袁　源，周　偉，付云飛，林麗靜，黃曉兵，李積華

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院　農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣東　湛江　524001；2.農(nóng)業(yè)部熱帶作物產(chǎn)品加工重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，廣東　湛江　524001)

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氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法結(jié)合保留指數(shù)對高良姜揮發(fā)油成分的分析

袁源，周偉*，付云飛，林麗靜，黃曉兵，李積華

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣東湛江524001；2.農(nóng)業(yè)部熱帶作物產(chǎn)品加工重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江524001)

采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)法結(jié)合保留指數(shù)(RI)對高良姜水蒸氣蒸餾法(SD)、超聲波輔助溶劑提取法(UAE)和亞臨界流體萃取法(SFE)所制備的揮發(fā)油進(jìn)行分析，分別鑒定出51，46和60個揮發(fā)性組分，并通過峰面積歸一化法確定各組分的相對含量。結(jié)果表明，高良姜揮發(fā)油的指標(biāo)性成分1,8-桉葉素含量的大小順序?yàn)镾D法≈SFE法>UAE法，UAE法雖耗時少、能耗低，但由于所用有機(jī)溶劑難去除，所得揮發(fā)油品質(zhì)較差。SFE法可得到部分SD法無法得到的化合物，如2-羥基-1,8-桉葉素、二苯基庚烷類等。另外β-石竹烯、α-石竹烯、α-法尼烯、γ-杜松烯等高沸點(diǎn)組分比例，SFE法所得高于另兩種方法；α-蒎烯、莰烯、β-蒎烯、檸檬烯、樟腦和α-松油醇等低沸點(diǎn)組分比例，SD法所得最高。同一批藥材不同提取方法所得的揮發(fā)油成分大部分相似，但部分成分與組分比例因不同提取方法的原理存在差異，實(shí)際生產(chǎn)中可根據(jù)功效需求選擇不同提取方法加以開發(fā)利用。

揮發(fā)油；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)；水蒸氣蒸餾法；超聲波輔助溶劑提取法；亞臨界流體萃取法

由于精油組分非常復(fù)雜，無法采用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)逐個組分進(jìn)行對比鑒定，而且不同氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀器的性能和分離柱柱效存在差異，組分分離效果不同，對質(zhì)譜產(chǎn)生許多干擾因素。因此，單純選用質(zhì)譜檢索高匹配度化學(xué)結(jié)構(gòu)來確定相應(yīng)峰的組分存在很大的不確定性。Kovats保留指數(shù)(Kvoats' retention index,簡稱RI)是化學(xué)物質(zhì)在相應(yīng)類型分離柱中對應(yīng)正烷烴的一種比較穩(wěn)定的性質(zhì)。只要用于分離的色譜柱性質(zhì)相同，氣相色譜條件相近，同種組分在不同儀器上所計(jì)算出的RI值通常為常數(shù)。因此，同時考慮分離峰的質(zhì)譜匹配度和RI匹配度可大大提高鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。在芳香精油復(fù)雜組分鑒定中，該方法在國際上得到普遍認(rèn)可并大量使用[1-2]。

高良姜，別名高涼姜、良姜、蠻姜和佛手根等，為姜科山姜屬多年生草本植物高良姜(AlpiniaofficinarumHance)的根莖，主產(chǎn)于廣東湛江的徐聞等縣市[3]，目前主要來源為人工栽培。其藥用歷史悠久，歷代本草均有記載，始載于《名醫(yī)別錄》，列為中品；歷版《中國藥典》均有收載，為“十大廣藥”之一[4]。高良姜有鎮(zhèn)痛、抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗腹瀉等功效[5]，其主要有效成分為黃酮類及揮發(fā)油成分。作為辛溫類藥材，揮發(fā)油是判斷其質(zhì)量優(yōu)劣的指標(biāo)之一。水蒸氣蒸餾法是揮發(fā)油類成分提取的傳統(tǒng)方法，以往的高良姜揮發(fā)油研究主要采用該方法提取[6-7]。然而該方法加熱時間長，溫度高，與水共煮或水上蒸餾無法避免某些熱敏性成分熱分解與易水解成分水解的問題。因此，近年有超臨界CO2流體萃取法、溶劑提取法和超聲波提取法應(yīng)用于高良姜揮發(fā)油提取的相關(guān)報(bào)道[8-9]。由于超臨界CO2流體萃取法操作壓力普遍大于25 MPa，極高壓力限制了設(shè)備有效容積的放大，同時較高的設(shè)備制造和運(yùn)行成本制約了該技術(shù)在生產(chǎn)中的應(yīng)用，亞臨界流體萃取法應(yīng)運(yùn)而生。

亞臨界流體萃取法(Subcritical fluid extraction，SFE)是以亞臨界狀態(tài)的流體(高于沸點(diǎn)，但在臨界溫度和壓力下，以流體形式存在的復(fù)合溶液)為溶媒，在低溫低壓狀態(tài)下提取目標(biāo)組分的一種新技術(shù)，其保留了超臨界CO2流體萃取法效率高、活性成分不易破壞、無雜質(zhì)、無溶劑殘留和環(huán)保的優(yōu)點(diǎn)，同時克服了其成本高、不易開展工業(yè)化生產(chǎn)等不足[10]。隨著亞臨界流體萃取技術(shù)的發(fā)展，萃取劑的使用正朝著無毒安全方向發(fā)展[11]。

不同的提取方法，由于原理與工藝不同，得到的高良姜揮發(fā)油之成分組成與比例可能也存在較大差異。因此，為了全面客觀地評價不同方法對高良姜揮發(fā)油提取的適用性和實(shí)用性，本研究對水蒸氣蒸餾法(SD)、超聲波輔助溶劑提取法(UAE)以及亞臨界流體萃取法(SFE)所提取的高良姜揮發(fā)油進(jìn)行對比研究，旨在較系統(tǒng)地認(rèn)識這些方法，為實(shí)際生產(chǎn)中科學(xué)選取提取工藝提供借鑒。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1實(shí)驗(yàn)材料

高良姜由廣東豐硒良姜有限公司(湛江徐聞)從原產(chǎn)地徐聞收集采購，經(jīng)除雜、洗凈、干燥、粉碎后備用。原植物標(biāo)本經(jīng)中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所林麗靜副研究員鑒定為高良姜AlpiniaofficinarumHance。

1.2儀器與試劑

Shimadzu QP2010-Plus氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本島津公司)，HAS-2000超聲波清洗機(jī)(深圳好順超聲設(shè)備有限公司)，Heidolph LR4002旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國海道爾夫公司)，CBE-5L亞臨界流體萃取設(shè)備(河南省亞臨界生物技術(shù)有限公司)。

正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品：C7～C30，部分標(biāo)準(zhǔn)品(德國Sigma公司)；其它試劑：除甲醇、正己烷為色譜純外，其余皆為分析純。

1.3高良姜揮發(fā)油的提取

1.3.1水蒸氣蒸餾法取上述藥材粉末500 g，按2010年版中國藥典一部附錄XD揮發(fā)油測定法中的甲法制備揮發(fā)油。

1.3.2超聲波輔助溶劑提取法取上述藥材粉末500 g，加入500 mL石油醚(30～60 ℃)提取劑，超聲功率360 W，提取溫度40 ℃，提取2次，每次20 min。合并兩次濾液，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中低溫(35 ℃)濃縮至2 mL。

1.3.3亞臨界流體萃取法取上述藥材粉末500 g，裝入特制的提取袋后，投入亞臨界萃取釜中。在溫度45 ℃，壓力0.8 MPa下通入亞臨界流體丁烷，對樣品逆流萃取3次，每次60 min，待亞臨界流體回收干凈后得粗制品。

1.4高良姜揮發(fā)油的供試品制備

1.4.1水蒸氣蒸餾法供試品制備將“1.3.1”蒸餾所得揮發(fā)油加入約1 g無水硫酸鈉，取上清液以甲醇稀釋40倍至2 mL樣品瓶中制備供試品溶液。

1.4.2超聲波輔助溶劑提取法供試品制備將“1.3.2”提取所得揮發(fā)油經(jīng)旋蒸處理至2 mL樣品瓶中制備供試品溶液。

1.4.3亞臨界流體萃取法供試品制備將“1.3.3”萃取所得粗制品添加1∶1正己烷和1%活性炭萃取脫色，取上層溶液以正己烷稀釋4倍至2 mL樣品瓶中制備供試品溶液。

1.5GC-MS分析條件

色譜條件：色譜柱：Rtx?-5 ms毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm，日本島津公司)；程序升溫：起始溫度60 ℃，保持6 min，以10 ℃/min升至160 ℃，保持5 min，再以20 ℃/min升至240 ℃，保持5 min；載氣(He)流速1.6 mL/min；壓力100.0 kPa；分流比30∶1；進(jìn)樣溫度250 ℃；進(jìn)樣量1 μL。

質(zhì)譜條件：電子轟擊(EI)離子源；離子源溫度230 ℃；接口溫度250 ℃；溶劑延遲2.5 min；數(shù)據(jù)采集方式Scan；質(zhì)量掃描范圍m/z40～450；檢測器增益電壓1.18 kV。

1.6RI值的測定

2　結(jié)果與討論

2.1不同提取方法的提取率與所得揮發(fā)油的感官評價

表1為不同提取方法制備高良姜揮發(fā)油的提取率與感官評價。由表1可知，雖然不同提取方法的提取率差別很大，但根據(jù)GC-MS檢測結(jié)果可知，3種方法所得的揮發(fā)油量與提取率并非呈正比例關(guān)系。這可能是由于UAE法通過旋蒸濃縮揮發(fā)油，使部分揮發(fā)油隨石油醚同時被蒸出，導(dǎo)致其含量降低。另外SFE法通過相似相溶的萃取原理可得到大量植物油脂等低極性粗制品，因其含有部分易水解及熱敏性物質(zhì)，精制后揮發(fā)油含量較傳統(tǒng)SD法高。

表1　不同提取方法制備高良姜揮發(fā)油的提取率與感官評價

2.2GC-MS檢測

將按“1.5”條件分析所得各組分峰用NIST Chemical Structures(美國國家標(biāo)準(zhǔn)研究所，第八版)庫和Wiley Library(威廉圖譜庫，第九版)庫進(jìn)行檢索，結(jié)合文獻(xiàn)RI值，以質(zhì)譜匹配度和RI值匹配度最高的化學(xué)結(jié)構(gòu)為最佳鑒定結(jié)果，部分主要成分利用標(biāo)準(zhǔn)品(STD)進(jìn)一步確認(rèn)，可信度更高。各組分峰相對含量的確定采用峰面積歸一化法。所得結(jié)果列于表2。

表2　不同提取方法所得高良姜揮發(fā)性成分的分析及鑒定結(jié)果

(續(xù)表2)

*:no data

由表2可見，不同方法提取得到的高良姜揮發(fā)油中分離鑒定出61種揮發(fā)性化合物，SD法檢出物占總量的99.85%，UAE法檢出物占總量的85.98%(其余為石油醚中揮發(fā)性烷烴成分)，SFE法檢出物占總量的97.14%(其余為植物油脂)，檢出物主要由萜烯類、酯類、酮類、醇類及其含氧衍生物組成。結(jié)果表明，1,8-桉葉素為高良姜揮發(fā)油中的主要成分，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[6-8]。

經(jīng)MS分析鑒定、RI值驗(yàn)證和STD確定后，不同提取方法對高良姜揮發(fā)油成分組成有一定影響。與傳統(tǒng)SD法需長時間與水共煮或者水上加熱相比，UAE法和SFE法所需溫度不超過45 ℃且提取體系不含水，因此可得到部分高溫或與水蒸餾無法得到的化合物，如2-羥基-1,8-桉葉素、β-人參烯、α-摩勒醇、α-杜松醇等。其中2-羥基-1,8-桉葉素是一種羥基功能化的1,8-桉葉素，與1,8-桉葉素的分子結(jié)構(gòu)相似，僅多1個羥基官能團(tuán)，因此二者活性與氣味相似；因其多了羥基官能團(tuán)，抑菌活性與芳香氣味較1,8-桉葉素更佳[12]。同時該化合物因具有羥基，極易溶于水，在高溫下易脫水分解，因此在SD法所得的揮發(fā)油中無法檢出該化合物[13]。

SFE法因萃取劑呈亞臨界流體狀態(tài)，因此得到部分獨(dú)有的化合物，如β-欖香烯、1,7-二(3,4-二羥基苯基)-4-烯-3-庚酮、環(huán)狀異長葉烯、β-桉葉油醇、α-紅沒藥醇、5-羥基-1,7-二苯基-3-庚酮。其中1,7-二(3,4-二羥基苯基)-4-烯-3-庚酮和5-羥基-1,7-二苯基-3-庚酮是一類被稱為二苯基庚烷類的化合物，該類化合物主要存在于姜科植物中，目前已發(fā)現(xiàn)此類化合物具有多種生物學(xué)和藥理學(xué)活性，包括抗氧化、治療神經(jīng)損傷、抗肝毒性、抗炎、抗增殖、止吐、抗腫瘤等[14]。二苯基庚烷類化合物是一類低極性化合物，具有低揮發(fā)性和熱不穩(wěn)定性[15]，傳統(tǒng)常規(guī)的提取方法無法得到該類化合物。

經(jīng)峰面積歸一化法測得3種萃取方法中各組分的比例存在較大差異。其指標(biāo)性成分l,8-桉葉素的含量分別為SD法(21.59%)，UAE法(36.53%)，SFE(10.29%)，但由于所得揮發(fā)油含量不同，經(jīng)修正后(表1)，所得1,8-桉葉素含量的大小順序?yàn)镾D法≈SFE法>UAE法。由此可見，UAE法雖耗時少、能耗低，但由于所使用的有機(jī)溶劑難去除，所得揮發(fā)油品質(zhì)較差。此外，文獻(xiàn)[6，8]中述及高良姜揮發(fā)油均含有的成分：β-石竹烯、α-石竹烯、α-法尼烯、γ-杜松烯等高沸點(diǎn)組分的比例，SFE所得比例高于另兩種方法；α-蒎烯、莰烯、β-蒎烯、檸檬烯、樟腦、α-松油醇等低沸點(diǎn)組分比例，SD法所得更高。這可能與SD法加熱時間長，難揮發(fā)的高沸點(diǎn)組分在長時間蒸煮下容易受到破壞的原因有關(guān)。

3　結(jié)　論

本研究通過GC-MS聯(lián)用結(jié)合保留指數(shù)對高良姜經(jīng)3種不同提取原理制備的揮發(fā)油成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)同一批藥材不同方法提取所得的揮發(fā)油成分大部分相似，但部分成分與組分比例因不同的提取原理存在差異。

揮發(fā)油具有輔助藥物透皮吸收的作用，是衡量中藥質(zhì)量和療效的指標(biāo)之一。高良姜藥材中揮發(fā)油的含量較高，辛香氣味是判斷其藥材質(zhì)量優(yōu)劣的一個指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)其指標(biāo)性成分l,8-桉葉素在3種提取方法中的含量為SD法≈SFE法>UAE法；其中活性更強(qiáng)的2-羥基-1,8-桉葉素因選用了非熱提取方法得以報(bào)道。SFE法所得的二苯基庚烷類物質(zhì)為另兩種方法所不能得，因此SFE法可在某些生產(chǎn)需要中代替?zhèn)鹘y(tǒng)SD法。由于不同提取方法所得的高良姜揮發(fā)性成分具有多樣性，高良姜產(chǎn)業(yè)化中各產(chǎn)品應(yīng)根據(jù)具體的實(shí)際功效需求選擇不同提取方法加以開發(fā)利用。

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Analysis of Volatile Oils in Rhizoma Alpiniae Officinarum by GC-MS and Retention Index

YUAN Yuan,ZHOU Wei*，F(xiàn)U Yun-fei，LIN Li-jing，HUANG Xiao-bing，LI Ji-hua

(1.Agricultural Product Processing Research Institute of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences,Zhanjiang524001,China；2.Key Laboratory of Ministry of Agriculture for Tropical Crop Processing,Zhanjiang524001,China)

A gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS) combined with retention index(RI) method was developed for the analysis of volatile oils inRhizomaAlpiniaeOfficinarum extracted by steam distillation(SD),ultrasonic assisted solvent extraction(UAE) and subcritical fluid extraction(SFE).51,46 and 60 volatile components in the oils extracted by the three above-mentioned methods were identified,respectively.Meanwhile,each of them was quantified by area normalization method.The results indicated that the content of the index constituent,i.e.,1,8-cineole,the content by SD was similar to that by SFE,and higher than that by UAE.Although UAE was time-saving and less energy consumption,the oil quality was poorer due to the use of organic solvents hard to remove.In addition,some constituents could be gained by SFE but not by SD,such as 2-hydroxycineole,diarylheptanoids and etc.On one hand,the relative contents of high boiling components obtained by SFE,likeβ-caryophyllene,α-caryophyllene,α-farnesene andγ-cadinene,were higher than the others.On another hand,the relative contents of low boiling components obtained by SD,likeα-pinene,camphene,β-pinene,limonene,camphor andα-terpineol,were the highest of three.In conclusion,volatile oil components by different extraction methods from the same batch of materials were proved broadly similar,but there were some differences in composition and component ratio.Therefore,development and utilization of different extraction methods must be selected according to the functional requirements of products.

volatile oil;gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS)；steam distillation；ultrasonic assisted solvent extraction；subcritical fluid extraction

2015-10-28；

2015-12-10

海南省自然科學(xué)基金(20153054)；廣東省湛江市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014C1005)

周偉,碩士，助理研究員，研究方向：熱帶作物的應(yīng)用基礎(chǔ)，Tel:0759-2221090，E-mail:1274044249@qq.com

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.06.010

O657.63;TQ460.72

A

1004-4957(2016)06-0692-06