培養(yǎng)板中，上室加入300 μl預(yù)溫的無(wú)血清培養(yǎng)基， 室溫下靜置15～30 min，使基質(zhì)膠水化，再吸去剩余培養(yǎng)液。分別將2×105個(gè)細(xì)胞表面HSP70表達(dá)陽(yáng)性的Colo+、CW2+和細(xì)胞表面HSP70表達(dá)陰性的Colo-、CW2-細(xì)胞懸浮在600 μl含10%血清的1640培養(yǎng)基中，接種在Transwell小室的下室中，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。將2×106個(gè)經(jīng)HSP70-TKD誘導(dǎo)的NK細(xì)胞懸浮在1 ml的培養(yǎng)基，在Transwell小室上室中加入100 μl的NK細(xì)胞懸液，于5%CO2培養(yǎng)箱與下室的腫瘤細(xì)胞共同孵育，4 h后收集下室的細(xì)胞，加入PBS至100 μl，100 μl未加入小室的NK細(xì)胞和所收集100 μl下室的細(xì)胞加入1 μl CD56-PE和 CD94-FITC，室溫暗處結(jié)合20 min后，PBS 洗滌2次，用100μl PBS 懸浮細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD56+CD94+的細(xì)胞數(shù),NK細(xì)胞遷移率=下室CD56+CD94+細(xì)胞數(shù)/加樣的CD56+CD94+細(xì)胞數(shù)[8，9]。

1.2.5NK細(xì)胞對(duì)細(xì)胞表面HSP70+和HSP70-的腫瘤細(xì)胞的殺傷以上述方法培養(yǎng)NK 細(xì)胞到10d時(shí)， 加入100 U/ml IL-2和2 μg/ml TKD，誘導(dǎo)4 d后的細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，以Colo+、Colo-、CW2+、CW2-細(xì)胞為靶細(xì)胞(效靶比分別為5∶1、10∶1、20∶1、40∶1)，同時(shí)設(shè)靶細(xì)胞組、效應(yīng)細(xì)胞組和RPMI1640 空白對(duì)照組，37℃、5% CO2培養(yǎng)12 h。然后每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)，繼續(xù)孵育4 h，每孔加DMSO 100 μl，吹打，混勻，用酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm 波長(zhǎng)處光密度(A)值，計(jì)算其殺傷率。

2　結(jié)果

2.1NK細(xì)胞的擴(kuò)增及表型分析從10例志愿獻(xiàn)血者外周血單個(gè)核細(xì)胞中富集、擴(kuò)增NK細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD3-CD56+NK細(xì)胞的純度，結(jié)果表明，按照1.2.1的實(shí)驗(yàn)方法， NK細(xì)胞能明顯擴(kuò)增，NK細(xì)胞平均擴(kuò)增950倍，擴(kuò)增后CD3-CD56+NK細(xì)胞的百分比率最高值為(92.50 ±1.25)%,最低值為(78.36±0.82)%,取純度的最高NK細(xì)胞作為以下各個(gè)實(shí)驗(yàn)用的細(xì)胞。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2HSP70-TKD誘導(dǎo)NK細(xì)胞表面CD94/NKG2C的表達(dá)當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至第10天時(shí)，加入100 U/ml IL-2 和2 μg/ml TKD，經(jīng)HSP70-TKD誘導(dǎo)后，NK細(xì)胞細(xì)胞表面殺傷性受體CD94/NKG2C的表達(dá)量顯著明顯增加，較IL-2組和TKD組分別增加(223.45±7.56)%和(205.33±4.80)%，結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.3流式細(xì)胞分選HSP70陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞人胰腺癌細(xì)胞Colo357和人結(jié)腸癌細(xì)胞CW2經(jīng)流式分選后得到HSP70高表達(dá)的細(xì)胞株Colo+、CW2+和低表達(dá)的細(xì)胞株Colo-、CW2-，流式細(xì)胞儀回測(cè)各個(gè)細(xì)胞群的細(xì)胞表面HSP70的表達(dá)，結(jié)果見(jiàn)圖2和圖3，Colo+、Colo-細(xì)胞表面HSP70的表達(dá)分別為(78.2±2.2)%和(27.3±1.2)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而CW2+、CW2-細(xì)胞表面HSP的表達(dá)分別為(91.1±2.5)%和(18.2±1.0)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1　健康人外周血NK細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)及細(xì)胞純度Tab.1　Amplification times and percentage of NK cell from PBMC in blood donor

圖1　HSP70-TKD誘導(dǎo)的NK細(xì)胞CD94/NKG2C的表達(dá)Fig.1　CD94/NKG2C expression levels on NK cells induced with HSP70-TKDNote: *.P<0.05 vs IL-2 group and TKD group.

圖2　流式分選人胰腺癌細(xì)胞HSP70表達(dá)不同的細(xì)胞Fig.2　Cell line Colo357 was separated into Colo+ and Colo- with different HSP70 expressionNote: *.P<0.05 vs Colo- group.

圖3　流式分選人結(jié)腸癌細(xì)胞CW2細(xì)胞表面HSP0表達(dá)不同的細(xì)胞群Fig.3　Cell line CW2 was separated into CW2+ and CW2-with different HSP70 expressionNote: *.P<0.05，vs CW2- group.

圖4　NK細(xì)胞向HSP70表達(dá)不同的胰腺癌細(xì)胞群遷移Fig.4　NK cell migrate to human pancreatic cell line with different HSP70 expressionNote: *.P<0.05，vs Colo- group.

圖5　NK細(xì)胞向HSP70表達(dá)不同的結(jié)腸癌細(xì)胞群遷移Fig.5　NK Cell migrate to human colon carcinoma cell line with different HSP70 expressionNote: *.P<0.05，vs CW2-group.

表2　HSP70-TKD誘導(dǎo)的NK細(xì)胞對(duì)HSP表達(dá)不同的腫瘤細(xì)胞的殺傷(%)Tab.2　Cytolytic activity against tumor cells with different HSP70 expression by NK cells induced by HSP70-TKD(%)

2.4Transwell小室檢測(cè)HSP70-TKD誘導(dǎo)的NK細(xì)胞對(duì)HSP70+和HSP70-細(xì)胞群的遷移能力Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4和圖5，NK細(xì)胞對(duì)Colo+、Colo-的遷移率分別為(68.6±2.8)%、(22.8±1.5)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，對(duì)CW2+、CW2-的遷移率分別為(73.5±2.7)%、(18.2±1.3)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.5HSP70-TKD誘導(dǎo)的NK細(xì)胞對(duì)胰腺癌細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞的殺傷以誘導(dǎo)4 d后的NK細(xì)胞效應(yīng)細(xì)胞，以Colo+、Colo-CW2+、CW2-細(xì)胞為靶細(xì)胞(效靶比分別為5∶1、10∶1、20：1、40∶1),結(jié)果見(jiàn)表2,結(jié)果表明，NK細(xì)胞在IL-2和TKD同時(shí)作用下，其對(duì)胰腺癌細(xì)胞Colo+的殺傷明顯高于對(duì)Colo-的殺傷作用。結(jié)果見(jiàn)表2，當(dāng)效靶比為10∶1其殺傷率已達(dá)到(50.5±2.5)%，明顯高于Colo-組細(xì)胞的(22.5±1.2)%,當(dāng)效靶比為40∶1時(shí)Colo+組殺傷率高達(dá)到(71.6±3.2)%，明顯高于Colo-組細(xì)胞的(32.0±2.3)%， NK細(xì)胞對(duì)胰腺癌Colo+細(xì)胞和Colo-胞的殺傷率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。NK細(xì)胞對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞CW2+的殺傷明顯高于對(duì)CW2-殺傷作用,當(dāng)效靶比為40∶1時(shí)CW2+組殺傷率高達(dá)到(73.2±3.5)%，明顯高于CW2-組細(xì)胞的(30.5±2.2)%， NK細(xì)胞對(duì)結(jié)腸癌CW2+細(xì)胞和CW2-細(xì)胞的殺傷率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3　討論

自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)是免疫系統(tǒng)中非常重要的一類細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞，是免疫系統(tǒng)中的第一道防線。NK細(xì)胞是一群特殊的細(xì)胞，它不同于獲得性免疫在發(fā)揮功能的時(shí)候是需要抗體和主要組織相容性復(fù)合體(MHC)。在哺乳類動(dòng)物受到病毒感染或者腫瘤侵襲的時(shí)候，NK細(xì)胞會(huì)非常迅速地產(chǎn)生反應(yīng)。NK細(xì)胞表面表達(dá)多種抑制受體和活化受體，通過(guò)這兩類受體的平衡來(lái)調(diào)控NK細(xì)胞的功能。正常情況下，抑制受體通過(guò)與自身MHCⅠ類分子結(jié)合抑制NK細(xì)胞的活性，產(chǎn)生自身耐受；當(dāng)有異源刺激時(shí)，活化受體與配體結(jié)合，產(chǎn)生激活信號(hào)，并下調(diào)NK細(xì)胞表面抑制受體的表達(dá)，使NK細(xì)胞活化[10，11]。某些腫瘤細(xì)胞表面特異性表達(dá)HSP70，而腫瘤細(xì)胞表面的HSP70能夠被NK 細(xì)胞表面活化型CD94 /NKG2C 受體所識(shí)別而誘導(dǎo)NK 細(xì)胞的殺傷活性。TKD 是HSP70 的表面抗原決定位， 與全長(zhǎng)HSP70 一樣能夠激活NK 細(xì)胞殺傷細(xì)胞膜HSP70 表達(dá)陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞[12]。NK細(xì)胞的遷徙不依賴于細(xì)胞與細(xì)胞之間的接觸，在體外NK細(xì)胞的遷徙是由可溶性的細(xì)胞因子和趨化因子如TNF-α、 IL-2等誘導(dǎo)的。用TKD 和低劑量的IL-2直接誘導(dǎo)外周血單核細(xì)胞，誘導(dǎo)后NK細(xì)胞表面的殺傷性受體CD94/NKG2C表達(dá)顯著增加。本項(xiàng)目的前期研究表明CD94+的NK細(xì)胞能明顯抑制HSP70陽(yáng)性的胰腺癌移植瘤且腫瘤組織有大量的NK細(xì)胞浸潤(rùn)，說(shuō)明CD94+的NK細(xì)胞與HSP70和HSP70-TKD存在著相互作用。本研究Transwell小室實(shí)驗(yàn)表明腫瘤細(xì)胞分泌的可溶性因子HSP70相關(guān)的多肽(包括TKD)是NK細(xì)胞向HSP70陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞遷徙的誘導(dǎo)因素，CD94+的NK細(xì)胞能識(shí)別HSP70陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞并向它浸潤(rùn)。在NK細(xì)胞的胞漿里有很多溶細(xì)胞顆粒，當(dāng)NK細(xì)胞活化時(shí)，會(huì)釋放穿孔素(Perforin)和顆粒酶(Granzyme)等溶細(xì)胞蛋白，從而殺傷靶細(xì)胞。因此NK細(xì)胞在HSP70-TKD誘導(dǎo)下，其對(duì)細(xì)胞HSP70陽(yáng)性腫瘤的殺傷活性明顯增加。 在熱療和化療的過(guò)程中必然會(huì)使腫瘤細(xì)胞表面的HSP70表達(dá)增加，其對(duì)HSP70-TKD 誘導(dǎo)NK 細(xì)胞的敏感性也隨之增強(qiáng)。因此，腫瘤患者如果在化療和熱療同時(shí)配合HSP70-TKD 誘導(dǎo)的NK細(xì)胞進(jìn)行綜合治療可提高療效。

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[收稿2015-10-26修回2016-04-07]

(編輯許四平)

·啟事·

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《中國(guó)免疫學(xué)雜志》編輯部

Experimental study of HSP70-TKD induced NK cells migrated toward tumor cells

WANG Xiang-Ru，CHEN Rong-Ming，GONG Fu-Sheng，YING Min-Gang， ZHENG Qiu-Hong.Department of Tumor Molecular Biology，F(xiàn)ujian Tumor Research Institute，F(xiàn)ujian Provincial Cancer Hospital，Teaching Hospital of Fujian Medical Unniversity,the Key Laboratory of Biotherapy,Fuzhou 350014，China

Objective:To investigate the Migration ability toward human pancreatic carcinoma cell line and human colon carcinoma cell line with difference HSP70 plasma membrane expression.Methods: CD3-CD56+NK cells were obtained from human peripheral blood mononuclear(PBMC)in stem cell growth medium SCGM，2 μg/ml TKD was added to the medium on 10th day,the activating receptor CD94/NKG2C expression levels on NK cells was detected with FAC after 4 days.The human pancreatic carcinoma cell line Colo357 and the human colon carcinoma cell line CW2 were separated into Colo+and CW2+with high HSP70 expression and Colo-and CW2-with low HSP70 expression;Migration assays of NK to the four difference cell lines were performed in a Transwell cell culture system.The cytolytic activity of TKD-activated NK cells against the four subline with HSP70 expression on their cell surface was analyzed by MTT assay.Results: Flow cytometry analysis showed that CD3-CD56+NK cells could expanded after 2 weeks in SCGM medium,and the largest percentage of NK cell was (92.50 ±1.25)%.CD94 expression levels on NK cells increased obviously after TKD inducement the cell surface HSP70 expression of Colo+,Colo-were (78.2±2.2)% and (27.3±1.2)% separately,the cell surface HSP70 expression of CW2+，CW2-were (91.1±2.5)% and (18.2±1.0)% separately after FACS;the Migration of NK cells toward Colo+was (68.6±2.8)%,higher than the migration toward Colo-with (22.8±1.5)%;the Migration of NK cells toward CW2+was(73.5±2.7)%,higher than the migration toward CW2-with (18.2±1.3)%;the cytolytic activity of NK against Colo+was(61.2±3.0)% compared to (24.5 ±1.5)% against Colo-when the ratio of effector cells and target cell was 20∶1,the cytolytic activity of NK against CW2+was (63.8±3.2)% compared to (22.4±1.8)% against CW2-when the ratio of effector cells and target cell was 20∶1.Conclusion: TKD-activated NK cells are highly efficient cytolytic effector cells which have stronger significant migration toward HSP70-positive tumor target cells on their cell surface in vitro .

Tumor cells;HSP70-TKD;NK cells;Migration

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.008

R392.12文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

1000-484X(2016)08-1123-05

汪相如(1971年-)，男，主管技師，主要從事腫瘤免疫學(xué)的研究。

及指導(dǎo)教師：鄭秋紅(1962年-)，女，主任醫(yī)師，主要從事腫瘤免疫治療的研究，E-mail:zqh2858@foxmail.com。