薛衛(wèi)林　周兆山　王燕青　吉中強(qiáng)　張小燕　梁文華

(山東省青島市海慈醫(yī)療集團(tuán)肺病科，青島266033)

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ADAM33基因rs2280090，rs487377，rs2787094多態(tài)性與哮喘的相關(guān)性研究①

薛衛(wèi)林周兆山王燕青吉中強(qiáng)②張小燕③梁文華④

(山東省青島市海慈醫(yī)療集團(tuán)肺病科，青島266033)

①本文受國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30873315)及山東省2015-2016年度中醫(yī)藥科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(No.2015-354)資助。

②山東省青島市海慈醫(yī)療集團(tuán)心內(nèi)科，青島266033。

③生物芯片國(guó)家工程研究中心，上海201203。

目的：探討ADAM33基因多態(tài)性與青島地區(qū)漢族成人哮喘的相關(guān)性。方法：采用SNaPshot方法檢測(cè)研究對(duì)象ADAM33基因rs2280090、rs487377、rs2787094共3個(gè)位點(diǎn)的基因多態(tài)性。結(jié)果：rs2280090、rs487377和rs2787094基因型頻率在哮喘組與對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論：ADAM33基因rs2280090、rs487377和rs2787094多態(tài)性與青島地區(qū)漢族成人哮喘無相關(guān)關(guān)系。

哮喘；ADAM33基因；單核苷酸多態(tài)性；關(guān)聯(lián)研究

支氣管哮喘是一種復(fù)雜的多基因遺傳病，到目前為止已發(fā)現(xiàn)在20余個(gè)染色體區(qū)域有數(shù)百個(gè)相關(guān)基因與哮喘的相關(guān)表型及發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，其中位于20號(hào)染色體的解整合素-金屬蛋白酶33基因受到廣泛關(guān)注，2002年Van Eerdewegh等[1]首次報(bào)道了ADAM33基因與氣道高反應(yīng)性和哮喘密切相關(guān)，近年來成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。結(jié)合文獻(xiàn)我們選擇ADAM33基因的rs2280090、rs487377、rs2787094共3個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，探討青島地區(qū)成人中該基因多態(tài)性與哮喘的相關(guān)性，以期進(jìn)一步揭示哮喘的遺傳學(xué)發(fā)病機(jī)制。

1　對(duì)象與方法

1.1對(duì)象及分組共分2個(gè)組：哮喘組400例，對(duì)照組(正常人)200例，總共600例，年齡均在18～65歲之間，其中哮喘組男112例，女288例，平均年齡49.7歲，正常對(duì)照組200例，男74例，女126例，平均年齡39.5歲。哮喘組來自醫(yī)院門診和住院的哮喘患者，全部病例符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)哮喘學(xué)組2008年修訂的《支氣管哮喘防治指南》支氣管哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]，除外合并有心血管、肝、腎、內(nèi)分泌或造血系統(tǒng)等嚴(yán)重原發(fā)性疾病及精神病患者。對(duì)照組來自健康查體人群，無哮喘病史、無家庭及個(gè)人過敏史。

1.2方法

1.2.1血標(biāo)本采集與DNA制備抽取每名研究對(duì)象靜脈血2 ml，注入EDTA抗凝管中，采用少量?jī)鲅焖俜?氯仿法抽提DNA，樣品于-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2位點(diǎn)選擇和引物設(shè)計(jì)通過3種方法選擇ADAM33基因的多態(tài)位點(diǎn)：(1)文獻(xiàn)中報(bào)道過的位點(diǎn);(2)位于基因編碼區(qū)且引起氨基酸改變的SNP，以及位于基因上游調(diào)控區(qū)的SNP;(3)搜索數(shù)據(jù)庫中該基因上tagSNP，選出rs2280090、rs487377、rs2787094共3個(gè)位點(diǎn)，根據(jù)基因的目標(biāo)序列和所選擇的多態(tài)性位點(diǎn)，經(jīng)在線Primer3 軟件(http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3.www.cgi)設(shè)計(jì)多重PCR引物序列，由上海復(fù)旦-天昊遺傳分析平臺(tái)負(fù)責(zé)引物合成。

1.2.3基因分析

1.2.3.1采用SNaPshot方法[3](1)擴(kuò)增目的基因片段：將適量基因組DNA按一定順序分別加至384孔板，再添加PCR擴(kuò)增體系使反應(yīng)物的終濃度如下：Taq聚合酶1 U，基因組DNA 5 ng，PCR引物各1 μmol，dNTP 0.3 mmol。PCR反應(yīng)條件為：95℃2 min;94℃20 s,60℃ 40 s，72℃1.5 min共11個(gè)循環(huán)； 94℃ 20 s， 59℃ 30 s，72℃ 1.5 min共24個(gè)循環(huán)；72℃ 2 min。(2)PCR產(chǎn)物純化：在10 μl PCR產(chǎn)物中加入1 U 蝦堿酶(SAP)和1 U外切酶Ⅰ(Exonuclease Ⅰ)，37 ℃溫浴60 min,然后75℃滅活15 min。(3)單堿基延伸：延伸反應(yīng)體系(10 μl)包括5 μl SNaPshot Multiplex Kit,2 μl 純化后多重PCR產(chǎn)物，1 μl 延伸引物混合物，2 μl 超純水。PCR反應(yīng)條件為：96℃ 1 min;96℃ 10 s，52℃ 5 s，60℃ 30 s共28個(gè)循環(huán)。(4)延伸產(chǎn)物純化：在10 μl 延伸產(chǎn)物中加入1 U SAP酶，37℃溫浴60 min，然后75℃滅活15 min。(5)脫鹽、上機(jī)、基因分型：取延伸產(chǎn)物2 μl 用SAP酶純化后在ABI3130xl測(cè)序儀上樣，采用GeneMapper4.0對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，獲得基因分型報(bào)告。

1.2.3.2膠電泳及SNP分型峰形圖(見圖1～3)NG代表正常對(duì)照組，BG代表哮喘組，橙色峰為SIZE STANDARD,藍(lán)色、綠色、紅色、黑色峰分別代表延伸加入ddGTP、ddATP、ddTTP和ddCTP的延伸產(chǎn)物，峰下面標(biāo)注的等位基因(如果用的延伸引物是正向的，則跟延伸加入的堿基一致，如果是反向的，則跟延伸加入的堿基互補(bǔ))。其中橫軸表示等位基因長(zhǎng)度，即通過SNP反應(yīng)延伸引物的長(zhǎng)度來區(qū)分多重體系每個(gè)位點(diǎn)基因型的位置；縱軸表示每個(gè)延伸反應(yīng)熒光信號(hào)的強(qiáng)度。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析根據(jù)每個(gè)SNP位點(diǎn)的基因分布計(jì)算其基因型和等位基因頻率，用精確檢驗(yàn)確認(rèn)其是否符合Hardy-Weinberg平衡定律，哮喘組和對(duì)照組基因型頻率的比較，其相對(duì)危險(xiǎn)度以優(yōu)勢(shì)比(OR)及95%可信區(qū)間(95%CI)表示，運(yùn)用邏輯回歸法檢驗(yàn)并校正性別和年齡的影響，計(jì)算OR和95%CI，遺傳模型分別為Dominant(顯性)、Recessive(隱性)和Log-additive(疊加作用)共3種，所有的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙側(cè)概率檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，統(tǒng)計(jì)軟件為SPSS19.0。

圖1　rs2280090Fig.1　rs2280090Note: A.Sample BG21,genotype TT;B.Sample NG92,genotype CC;C.Sample BG104,genotype CT.alC，alTs stand for allele.

圖2　rs487377Fig.2　rs487377Note: A.Sample NG67,genotype AA;B.Sample BG114,genotype GG;C.Sample BG404,genotype GA.alA,alG stand for allele.

圖3　rs2787094Fig.3　rs2787094Note: A.Sample BG141,genotype GG；B.Sample NG95,genotype CC；C.Sample NG78,genotype GC.alG,alC stand for allele.

2　結(jié)果

2.1引物設(shè)計(jì)結(jié)果針對(duì)ADAM33基因共3個(gè)SNP位點(diǎn)的DNA序列，設(shè)計(jì)各個(gè)位點(diǎn)的多重PCR特異性擴(kuò)增引物和單堿基延伸引物，引物序列見表1。

2.2基因多態(tài)性分析

2.2.1哮喘組與對(duì)照組基因型和等位基因頻率在校正性別和年齡的影響后，經(jīng)精確檢驗(yàn)，哮喘組與健康對(duì)照組其ADAM33基因3個(gè)SNP基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)，表明其基因頻率已達(dá)到遺傳平衡。

2.2.2SNP單位點(diǎn)與哮喘的相關(guān)性分析運(yùn)用邏輯回歸法校正性別和年齡的影響后，計(jì)算基因型頻率的OR和95%CI，結(jié)果顯示，基因型頻率在哮喘組與對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2～4。

表1　ADAM33基因3個(gè)SNPs的PCR特異性擴(kuò)增引物和單堿基延伸引物Tab.1　Specific PCR amplification primer and single base extension primer for 3 SNPs of ADAM33

表2　rs2280090的基因型頻率在對(duì)照組和哮喘組的分布Tab.2　Distribution of genotype frequency of rs2280090 in control group and asthma group

表3　rs487377的基因型頻率在對(duì)照組和哮喘組的分布Tab.3　Distribution of genotype frequency of rs487377 in control group and asthma group

表4　rs2787094的基因型頻率在對(duì)照組和哮喘組的分布Tab.4　Distribution of genotype frequency of rs2797094 in control group and asthma group

3　討論

解整合素-金屬蛋白酶33(A disintegrin and metalloprotease 33，ADAM 33)基因是2002年首個(gè)通過定位克隆發(fā)現(xiàn)的哮喘易感性基因，ADAM基因編碼鋅指依賴性金屬蛋白酶，所有的ADAM家族成員都屬于Ⅰ型跨膜蛋白[4]。最近克隆的人類ADAM33(hADAM33)基因[5]定位于20號(hào)染色體短臂(20p13)，跨度約14 kb，包含22個(gè)外顯子和21個(gè)內(nèi)含子，編碼的蛋白質(zhì)包含813個(gè)氨基酸，其結(jié)構(gòu)類似于ADAM家族其他成員，由8個(gè)結(jié)構(gòu)域組成。

自從ADAM33基因被確定為哮喘的易感基因后，探討該基因在不同種族和不同地域中與哮喘的相關(guān)性成為國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)。

Howard等[6]的研究表明，對(duì)于四個(gè)種族人群[包括美國(guó)黑人、美國(guó)白人(除西班牙和丹麥籍外)、美國(guó)的西班牙籍人和丹麥籍白人]，ADAM33基因上8個(gè)SNPs(包括S1,S2,ST + 4,ST +7,T1,T2,V21和V4)在每一人群中至少有一種SNP與哮喘相關(guān)，但沒有一種是四種人群共有的與哮喘相關(guān)的SNP。 Hirota等[7]采用PCR直接測(cè)序的方法鑒定了日本人群ADAM33基因上48個(gè)SNP，證實(shí)T1(Met764Thr),T2(Pro774Ser),S2和V-3與哮喘有關(guān)。Vergara等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，哥倫比亞人群ADAM33基因ST+7與哮喘有相關(guān)性，H4(GCAGGG)與家系中的哮喘有關(guān)，V4、T2與血液中IgE水平相關(guān)。2011年Awasthi等[9]采用PCR-RELP方法對(duì)印度兒童ADAM33基因上的5個(gè)位點(diǎn)(F+1,S2,ST+4,ST+5和V4)進(jìn)行多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)S2,ST+5位點(diǎn)與哮喘危險(xiǎn)性有關(guān)，而F+1、ST+4位點(diǎn)突變純合子基因型和突變等位基因與哮喘危險(xiǎn)性增加有關(guān)，單體型AGCCT、GGACT和AGCCC呈正相關(guān)，單體型ACAGT、AGCGC、AGCGT、GCAGC和GCCGT呈保護(hù)性相關(guān)。因此，認(rèn)為ADAM33基因多態(tài)性與印度兒童哮喘相關(guān)。

國(guó)內(nèi)Su等[10]對(duì)中國(guó)漢族人群 ADAM33基因V4、 T+1、T2、T1、S1、Q-1的多態(tài)性與哮喘的關(guān)系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)V4、T+1和T1與漢族人群哮喘有關(guān)。此外，針對(duì)南方漢族人群，國(guó)內(nèi)邱玉明等[11]研究發(fā)現(xiàn)ADAM33基因Met764Thr位點(diǎn)多態(tài)性與哮喘存在相關(guān)性，而另一項(xiàng)研究表明北方漢族該基因多態(tài)性與哮喘無相關(guān)[12]。因此，在不同人種中，ADAM33基因多態(tài)性的類型和頻率、生物學(xué)功能及其與哮喘的關(guān)系，均可能有所差異。Ober等[13]認(rèn)為人種不同，突變等位基因分布頻率不同，與哮喘、過敏癥的相關(guān)關(guān)系就可以不同；研究方法不同，入選病例標(biāo)準(zhǔn)不同，所得的結(jié)論也可不同。

我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)： ADAM33基因rs22800 90、rs487377和rs2787094的基因多態(tài)性與青島地區(qū)漢族成人哮喘無相關(guān)關(guān)系。

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[收稿2015-10-24修回2015-11-19]

(編輯張曉舟)

Association between ADAM33 polymorphisms and susceptibility of asthma

XUE Wei-Lin,ZHOU Zhao-Shan,WANG Yan-Qing,JI Zhong-Qiang,ZHANG Xiao-Yan，LIANG Wen-Hua.Department of Cardiology,Qingdao Hiser Medical Center,Qingdao 266033,China

Objective:To investigate the relationship between ADAM33 polymorphisms and susceptibility of asthma of Chinese in Qingdao.Methods: The polymorphism of ADAM33 gene,they were rs2280090，rs487377 and rs2787094,were detected with SnaPshot method.Results: There was no significant difference between asthma group and control group in genotypic frequencies.Conclusion: The study shows that the rs2280090，rs487377 and rs2787094 were not associated with susceptibility of asthma in Han nationality in Qingdao.

Asthma；ADAM33；Single nucleotide polymorphisms；Association analyses

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.003

R392文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

1000-484X(2016)08-1099-04

④，E-mail:at_mountain@163.com。

薛衛(wèi)林(1964年-)，男，主任醫(yī)師，主要從事哮喘臨床研究，E-mail:drxw101@136.com。