薛衛(wèi)林　周兆山　王燕青　吉中強　張小燕　梁文華

(山東省青島市海慈醫(yī)療集團肺病科，青島266033)

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ADAM33基因rs2280090，rs487377，rs2787094多態(tài)性與哮喘的相關性研究①

薛衛(wèi)林周兆山王燕青吉中強②張小燕③梁文華④

(山東省青島市海慈醫(yī)療集團肺病科，青島266033)

①本文受國家自然科學基金資助項目(No.30873315)及山東省2015-2016年度中醫(yī)藥科技發(fā)展計劃項目(No.2015-354)資助。

②山東省青島市海慈醫(yī)療集團心內科，青島266033。

③生物芯片國家工程研究中心，上海201203。

目的：探討ADAM33基因多態(tài)性與青島地區(qū)漢族成人哮喘的相關性。方法：采用SNaPshot方法檢測研究對象ADAM33基因rs2280090、rs487377、rs2787094共3個位點的基因多態(tài)性。結果：rs2280090、rs487377和rs2787094基因型頻率在哮喘組與對照組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論：ADAM33基因rs2280090、rs487377和rs2787094多態(tài)性與青島地區(qū)漢族成人哮喘無相關關系。

哮喘；ADAM33基因；單核苷酸多態(tài)性；關聯(lián)研究

支氣管哮喘是一種復雜的多基因遺傳病，到目前為止已發(fā)現在20余個染色體區(qū)域有數百個相關基因與哮喘的相關表型及發(fā)病風險有關，其中位于20號染色體的解整合素-金屬蛋白酶33基因受到廣泛關注，2002年Van Eerdewegh等[1]首次報道了ADAM33基因與氣道高反應性和哮喘密切相關，近年來成為國內外學者研究的熱點。結合文獻我們選擇ADAM33基因的rs2280090、rs487377、rs2787094共3個多態(tài)位點，探討青島地區(qū)成人中該基因多態(tài)性與哮喘的相關性，以期進一步揭示哮喘的遺傳學發(fā)病機制。

1　對象與方法

1.1對象及分組共分2個組：哮喘組400例，對照組(正常人)200例，總共600例，年齡均在18～65歲之間，其中哮喘組男112例，女288例，平均年齡49.7歲，正常對照組200例，男74例，女126例，平均年齡39.5歲。哮喘組來自醫(yī)院門診和住院的哮喘患者，全部病例符合中華醫(yī)學會呼吸病學分會哮喘學組2008年修訂的《支氣管哮喘防治指南》支氣管哮喘診斷標準[2]，除外合并有心血管、肝、腎、內分泌或造血系統(tǒng)等嚴重原發(fā)性疾病及精神病患者。對照組來自健康查體人群，無哮喘病史、無家庭及個人過敏史。

1.2方法

1.2.1血標本采集與DNA制備抽取每名研究對象靜脈血2 ml，注入EDTA抗凝管中，采用少量凍血快速酚-氯仿法抽提DNA，樣品于-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2位點選擇和引物設計通過3種方法選擇ADAM33基因的多態(tài)位點：(1)文獻中報道過的位點;(2)位于基因編碼區(qū)且引起氨基酸改變的SNP，以及位于基因上游調控區(qū)的SNP;(3)搜索數據庫中該基因上tagSNP，選出rs2280090、rs487377、rs2787094共3個位點，根據基因的目標序列和所選擇的多態(tài)性位點，經在線Primer3 軟件(http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3.www.cgi)設計多重PCR引物序列，由上海復旦-天昊遺傳分析平臺負責引物合成。

1.2.3基因分析

1.2.3.1采用SNaPshot方法[3](1)擴增目的基因片段：將適量基因組DNA按一定順序分別加至384孔板，再添加PCR擴增體系使反應物的終濃度如下：Taq聚合酶1 U，基因組DNA 5 ng，PCR引物各1 μmol，dNTP 0.3 mmol。PCR反應條件為：95℃2 min;94℃20 s,60℃ 40 s，72℃1.5 min共11個循環(huán)； 94℃ 20 s， 59℃ 30 s，72℃ 1.5 min共24個循環(huán)；72℃ 2 min。(2)PCR產物純化：在10 μl PCR產物中加入1 U 蝦堿酶(SAP)和1 U外切酶Ⅰ(Exonuclease Ⅰ)，37 ℃溫浴60 min,然后75℃滅活15 min。(3)單堿基延伸：延伸反應體系(10 μl)包括5 μl SNaPshot Multiplex Kit,2 μl 純化后多重PCR產物，1 μl 延伸引物混合物，2 μl 超純水。PCR反應條件為：96℃ 1 min;96℃ 10 s，52℃ 5 s，60℃ 30 s共28個循環(huán)。(4)延伸產物純化：在10 μl 延伸產物中加入1 U SAP酶，37℃溫浴60 min，然后75℃滅活15 min。(5)脫鹽、上機、基因分型：取延伸產物2 μl 用SAP酶純化后在ABI3130xl測序儀上樣，采用GeneMapper4.0對測序結果進行分析，獲得基因分型報告。

1.2.3.2膠電泳及SNP分型峰形圖(見圖1～3)NG代表正常對照組，BG代表哮喘組，橙色峰為SIZE STANDARD,藍色、綠色、紅色、黑色峰分別代表延伸加入ddGTP、ddATP、ddTTP和ddCTP的延伸產物，峰下面標注的等位基因(如果用的延伸引物是正向的，則跟延伸加入的堿基一致，如果是反向的，則跟延伸加入的堿基互補)。其中橫軸表示等位基因長度，即通過SNP反應延伸引物的長度來區(qū)分多重體系每個位點基因型的位置；縱軸表示每個延伸反應熒光信號的強度。

1.3統(tǒng)計學分析根據每個SNP位點的基因分布計算其基因型和等位基因頻率，用精確檢驗確認其是否符合Hardy-Weinberg平衡定律，哮喘組和對照組基因型頻率的比較，其相對危險度以優(yōu)勢比(OR)及95%可信區(qū)間(95%CI)表示，運用邏輯回歸法檢驗并校正性別和年齡的影響，計算OR和95%CI，遺傳模型分別為Dominant(顯性)、Recessive(隱性)和Log-additive(疊加作用)共3種，所有的統(tǒng)計檢驗均為雙側概率檢驗，P<0.05認為有統(tǒng)計學意義，統(tǒng)計軟件為SPSS19.0。

圖1　rs2280090Fig.1　rs2280090Note: A.Sample BG21,genotype TT;B.Sample NG92,genotype CC;C.Sample BG104,genotype CT.alC，alTs stand for allele.

圖2　rs487377Fig.2　rs487377Note: A.Sample NG67,genotype AA;B.Sample BG114,genotype GG;C.Sample BG404,genotype GA.alA,alG stand for allele.

圖3　rs2787094Fig.3　rs2787094Note: A.Sample BG141,genotype GG；B.Sample NG95,genotype CC；C.Sample NG78,genotype GC.alG,alC stand for allele.

2　結果

2.1引物設計結果針對ADAM33基因共3個SNP位點的DNA序列，設計各個位點的多重PCR特異性擴增引物和單堿基延伸引物，引物序列見表1。

2.2基因多態(tài)性分析

2.2.1哮喘組與對照組基因型和等位基因頻率在校正性別和年齡的影響后，經精確檢驗，哮喘組與健康對照組其ADAM33基因3個SNP基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)，表明其基因頻率已達到遺傳平衡。

2.2.2SNP單位點與哮喘的相關性分析運用邏輯回歸法校正性別和年齡的影響后，計算基因型頻率的OR和95%CI，結果顯示，基因型頻率在哮喘組與對照組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2～4。

表1　ADAM33基因3個SNPs的PCR特異性擴增引物和單堿基延伸引物Tab.1　Specific PCR amplification primer and single base extension primer for 3 SNPs of ADAM33

表2　rs2280090的基因型頻率在對照組和哮喘組的分布Tab.2　Distribution of genotype frequency of rs2280090 in control group and asthma group

表3　rs487377的基因型頻率在對照組和哮喘組的分布Tab.3　Distribution of genotype frequency of rs487377 in control group and asthma group

表4　rs2787094的基因型頻率在對照組和哮喘組的分布Tab.4　Distribution of genotype frequency of rs2797094 in control group and asthma group

3　討論

解整合素-金屬蛋白酶33(A disintegrin and metalloprotease 33，ADAM 33)基因是2002年首個通過定位克隆發(fā)現的哮喘易感性基因，ADAM基因編碼鋅指依賴性金屬蛋白酶，所有的ADAM家族成員都屬于Ⅰ型跨膜蛋白[4]。最近克隆的人類ADAM33(hADAM33)基因[5]定位于20號染色體短臂(20p13)，跨度約14 kb，包含22個外顯子和21個內含子，編碼的蛋白質包含813個氨基酸，其結構類似于ADAM家族其他成員，由8個結構域組成。

自從ADAM33基因被確定為哮喘的易感基因后，探討該基因在不同種族和不同地域中與哮喘的相關性成為國內外研究熱點。

Howard等[6]的研究表明，對于四個種族人群[包括美國黑人、美國白人(除西班牙和丹麥籍外)、美國的西班牙籍人和丹麥籍白人]，ADAM33基因上8個SNPs(包括S1,S2,ST + 4,ST +7,T1,T2,V21和V4)在每一人群中至少有一種SNP與哮喘相關，但沒有一種是四種人群共有的與哮喘相關的SNP。 Hirota等[7]采用PCR直接測序的方法鑒定了日本人群ADAM33基因上48個SNP，證實T1(Met764Thr),T2(Pro774Ser),S2和V-3與哮喘有關。Vergara等[8]的研究發(fā)現，哥倫比亞人群ADAM33基因ST+7與哮喘有相關性，H4(GCAGGG)與家系中的哮喘有關，V4、T2與血液中IgE水平相關。2011年Awasthi等[9]采用PCR-RELP方法對印度兒童ADAM33基因上的5個位點(F+1,S2,ST+4,ST+5和V4)進行多態(tài)性分析，發(fā)現S2,ST+5位點與哮喘危險性有關，而F+1、ST+4位點突變純合子基因型和突變等位基因與哮喘危險性增加有關，單體型AGCCT、GGACT和AGCCC呈正相關，單體型ACAGT、AGCGC、AGCGT、GCAGC和GCCGT呈保護性相關。因此，認為ADAM33基因多態(tài)性與印度兒童哮喘相關。

國內Su等[10]對中國漢族人群 ADAM33基因V4、 T+1、T2、T1、S1、Q-1的多態(tài)性與哮喘的關系進行研究，發(fā)現V4、T+1和T1與漢族人群哮喘有關。此外，針對南方漢族人群，國內邱玉明等[11]研究發(fā)現ADAM33基因Met764Thr位點多態(tài)性與哮喘存在相關性，而另一項研究表明北方漢族該基因多態(tài)性與哮喘無相關[12]。因此，在不同人種中，ADAM33基因多態(tài)性的類型和頻率、生物學功能及其與哮喘的關系，均可能有所差異。Ober等[13]認為人種不同，突變等位基因分布頻率不同，與哮喘、過敏癥的相關關系就可以不同；研究方法不同，入選病例標準不同，所得的結論也可不同。

我們的研究結果發(fā)現： ADAM33基因rs22800 90、rs487377和rs2787094的基因多態(tài)性與青島地區(qū)漢族成人哮喘無相關關系。

[1]Van Eerdewegh P,Little RD,Dupuis J,etal.Association of the ADAM33 gene with asthma and bronchial hyperresponsiveness[J].Nature，2002,418:426-430.

[2]中華醫(yī)學會呼吸病學分會.支氣管哮喘防治指南[J].中華結核和呼吸雜志，2008，31(3)：177-185.

[3]梁文華，周兆山，吉中強，等.IL-4和IL-4R基因多態(tài)性與哮喘的相關性 [J].中醫(yī)學遺傳學雜志，2014，31(1)：97-100.

[4]Primakoff P,Myles DG.The ADAM gene family:surface proteins with adhesion and protease activity[J].Trends Genet,2000,16(2):83-87.

[5]Yoshinaka T,Nishii K,Yamada K,etal.Identification and characterization of novel mouse and human ADAM33s with potential metalloprotease activity[J].Gene,2002,28(1-2):227-236.

[6]Howard TD,Postma DS,Jongepier H,etal.Association of a disintegrin and metalloprotcase 33(ADAM33)gene with asthma in ethnically diverse populations [J].J Allcriry Clin Immunol,2003,112:717-722.

[7]Hirota T,Hasegawa K,Obara K,etal.Association between ADAM33 polymorphisms and adult asthma in the Japanese population [J].Clin Exp Allcriry,2006,36:884-891.

[8]Vergara CI,Acevedo N,Jimenez S,etal.A Six-SNP haplotype of ADAM33 is associated with asthma in a population of Cartagena,Colombia[J].Int Arch Allergy Immunol,2010,152:32-40.

[9]Awasthi S,Tripathi P,Ganesh S,etal.Association of ADAM33 gene polymorphisms with asthma in Indian children[J].J Hum Genet,2011，56:188-195.

[10]Su D,Zhang X,Sui H,etal.Association of ADAM33 gene polymorphisms with adult allergic asthma and rhinitis in a Chinese Han population[J].BMC Med Genet,2008,9:82.

[11]邱玉明，羅雅玲，賴文巖，等.ADAM33基因Met764Thr位點多態(tài)性與支氣管哮喘發(fā)病及患者肺功能的相關性[J].中華結核和呼吸雜志，2007，30(7)：518-521.

[12]Wang P,Liu QJ,Li JS,etal.Lack of association between ADAM33 gene and asthma in a Chinese population[J].Int J Immunogene,2006,33(4):303-306.

[13]Ober C,Leavitt SA,Tsalenko A,etal.Variation in the interleukin 4-receptorαgene confers susceptibility to a asthma and atopy in ithnically diverse populations[J].Am J Hum Genet,2000,66:517-526.

[收稿2015-10-24修回2015-11-19]

(編輯張曉舟)

Association between ADAM33 polymorphisms and susceptibility of asthma

XUE Wei-Lin,ZHOU Zhao-Shan,WANG Yan-Qing,JI Zhong-Qiang,ZHANG Xiao-Yan，LIANG Wen-Hua.Department of Cardiology,Qingdao Hiser Medical Center,Qingdao 266033,China

Objective:To investigate the relationship between ADAM33 polymorphisms and susceptibility of asthma of Chinese in Qingdao.Methods: The polymorphism of ADAM33 gene,they were rs2280090，rs487377 and rs2787094,were detected with SnaPshot method.Results: There was no significant difference between asthma group and control group in genotypic frequencies.Conclusion: The study shows that the rs2280090，rs487377 and rs2787094 were not associated with susceptibility of asthma in Han nationality in Qingdao.

Asthma；ADAM33；Single nucleotide polymorphisms；Association analyses

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.003

R392文獻標志碼A

1000-484X(2016)08-1099-04

④，E-mail:at_mountain@163.com。

薛衛(wèi)林(1964年-)，男，主任醫(yī)師，主要從事哮喘臨床研究，E-mail:drxw101@136.com。