劉嘉琳　張雪嬌　楊　飛　婁永富　孟　明　陳冬志②

(河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，保定071000)

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·基礎(chǔ)免疫學(xué)·

免疫調(diào)節(jié)劑CH2b對(duì)葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶混合肽段誘導(dǎo)的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎小鼠的影響①

劉嘉琳張雪嬌楊飛婁永富③孟明③陳冬志②③

(河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，保定071000)

①本文為國(guó)家自然科學(xué)基金(NSFC)(81373197)、河北省自然科學(xué)基金(H2014201133，H2015201131)、河北大學(xué)醫(yī)學(xué)學(xué)科建設(shè)基金(2014A1001，2014A1002)和國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目基金(201510075030)。

②河北大學(xué)醫(yī)學(xué)部，保定071000。

目的：探究前期合成的含噻唑烷-4-酮的免疫調(diào)節(jié)劑CH2b對(duì)葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶(Glucose-6-phosphate isomerase,GPI)混合肽段誘導(dǎo)的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)小鼠發(fā)病的影響。方法：hGPI325-339、hGPI469-483多肽片段與完全弗氏佐劑充分乳化后，于DBA/1小鼠尾根部多點(diǎn)皮下注射，并用百日咳毒素加強(qiáng)免疫。然后分別用α-半乳糖神經(jīng)酰胺(α-GalCer)和CH2b對(duì)模型小鼠進(jìn)行干預(yù)，監(jiān)測(cè)各組小鼠體重變化和足踝關(guān)節(jié)腫脹變化情況，關(guān)節(jié)組織蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin staining，HE)染色法觀察炎細(xì)胞浸潤(rùn)情況，流式細(xì)胞技術(shù)(Fluorescence-activated cell sorting,FACS)檢測(cè)全血中iNKT細(xì)胞頻率變化，微量樣本多指標(biāo)流式蛋白定量技術(shù)(Cytometric bead array，CBA)檢測(cè)血清中細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-4、IFN-γ水平。結(jié)果：與GPI混合肽段誘導(dǎo)的模型組相比，α-GalCer和免疫調(diào)節(jié)劑CH2b均可顯著改善模型小鼠的體重增長(zhǎng)緩慢、關(guān)節(jié)腫脹情況(P<0.05)；炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少；且二者均可以顯著提高RA小鼠體內(nèi)iNKT細(xì)胞的頻率，與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；α-GalCer、CH2b組可以降低模型小鼠炎癥高峰期TNF-α、IL-6、IFN-γ水平，兩組結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 結(jié)論：免疫調(diào)節(jié)劑CH2b通過(guò)激活iNKT細(xì)胞影響炎性細(xì)胞因子的分泌，緩解GPI混合肽段誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎。

免疫調(diào)節(jié)劑CH2b；α-GalCer；葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶；iNKT細(xì)胞

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種病因復(fù)雜的慢性自身免疫性疾病，可累及全身關(guān)節(jié)和多臟器，其發(fā)病基礎(chǔ)是免疫失衡和過(guò)度炎癥反應(yīng)。iNKT(invariant nature killer T,iNKT)細(xì)胞是近年發(fā)現(xiàn)的一群特殊細(xì)胞群，兼具NK細(xì)胞功能和T細(xì)胞特點(diǎn)，在腫瘤、感染、器官移植、自身免疫性疾病中發(fā)揮強(qiáng)大作用[1,2]。一方面，直接發(fā)揮殺傷作用于靶器官，另一方面，通過(guò)分泌細(xì)胞因子和趨化因子[3]，發(fā)揮致炎或抑炎雙向功能，糾正免疫平衡，維持免疫耐受，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)，是鏈接固有免疫和適應(yīng)性免疫的橋梁，被譽(yù)為免疫系統(tǒng)的“瑞士軍刀”[4]。已有研究表明，RA患者體內(nèi)存在iNKT細(xì)胞頻率、功能的缺陷，治療后可隨病情的緩解而恢復(fù)[5]，且iNKT細(xì)胞頻率變化與患者體內(nèi)IFN-γ/IL-4比值呈負(fù)相關(guān)[6]。本課題組前期設(shè)計(jì)合成的類核苷衍生物含噻唑烷-4-酮的免疫調(diào)節(jié)劑CHs在體外實(shí)驗(yàn)中能顯著促進(jìn)iNKT細(xì)胞增殖和殺靶活性[7,8]，降低IFNγ/IL-4 比值，并可以激活轉(zhuǎn)錄因子GATA-3 使iNKT分化傾向Th2優(yōu)勢(shì)[6]。

葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶(Glucose-6-phosphate isomerase,GPI)是廣泛應(yīng)用于臨床RA診斷及判斷活動(dòng)性的一個(gè)常用檢測(cè)指標(biāo)，抗原rhGPI誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎在CD4+T細(xì)胞的依賴性和抗TNF-α、IL-6反應(yīng)性方面更加接近RA患者特點(diǎn)，是一種新型的關(guān)節(jié)炎模型[9]。Lisa[10]認(rèn)為GPI325-339和GPI469-483作為GPI的活性片段，誘導(dǎo)DBA/1小鼠發(fā)生關(guān)節(jié)炎，但單肽段的效果不如整個(gè)GPI蛋白。我們前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)混合肽段誘導(dǎo)效果強(qiáng)于單一肽段，且相比整個(gè)蛋白更加經(jīng)濟(jì)、易得。Horikosh[9]應(yīng)用iNKT細(xì)胞經(jīng)典激活劑α-半乳糖神經(jīng)酰胺(α-GalCer)干預(yù)GPI誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠，小鼠癥狀得到緩解。本實(shí)驗(yàn)旨在研究免疫調(diào)節(jié)劑CH2b對(duì)葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶(Glucose-6-phosphate isomerase,GPI)混合肽段誘導(dǎo)的RA小鼠的體內(nèi)作用效果，以α-Galcer為陽(yáng)性對(duì)照，通過(guò)觀察其對(duì)模型小鼠體重、關(guān)節(jié)腫脹程度、足踝關(guān)節(jié)組織病理、外周血iNKT細(xì)胞頻率、血清細(xì)胞因子的影響，為后續(xù)RA靶向治療提供新的科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料、試劑

1.1.1動(dòng)物DBA/1小鼠60只，雄性，8周，體重(20±1)g，SPF級(jí)，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2014-0004。

1.1.2試劑與儀器化合物CH2b由本課題組前期合成；多肽片段hGPI325-339(IWYINCFGCETHA ML)、hGPI469-483(EGNRPTNSIVFTKLT)由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成(1407182)；百日咳毒素(P7208)和完全弗氏佐劑(Complete freund′s adjuvant，CFA，F(xiàn)5881)為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；α-Galcer為ENZO Life Sciences公司產(chǎn)品；FITC標(biāo)記的CD4抗體(553046)、微量樣本多指標(biāo)流式蛋白定量技術(shù)(CBA)Th1/Th2/Th17細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒(560485)、紅細(xì)胞裂解液(555899)為美國(guó)BD公司產(chǎn)品；PE標(biāo)記的T-selected-CD1d Tetramer日本MBL公司產(chǎn)品；BSA為Mp biomedicals New Zealand(MP Biomedicals)公司產(chǎn)品；PBS 為Solarbio公司產(chǎn)品；熒光倒置顯微鏡為 TH4-200，日本Olympus 公司產(chǎn)品；流式細(xì)胞儀Calibur、Accuri C6為BD 公司產(chǎn)品。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組DBA/1小鼠，隨機(jī)取出15只作為健康對(duì)照組；45只小鼠進(jìn)行混合肽段人工造模：每75 μl預(yù)冷三蒸水中溶解50 μg hGPI325-339和hGPI469-483多肽片段，所得溶液與CFA等體積充分乳化為乳化劑，于小鼠尾根部150 μl/只皮下注射，0 h、48 h腹腔注射200 ng/只百日咳毒素。然后將45只小鼠隨機(jī)分為3組，一組不做任何處理，為模型組；一組造模當(dāng)日應(yīng)用α-GalCer(2 μg/只)尾根注射，為α-GalCer組；剩下一組用CH2b(2 μg/只)連續(xù)腹腔注射7 d，為CH2b組。

1.2.2小鼠一般狀況評(píng)估造模后監(jiān)測(cè)小鼠體重動(dòng)態(tài)變化，每4 d稱量小鼠體重；每天觀察小鼠足踝紅腫程度，對(duì)小鼠關(guān)節(jié)紅腫程度量化，進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)分，其標(biāo)準(zhǔn)為：1分表示足趾有輕度紅腫；2分表示明顯可見(jiàn)的足背、足掌紅腫；3分表示足踝出現(xiàn)紅腫，依此評(píng)估每只小鼠關(guān)節(jié)情況。

1.2.3小鼠關(guān)節(jié)組織HE染色造模后第8天、第14天、第37天小鼠眼球取血，備用。斷頸椎處死置于75%乙醇中，剪下鼠爪后置于10%福爾馬林溶液中固定。然后進(jìn)行脫水、透明、石蠟包埋切片(5 μm)，二甲苯(Ⅰ 、Ⅱ)脫蠟，梯度乙醇水化，蒸餾水洗。然后蘇木素染色15 min，水洗，1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，自來(lái)水返藍(lán)15 min，水洗，1%乙醇伊紅染色3 min。脫水、透明、封固，顯微鏡下觀察。

1.2.4小鼠iNKT細(xì)胞頻率檢測(cè)預(yù)先處理CD1d四聚體：0.5%Tween-20和0.9%NaCl將1 mg/ml的α-GalCer稀釋至200 μg/ml，每100 μl CD1d Tetramer中加入5 μl稀釋后的α-GalCer，室溫孵育12 h，置4℃?zhèn)溆?。將各期小鼠所得全?20 μl/只于流式管中，用BSA阻斷非特異性染色，F(xiàn)ITC標(biāo)記的Anti-CD4、PE標(biāo)記的負(fù)載α-GalCer的CD1d四聚體各2 μl，避光孵育20 min。然后加紅細(xì)胞裂解液1 ml，避光孵育8 min，澄清透亮后離心1 000 r/min，5 min，棄上清，PBS洗滌2次，重懸后加PBS 500 μl，流式細(xì)胞儀Calibur上機(jī)檢測(cè)，F(xiàn)lowJo軟件(Tree Star公司)數(shù)據(jù)分析。

1.2.5CBA檢測(cè)細(xì)胞因子收集各期小鼠血清，應(yīng)用CBA 細(xì)胞因子試劑盒檢測(cè)TNF-α、IL-6、IL-4、IFN-γ 水平。嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行操作：制備標(biāo)準(zhǔn)品，混合捕獲微球，每實(shí)驗(yàn)管中加入捕獲微球50 μl，每標(biāo)準(zhǔn)品管中加入梯度稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品50 μl，每樣本管中加入樣本50 μl，然后所有管均加入 PE檢測(cè)試劑50 μl，避光孵育2 h(室溫)，每管加入洗液1 ml，1 500 r/min，離心5 min，棄上清后，各加洗液300 μl，重懸，流式細(xì)胞儀Accuri C6上機(jī)檢測(cè)，用FCAP軟件(BD公司)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2　結(jié)果

2.1CH2b對(duì)RA模型小鼠體重影響與健康對(duì)照組小鼠平均體重(22.64±1.18)g相比，模型組小鼠體重(22.03±0.26)g，較健康對(duì)照組相比增長(zhǎng)緩慢(P<0.05)，炎癥高峰階段出現(xiàn)零增長(zhǎng)、負(fù)增長(zhǎng)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。α-GalCer組平均體重(22.59±0.78)g，CH2b組平均體重(22.38±0.34)g。α-GalCer組、CH2b組小鼠相比模型組緩慢上升，與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但兩組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖1)。

2.2CH2b對(duì)RA模型小鼠關(guān)節(jié)紅腫情況的影響不同處理組之間足踝腫脹與緩解程度不同，模型組小鼠造模第8天開始，一個(gè)或幾個(gè)足趾出現(xiàn)紅腫，逐日加重，第14天到達(dá)高峰，表現(xiàn)為多關(guān)節(jié)紅腫，伴足掌、足踝腫脹，此后日漸緩解。α-GalCer組、CH2b組足踝不同程度的腫脹，均比同期模型組程度輕，利用系統(tǒng)評(píng)分法對(duì)小鼠關(guān)節(jié)紅腫程度進(jìn)行量化可以明顯看出各組差異(圖2、3)。

2.3CH2b對(duì)關(guān)節(jié)部位炎癥浸潤(rùn)情況的影響HE染色后顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照組無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)情況相比，GPI誘導(dǎo)的模型組小鼠的骨與骨、骨與上皮之間的結(jié)締組織存在大量的炎細(xì)胞浸潤(rùn)，其中，單核細(xì)胞較多，漿細(xì)胞和淋巴細(xì)胞量少。α-GalCer組、CH2b組，炎細(xì)胞浸潤(rùn)情況減輕，炎細(xì)胞數(shù)量也相對(duì)較少(圖4)。

2.4CH2b對(duì)iNKT細(xì)胞頻率變化的影響健康對(duì)照組iNKT細(xì)胞頻率值為(0.39～0.03)%；RA模型組iNKT細(xì)胞頻率為(0.10～0.71)%；α-GalCer組頻率值為(1.36～0.18)%；CH2b組為(1.22～0.19)%。α-GalCer組和CH2b組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),其他各組之間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖5)。

2.5CH2b對(duì)炎性細(xì)胞因子水平的影響與健康對(duì)照組相比，模型組小鼠血清中TNF-α、IL-6、IFN-γ水平升高，在炎癥高峰期上升最明顯(P<0.05)。α-GalCer、CH2b組與模型組相比，TNF-α、IL-6、IFN-γ水平相對(duì)降低，在造模第14天降低最明顯(P<0.05)。IL-4變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖6)。

圖1　各組小鼠體重變化情況Fig.1　Change of weight in mice

圖2　各組小鼠關(guān)節(jié)紅腫狀況Fig.2　Swelling of ankle joint in mice

圖3　各組小鼠足踝關(guān)節(jié)腫脹狀況評(píng)分Fig.3　Clinical score of ankle joint in mice

圖4　第14天各組小鼠關(guān)節(jié)組織HE染色對(duì)比圖(×100)Fig.4　Histopathological changes of ankle joint in mice on day 14(×100)

圖5　各組小鼠外周血iNKT細(xì)胞頻率Fig.5　Frequency of iNKT cells in peripheral blood in mice

圖6　各組小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-4、IFN-γ 水平Fig.6　Levels of TNF-α,IL-6,IL-4,IFN-γ in serum in mice

3　討論

RA是由自身抗原誘導(dǎo)T、B 細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞和滑膜細(xì)胞等參與免疫應(yīng)答、釋放炎癥細(xì)胞因子介導(dǎo)的滑膜炎癥、軟骨侵蝕和關(guān)節(jié)損傷。RA個(gè)體內(nèi)存在明顯的免疫功能紊亂和T細(xì)胞亞群失衡：Th1、Th17亞群過(guò)度增殖，Th2、Treg亞群被抑制[11]。恒定NKT 細(xì)胞(invariant NKT cells，iNKT cells)表達(dá)恒定的TCRα鏈和某些β鏈(小鼠是由恒定的Vα14-Jα18和限制性的Vβ8.2,-7或-2鏈，人類為Vα24-Jα18和Vβ11鏈)，主要通過(guò)APC表面MHCⅠ樣分子CD1d遞呈的糖脂類抗原(如經(jīng)典的激活劑α-GalCer)激活[12]。α-GalCer是一種從海洋生物海綿體中提取出來(lái)的脂類物質(zhì)，通過(guò)與CD1d、TCR形成三聯(lián)體活化iNKT細(xì)胞，迅速分泌大量細(xì)胞因子和趨化因子，參與機(jī)體的免疫應(yīng)答，或維持免疫耐受[9]。研究發(fā)現(xiàn)，iNKT細(xì)胞與RA發(fā)病密切相關(guān)[5,6]。

GPI是臨床RA診斷及判斷活動(dòng)性的一個(gè)常用檢測(cè)指標(biāo)，rhGPI抗原可誘導(dǎo)DBA1小鼠發(fā)生與人RA病變特點(diǎn)相似的關(guān)節(jié)炎癥[10]。最新研究發(fā)現(xiàn)，該模型小鼠表現(xiàn)出iNKT細(xì)胞頻率降低[13]，Th1和Th17炎性細(xì)胞因子過(guò)度分泌等特點(diǎn)[14]。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們以構(gòu)建GPI 混合肽段誘導(dǎo)的模型小鼠為基礎(chǔ)，著重探討免疫調(diào)節(jié)劑CH2b通過(guò)iNKT細(xì)胞對(duì)GPI誘導(dǎo)的RA模型小鼠的干預(yù)作用。研究結(jié)果顯示：CH2b在炎癥初期即開始抑制小鼠關(guān)節(jié)紅腫，在模型組到達(dá)炎癥高峰前，CH2b組已經(jīng)開始大幅逆轉(zhuǎn)炎癥進(jìn)展；HE染色觀察發(fā)現(xiàn)，與模型組大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)不同，CH2b、α-GalCer組炎細(xì)胞數(shù)量明顯減少；炎癥高峰期，F(xiàn)ACS顯示：CH2b上調(diào)iNKT的頻率；血清炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6水平較模型組下降。Horikoshi等[9]研究證明，α-GalCer對(duì)GPI誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎有治療作用。本實(shí)驗(yàn)中，免疫調(diào)節(jié)劑CH2b與α-GalCer達(dá)到了相似的治療效果：體重上調(diào)、關(guān)節(jié)腫脹緩解、關(guān)節(jié)組織間炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減輕、炎癥高峰期iNKT細(xì)胞頻率上調(diào)、TNF-α及IL-6水平降低等。α-GalCer對(duì)自身免疫病的潛在治療作用已在動(dòng)物模型中得到確認(rèn)[14，15]。但是，Parekh等[16]發(fā)現(xiàn)，具有超強(qiáng)激活力的α-GalCer可以刺激所有iNKT細(xì)胞充分活化，致使大量的Th1、Th2及Th17型因子同時(shí)釋放，形成“細(xì)胞因子風(fēng)暴”；而過(guò)度活化之后細(xì)胞就會(huì)長(zhǎng)時(shí)間處于無(wú)活性狀態(tài)。這種超抗原樣的特性限制了α-GalCer的臨床應(yīng)用。因此，探索與α-GalCer激活特性不同的溫和而有效的iNKT細(xì)胞激動(dòng)劑成為人們的研究熱點(diǎn)。Kerzerho等[17]報(bào)道，能降低與恒定TCR間親和力或iNKT/APC相互作用時(shí)間的調(diào)節(jié)劑可以有助于延長(zhǎng)iNKT細(xì)胞的壽命，保持其在體內(nèi)的活化狀態(tài)。我們前期合成的免疫調(diào)節(jié)劑CHs是將免疫調(diào)節(jié)劑匹多莫德所含有的特征基團(tuán)——噻唑烷酮與糖類分子連接后篩選出的小分子糖類化合物，并研究了其對(duì)T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞的影響[6,8,18-22]，發(fā)現(xiàn)在體外實(shí)驗(yàn)中CHs能顯著促進(jìn)T細(xì)胞增殖、iNKT細(xì)胞增殖和殺靶活性，提升巨噬細(xì)胞功能，降低IFN-γ/IL-4 比值，使iNKT分化傾向Th2優(yōu)勢(shì)，具有全面的免疫調(diào)節(jié)活性，且對(duì)細(xì)胞無(wú)毒副作用。在本實(shí)驗(yàn)中CH2b在RA小鼠體內(nèi)不僅發(fā)揮了與α-GalCer相似的治療效果，而且除關(guān)節(jié)及相關(guān)免疫組織器官病理改變外，心、肺、腎、腦、膽囊、膀胱、睪丸、附睪、腎上腺均未見(jiàn)明顯異常，提示CH2b腹腔注射后不引起其他器官的毒性反應(yīng)，是一種相對(duì)理想的iNKT細(xì)胞功能調(diào)節(jié)劑。雖然免疫調(diào)節(jié)劑CH2b調(diào)節(jié)iNKT細(xì)胞具體機(jī)制還需進(jìn)一步探討，但其具有的糾正體內(nèi)免疫平衡紊亂的潛在作用，使得將來(lái)應(yīng)用CH2b基于iNKT細(xì)胞靶向治療RA成為了可能。

[1]Nico A,Nieda M,Koezuka Y,etal.Human invariant Vα24+ natural killer T cells activated by alpha-galactosylceramide have cytotoxic antitumour activity through mechanisms distinct from T cells and nature killer cells[J].Immunol,2000,99(2):229-234.

[2]Wu L，Van Kaer L.Natural killer T cells in health and disease[J].Front Biosci(Schol Ed),2011,3:236-251.

[3]Patel O,Cameron G,Pellicci DG,etal.NKT TCR recognition of CD1d-a-Galactosylceramide[J].J Immunol,2011,187(9):4705-4713.

[4]Matsuda JL,Mallevaey T,Scott-Browne J,Gapin L.CD1d-restricted iNKT cells,the Swiss-Army knife′ of the immune system[J].Curr Opin Immunol，2008,20(3)：358-368.

[5]Parietti V,Chifflot H,Sibilia J,etal.Rituximab treatment overcomes reduction of regulatory iNKT cells in patients with rheumatoid arthritis[J].Clin Immunol,2010,134(3):331-339.

[6]孟明,陳丹,許鳴華,等.RA患者iNKT細(xì)胞頻率與IFN-γ/IL-4的相關(guān)性研究[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2015,35(3):213-218.

[7]Li XL,Yin QM,Jiao LY,etal.A convenient synthesis of novel thiazolidin-4-one-linked pseudodisaceharides by tandem Staudinger/aza-Wittig/cyclization and their biological evaluation[J].Carbohydr Res,20l1,346(3):401-409.

[8]孟明，李春曉，洪洋，等.含噻唑烷-4-酮的糖類衍生小分子免疫調(diào)節(jié)劑對(duì)人淋巴細(xì)胞分化的影響[J].中華微生物學(xué)與免疫學(xué)雜志,2012,32(6):486-490.

[9]Horikoshi M,Goto D,Segawa S,etal.Activation of invariant NKT cells with glycolipid ligand a-galactosylceramide ameliorates glucose-6-phosphate isomerase peptide-induced arthritis[J].PLoS ONE,2012,7(12):e51215.

[10]Bruns L,Frey O,Morawietz L,etal,Immunization with an immunodo minant self-peptide derived from glucose-6-phosphate isomerase induces arthritis in DBA/1 mice[J].Arthritis Research Therapy,2009,11(4):R117.

[11]Boissier MC,Assier E,Falgarone Getal.Shifting the imbalance from Th1/Th2 to Th17/treg:the changing rheumatoid arthritis paradigm[J].Joint Bone Spine,2008,75(4):373-375.

[12]Godfrey DI,Stankovic S,Baxter AG.Raising the NKT cell family[J].Nat Immunol,2010,11(3):197-206.

[13]Yoshida Y,Mikami N,Matsushima Y,etal.Functional mechanism(s)of the inhibition of disease progression by combination treatment with fingolimod plus pathogenic antigen in a glucose-6-phosphate isomerase peptide-induced arthritis mouse model[J].Biol Pharm Bull,2015,38(8):1120-1125.

[14]Caielli S,Sorini C,Falcone M.The dangerous liaison between iNKT cells and dendritic cells:does it prevent or promote autoimmune diseases?[J].Autoimmunity,2011,44(1):11-22.

[15]Yang JQ,Wen XS,Kim PJ,etal.Invariant natural killer T cells inhibit autoreactive B cells in a contact-and CD1d-dependent manner[J].Immunol,2011,186(3):1512-1520.

[16]Parekh VV,Wilson MT,Olivares-Villagomez D,etal..Glycolipid antigen nduces Long -term natural killer T cell anergy in mice[J].Clin Invest,2005,115(9):2572-2583.

[17]Kerzerho J,Yu ED,Barra CM,etal.Structural and functional characterization of a novel non-glycosidic iNKT agonist with immunomodulatory Properties[J].Immunol,2012,188(5):2254-2265.

[18]Chen H,Yin QM,Li CX,etal.Synthesis of C-Pseudonucleosides bearing thiazolidin-4-one as a novel potential immunostimulating agent[J].ACS Med Chem Lett，2011,2(11):845-848.

[19]Meng M,Li CX,Chen DZ,etal.Novel synthetic immunostimulators with a thiazolidin-4-one ring promote the cytotoxicity of human NK Cells[J].Int Immunopharmacol,2013,15(4):655-660.

[20]Li CX,Meng M,Chen D,etal.The immunostimulatory effect of novel immunostimulator CH2b with a thiazolidin-4-one ring on the functions of LPS-activated RAW 264.7 macrophages in vitro[J].Int Immunopharmacol,2013,17(3):698-703.

[21]孟明，李春曉，王澤瑞，等.含噻唑烷-4-酮的免疫刺激劑CH2a增強(qiáng)人iNKT細(xì)胞的功能[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2013,29(4):345-349.

[22]孟明，王澤瑞，李春曉，等.新型合成的免疫調(diào)節(jié)劑CHla促進(jìn)人iNKT細(xì)胞功能的研究[J].中華微生物學(xué)與免疫學(xué)雜志,2013,33(6):452-457.

[收稿2015-10-28修回2016-05-16]

(編輯倪鵬)

Effects of immunostimulator CH2b on mixed peptides derived from glucose-6-phosphate isomerase induces arthritis

LIU Jia-Lin，ZHANG Xue-Jiao，YANG Fei，LOU Yong-Fu，MENG Ming，CHEN Dong-Zhi.College of Basic Medical Science of Hebei University,Baoding 071000,China

Objective:To explore the effect of the synthetic immunomodulator CH2b with a thiazolidin-4-one ring on the pathogenesis of rheumatoid arthritis(RA) mice induced by glucose-6-phosphate isomerase(GPI) mixed peptides.Methods: hGPI325-339,hGPI469-483 peptide fragments were mixed with complete freund′s adjuvant fully,DBA/1 mice were givien subcutaneous injection of the emulsifiers,pertussis toxin to strengthen immunity.And then RA mice were intervened with α-GalCer and CH2b,the changes of body weight,ankle joint symptoms scores were observed.The joint tissues stained with hematoxylin and eosin(HE) was used to evaluate the inflammatory cells.Fluorescence-activated cell sorting(FACS) was used to detect the frequency changes of iNKT cells.Cytometric bead array(CBA) was used to analyze the levels of serum cytokines TNF-α,IL-6,IL-4,IFN-γ.Results: Compared with the model group,α-GalCer,CH2b could reduce the inflammation of the model mice,significantly improve the body weight growth and the joint swelling(P<0.05).The inflammatory cells infiltration were decreased.More importantly,CH2b improved the frequency of iNKT cells in peak,the difference was statistically significant(P<0.05).The levels of TNF-α,IL-6,IFN-γ in serum were significantly decreased(P< 0.05) by CH2b.α-GalCer,CH2b could decrease the levels of TNF-α,IL-6,IFN-γ,and the two groups had no statistically significant difference(P> 0.05).Conclusion: Immunomodulator CH2b by activating iNKT cells affect the secretion of inflammatory cytokines,and it relieved the GPI induced arthritis.

Immunostimulator CH2b;α-GalCer;Glucose-6-phosphate isomerase;iNKT cells

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.002

R392.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

1000-484X(2016)08-1094-05

③，E-mail:mengming127@163.com；E-mail:chenddzz@163.com。

劉嘉琳(1978年-)，女，博士，講師，主要從事疾病動(dòng)物模型的建立及發(fā)病機(jī)制的研究，同時(shí)就職于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，E-mail:liujialin7867@126.com。