李景喜，趙金泉，尹曉斐，孫承君，陳軍輝，鄭　立，王小如

(1.國家海洋局　第一海洋研究所　海洋生態(tài)研究中心，山東　青島　266061；2.青島大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，山東　青島　266021)

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基于準確質(zhì)量數(shù)對肽族[γ-(Glu-Cys)n-Gly]色譜-質(zhì)譜分析研究

李景喜1*，趙金泉1,2，尹曉斐1，孫承君1，陳軍輝1，鄭立1，王小如1

(1.國家海洋局第一海洋研究所海洋生態(tài)研究中心，山東青島266061；2.青島大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，山東青島266021)

基于多肽γ-(Glu-Cys)n-Gly系列化合物合成的遞增規(guī)律性，利用Trap-MS離子篩選功能實現(xiàn)多肽的定性定量分析。首先利用多肽分子中巰基與單溴二胺(mBBr)發(fā)生縮合反應(yīng)，生成具有熒光信號的多肽衍生物，比較衍生化前后分子量發(fā)現(xiàn)多肽與mBBr的反應(yīng)比例為1∶1，熒光信號強度1周內(nèi)穩(wěn)定性較好。優(yōu)化了色譜分離及質(zhì)譜條件，建立了HPLC-Trap-MS定性定量分析方法，離子提取結(jié)果顯示:多肽化合物基于其理論分子量定性分析準確快速，化合物分離效果明顯，PC2,PC3,PC4,PC5和PC6系列標準溶液的線性范圍寬，相關(guān)系數(shù)(r)大于0.999，各化合物的方法檢出限分別為0.13，0.02，0.17，0.39，0.82 mg/L，化合物的回收率為89.0%～99.5%；相對標準偏差(RSD)小于3.5%；多肽化合物的熒光標記和Trap-MS篩選可實現(xiàn)熒光與質(zhì)譜雙重檢測器的定量分析，該方法可對多肽系列化合物進行快速、準確的測定。檢測了Zn和Cd誘導(dǎo)后藻體中多肽的含量變化，結(jié)果顯示藻體中的多肽對金屬具有誘導(dǎo)響應(yīng)，其中小分子肽變化相對明顯，隨著碳鏈的增加，多肽對重金屬的誘導(dǎo)響應(yīng)滯后。

多肽；熒光標記；高效液相色譜；質(zhì)譜表征；離子提取

多肽化合物(Phytochelatins，PCs)是由半胱氨酸、谷氨酸和甘氨酸組成的多肽，其分子量范圍為2～4 kDa，化學(xué)通式為(γ-Glu-Cys)n-Gly(n=2～11)[1-2]。PCs是特殊的金屬巰蛋白，廣泛分布于植物體內(nèi)，但PCs不是結(jié)構(gòu)基因的直接產(chǎn)物，而是在重金屬離子刺激下，以GSH為底物合成的酶促產(chǎn)物[3-5]。植物體內(nèi)PCs化合物的存在可以提高其對重金屬元素的耐性和降低重金屬對植物體本身的毒害作用，當金屬離子在植物體內(nèi)積累量較高時，PCs可使得金屬離子排出[6-7]，另外，植物體內(nèi)的PCs還具有維持和調(diào)節(jié)金屬離子平衡以及抗氧化等功能[8-12]。

多肽PCs在生物修復(fù)重金屬污染環(huán)境中的應(yīng)用前景已引起人們的關(guān)注，PCs在環(huán)境重金屬污染監(jiān)測和生態(tài)恢復(fù)方面具有較大的應(yīng)用潛力。Gawei等[13]認為，多肽PCs可作為工業(yè)區(qū)森林退化的判斷依據(jù)，通過分析試驗區(qū)樹木中PCs的濃度，發(fā)現(xiàn)重金屬脅迫是森林退化的重要原因，并且樹木體內(nèi)PCs含量與森林衰敗率之間具有很高的相關(guān)性[14]。目前，隨著海洋環(huán)境中污染物分析的痕量化、多樣化，蛋白及多肽技術(shù)為海洋污染提供了新的思路和技術(shù)支持，蛋白及多肽組學(xué)技術(shù)對于低濃度、低脅迫、多應(yīng)激反應(yīng)機制誘導(dǎo)有新的突破[15-16]。其中，海藻在重金屬脅迫下的抗逆性研究是環(huán)境科學(xué)研究的重點和熱點之一，由于海藻體內(nèi)多肽的含量與海洋環(huán)境中重金屬濃度有一定相關(guān)性，能作為海洋環(huán)境中污染物暴露和毒性效應(yīng)早期預(yù)警的有效生物標志物，可廣泛用于海洋污染的監(jiān)測[17-18]，因此，研究海藻中多肽對重金屬的誘導(dǎo)響應(yīng)，可為海洋環(huán)境監(jiān)測和評價提供基礎(chǔ)理論和技術(shù)支撐，建立多肽化合物的準確定性定量分析方法是研究多肽化合物的關(guān)鍵之一。

據(jù)近年來的文獻報道[19-20]，測定PCs的方法主要包括高效液相色譜法、電化學(xué)法、電泳法等[21-22]，但多數(shù)集中在小肽化合物分析，關(guān)于多肽系列化合物的分析較少，特別是海藻中多肽檢測的研究報道甚少。本研究基于多肽PC2～PC6中的富有巰基(—SH)官能團與單溴二胺(mBBr)衍生化反應(yīng)，生成具有熒光特性衍生物，衍生化后的多肽巰基可被保護；對衍生化后的多肽化合物利用HPLC-Trap-MS進行測定，利用質(zhì)譜離子提取功能并基于多肽分子量進行定性分析，通過各化合物的離子強度實現(xiàn)定量測定，建立了一種多肽系列化合物快速篩選、準確測定的方法。該法彌補了多種多肽化合物缺少標準品或研制成本高的弊端(如PCn，n≥7)，適用于復(fù)雜基質(zhì)中多肽的定性測定；衍生物的熒光標記和熒光強度穩(wěn)定，可實現(xiàn)多肽的熒光和質(zhì)譜(HPLC-Trap-MS)聯(lián)機雙重檢測器同時定量檢測，提高多肽化合物定量測定的準確度；另外，研究通過重金屬誘導(dǎo)，初步探索了多肽化合物PC2～PC6對重金屬的誘導(dǎo)響應(yīng)，研究了多肽間對單一和雙金屬誘導(dǎo)響應(yīng)差異性，為進一步深入研究藻體中多肽化合物對環(huán)境中重金屬的誘導(dǎo)機制奠定了基礎(chǔ)。

1　實驗部分

1.1儀器與試劑

高效液相色譜儀(Agilent 1200)，配有熒光檢測器；離子阱質(zhì)譜儀(Agilent Ion Trap LC-MS 6320)，配有電噴霧(ESI)離子源；冷凍干燥機(德國 Christ ALPHA 1-4 LSC)；電子天平、高速萬能粉碎機等。

單溴二胺(mBBr,>95%)、甲磺酸(MSA，>99%)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA，>99%)為Fluka公司產(chǎn)品；PC2，PC3，PC4，PC5和PC6標準品(純度≥95%，ANASPEC公司)；N-(2-羥乙基)哌嗪-N-3-丙磺酸(HEPPS，>99.5%)和三氟乙酸(TFA，99%)購于上海信裕生物科技有限公司；乙腈(色譜純,Lab-Scan)；超純水(18.2 MΩ·cm)。

1.2實驗方法

1.2.1標準品的配制采用0.1% TFA(含6.3 mmol/L DTPA)水溶液配制1 g/L PC2，PC3，PC4，PC5和PC6的儲備液，4 ℃保存。用0.1%TFA(含6.3 mmol/L DTPA)稀釋多肽儲備液，配制GSH，PC2，PC3，PC4，PC5和PC6的混合標準溶液系列，各化合物的濃度范圍為0.1～100 mg/L。標準品配制完成后立即進行柱前衍生化反應(yīng)。

mBBr用100%乙腈配成25 mmol/L，振蕩混勻，4 ℃避光保存，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.2色譜-質(zhì)譜條件色譜柱:Zorbax SB-C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)；柱溫26 ℃；熒光檢測器條件:激發(fā)波長為380 nm，發(fā)射波長為470 nm；流動相:A為含0.1% TFA的水溶液，B為100%乙腈；梯度洗脫∶12%～21%B(13 min)，21%B(7 min)，21%～23%B(5 min)，23%～25%B(5 min)，25%～100%(10 min)，100%～12%(2 min)；100%B洗柱(5 min)。流速0.5 mL/min；進樣量20 μL。

質(zhì)譜掃描模式:正離子模式；干燥器溫度:350 ℃；干燥氣體流速:10 L/min；霧化氣壓力:25 psi；毛細管電壓:4 500 V；裂解電壓:120 V。

1.2.3衍生化反應(yīng)衍生化反應(yīng):取250 μL多肽標準(或樣品)溶液，加入450 μL濃度為 200 mmol/L的 HEPPS(含6.3 mol/L DTPA，pH 8.2)溶液，充分混勻，常溫避光溫育10 min，加入10 μL 25 mmol/L的 mBBr溶液，充分混勻，45 ℃避光反應(yīng)30 min后，加入300 μL 1 mol/L的 MSA旋渦振蕩搖勻，終止反應(yīng)。同時作試劑衍生化空白；反應(yīng)液于4 ℃避光保存，直至分析測定。

2　結(jié)果與討論

2.1多肽合成機理與分子量鑒定

多肽化合物是由植物螯合肽合成酶(γ-谷氨酰半胱氨酸二肽基轉(zhuǎn)肽酶)催化合成，合成過程為:多肽合成酶的結(jié)構(gòu)中C端有信號檢測域，N端有激活域，當沒有金屬離子(如Cd2+和Zn2+等)存在的條件下，檢測域(C端)沒有觸發(fā)信號，致使激活域(N端)無酶活性；當有金屬離子存在時，信號檢測域(C端)會感應(yīng)到其信號，此時多肽酶與金屬離子、Cys結(jié)合，致使激活域(N端)有催化活性；在激活域(N端)，一分子的GSH在多肽合成酶催化作用下與另一個GSH分子合成PC2化合物，PC2再與1個GSH結(jié)合相繼生成PC3，這一過程不斷重復(fù)直至反應(yīng)生成多肽PCn+1系列化合物。因此，多肽化合物具有一定分子通式，分子式為γ-(Glu-Cys)n-Gly，其中n=2～12，通過計算可以獲得多肽的理論分子量，如表1所示。

表1　多肽化合物分子量測定

多肽PCs富含多個巰基，利用mBBr分子中Br原子與多肽分子中巰基進行縮合反應(yīng)，衍生化生成具有一定熒光強度的多肽衍生物；取PC2,PC3,PC4,PC5和PC6標準溶液，加入mBBr進行衍生化反應(yīng)，利用HPLC-Trap-MS聯(lián)用測定每種衍生產(chǎn)物的分子量，同時，直接測定PC2,PC3,PC4,PC5和PC6化合物衍生前的分子量；通過比對標記前后PCs及其衍生物的分子量(表1)發(fā)現(xiàn)，利用Trap-MS方法測定多肽的分子量較為準確，誤差約在±1范圍內(nèi)，計算各衍生產(chǎn)物與各PCs的分子量差，其值為190.0±0.2，此差值與一分子mBBr脫去Br原子后的分子量相吻合(mBBr的理論分子量為271.0),說明多肽與mBBr遵循1∶1反應(yīng)比例關(guān)系。

2.2mBBr標記多肽穩(wěn)定性

多肽衍生化反應(yīng)比例具有穩(wěn)定性，為了考察熒光試劑用量對衍生物熒光信號的影響，移取50 μL 5 g/L的PC2，PC3，PC4，PC5及PC6單一標準溶液，固定多肽化合物量，分別加入5，10，20，50 μL的 25 mmol/L mBBr進行衍生化反應(yīng)，不同時間內(nèi)測定衍生物的熒光信號。結(jié)果發(fā)現(xiàn)(以PC3為例)，多肽衍生物一周之內(nèi)的熒光信號強度穩(wěn)定，并且化合物間的相對含量對化合物無影響，過量的mBBr會稍微影響衍生物的熒光強度，因此選擇10 μL衍生劑進行實驗。

2.3多肽的質(zhì)譜定性定量分析

2.3.1HPLC-Trap-MS的多肽篩選定性分析以海帶漿液作為基體背景，加入多肽化合物后用mBBr標記衍生化反應(yīng)，優(yōu)化色譜分離條件。圖1為Trap-MS測定樣品的總離子流圖，譜圖顯示化合物的吸收峰較多，為了驗證離子提取法定性分析的可行性，利用質(zhì)譜附帶軟件，基于多肽衍生物的理論分子量進行離子提取，結(jié)果如圖2所示。在不同的出峰時間出現(xiàn)相應(yīng)的PCs化合物，通過選擇離子譜圖可見化合物間的分離效果較好，因此，基于多肽的理論分子量能夠?qū)崿F(xiàn)多肽化合物的定性分析。

2.3.2多肽的定量分析配制PC2，PC3，PC4，PC5和PC6化合物混合標準溶液系列，濃度范圍為0～100 mg/L。多肽化合物衍生化反應(yīng)后，HPLC-Trap-MS進行測定，質(zhì)譜離子提取軟件確定各化合物并計算各組分的峰面積，以峰面積為縱坐標(y)，濃度為橫坐標(x，mg/L)繪制標準曲線。同時，以儀器信噪比S/N=3確定各成分的檢出限(表2)。結(jié)果顯示，PC2，PC3，PC4，PC5和PC65種物質(zhì)的濃度與峰面積均具有良好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)(r)均達到0.999以上，方法檢出限為0.02～0.82 mg/L。

表2　5種化合物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

配制濃度為10 mg/L的多肽混合溶液，通過衍生化反應(yīng)后，利用本方法重復(fù)測定6次，考察方法的準確度及精密度，并將測定結(jié)果與溶液濃度標準值進行比較。結(jié)果顯示。PCs各組分的回收率為89.0%～99.5%，相對標準偏差(RSD)均小于3.5%，表明該方法能夠?qū)崿F(xiàn)PCs化合物的定量分析。其他多肽PCn(n≥7)化合物在生物體內(nèi)的含量較低，目前缺少相應(yīng)的標準品，且該組分化合物標準品的研發(fā)成本較高，利用本文建立的離子提取定性定量分析方法能夠?qū)崿F(xiàn)高分子多肽的半定量分析，可為多肽在生物體中的作用研究提供技術(shù)支撐。

2.4多肽化合物隨重金屬誘導(dǎo)的變化趨勢

2.4.1單元素Zn與Cd誘導(dǎo)藻體內(nèi)多肽測定了利用0.1 mmol/L的ZnCl2和CdCl2單元素誘導(dǎo)后海帶中多肽的含量，考察了海帶中多肽化合物對Zn和Cd的誘導(dǎo)響應(yīng)(表3)。從表中數(shù)據(jù)可以看出，誘導(dǎo)后藻體中多肽化合物PC2～PC6的濃度存在一定的差異性，濃度達到mg/g數(shù)量級，經(jīng)過Zn和Cd元素誘導(dǎo)后，多肽化合物的濃度變化范圍較小，PC2，PC3和PC4含量呈增加趨勢，其中PC3濃度變化幅度最大，Zn誘導(dǎo)后藻體中PC3的含量最大差值約0.59 mg/g，Cd誘導(dǎo)PC3的含量最大差值為0.19 mg/g，從變化趨勢可看出，PC3和PC4的變化稍微滯后。

表3海帶中PCs含量隨Zn,Cd誘導(dǎo)時間的變化規(guī)律

Table 3The variation of PCs induced by Zn and Cdw/(mg·g-1)

2.4.2Zn與Cd共同誘導(dǎo)多肽通過0.1 mmol/L ZnCl2和0.1 mmol/L CdCl2協(xié)同誘導(dǎo)海帶，考察了多元素誘導(dǎo)過程中藻體內(nèi)多肽化合物的變化趨勢(表3)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)相同濃度的Zn和Cd共同誘導(dǎo)海藻后，海藻中多肽化合物的濃度變化趨勢相對復(fù)雜，PC2，PC3和PC4的含量呈稍微增加趨勢，但變化規(guī)律不明顯，PC5和PC6的濃度也稍有變化，但趨勢不顯著。多肽對多元重金屬的誘導(dǎo)響應(yīng)變化趨勢還需獲得批量的誘導(dǎo)數(shù)據(jù)，利用統(tǒng)計學(xué)方法統(tǒng)計，進一步探索多肽化合物在重金屬誘導(dǎo)過程中的響應(yīng)，該工作也是今后重金屬誘導(dǎo)和多肽響應(yīng)機制的研究重點和難點之一。

3　結(jié)　論

多肽化合物的分子結(jié)構(gòu)具有遞增規(guī)律性，且多肽富含巰基，本研究利用單溴二胺(mBBr)進行熒光標記，由于肽鏈上基團存在空間位阻作用，多個巰基不能和mBBr發(fā)生縮合反應(yīng)，致使多肽和mBBr反應(yīng)比例為1∶1，短期熒光強度測定結(jié)果顯示衍生物的穩(wěn)定性較好；Trap-MS測定多肽化合物分子量的方法精確度較高，分子量測量誤差在±1范圍內(nèi)，通過離子提取能夠?qū)崿F(xiàn)多肽化合物的分離和定性分析，基于各化合物的離子強度定量測定時，其線性較好，檢出限較低，該方法可實現(xiàn)多肽在復(fù)雜基質(zhì)條件下的檢測。基于mBBr標記多肽生成具有熒光信號的衍生物，HPLC-Trap-MS聯(lián)機技術(shù)可以實現(xiàn)熒光和質(zhì)譜雙重檢測器的定量分析，為多肽的準確定量分析提供了新技術(shù)；Zn和Cd誘導(dǎo)海藻內(nèi)多肽生成的過程中，多肽系列化合物呈不同程度的變化趨勢，其中小肽組分的響應(yīng)較快，變化幅度相對較大，隨著肽鏈的增長，多肽的誘導(dǎo)響應(yīng)滯后，海藻內(nèi)多肽對多元金屬的誘導(dǎo)變化復(fù)雜，需進一步進行海藻批量脅迫誘導(dǎo)和統(tǒng)計分析研究。該研究為深入探討海藻中多肽對重金屬的脅迫響應(yīng)，以及多肽的變化致使海藻對重金屬的富集和耐毒性研究提供了理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

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Analysis of Peptide[γ-(Glu-Cys)n-Gly]by HPLC-Trap-MS Based on Accurate Mass Number

LI Jing-xi1*,ZHAO Jin-quan1,2,YIN Xiao-fei1,SUN Cheng-jun1,CHEN Jun-hui1,ZHENG Li1,WANG Xiao-ru1

(1.Marine Ecology Research Center,First Institute of Oceanography of State Oceanic Administration,Qingdao266061，China;2.College of Public Health of Qingdao University,Qingdao266021，China)

Based on the incremental regularity ofγ-(Glu-Cys)n-Gly series compouds,the qualitative and quantitative analyses of peptides were achieved by using Trap-MS ion screening function.The thiol groups(—SH) of PC2-PC6could react with the monobromobimane(mBBr) to get polypeptide derivatives with fluorescent signal,and the reaction proportion of PCs and mBBr was 1∶1 identified by Trap-MS,which also showed that the intensity of the polypeptide derivatives was stable in 1 week.HPLC-Trap-MS and the chromatographic conditions of HPLC were optimized.The ion extraction results showed that the method was rapid and accurate,and the compound separation effect was obvious,PC2,PC3,PC4,PC5and PC6had wide linear ranges with linear correlation coefficients more than 0.999,and the detection limits were 0.13,0.02,0.17,0.39,0.82 mg/L,respectively.The recoveries were in the range of 89.0%-99.5%,and the method was reproducible with RSDs less than 3.5%.The quantitative analysis under the double detectors of the fluorescence and the mass spectrum could be realized by the fluorescence labeling and Trap-MS screening of peptide compound,which could be used to analyse polypeptide compounds rapidly and accurately.The content of polypeptide in alga was detected after being induced by Zn and Cd,and the results showed that the polypeptide had an induced response to the metal,in which the small molecular peptide changed obviously,the induced response of peptide to the heavy metal was delayed with the increase of the carbon chain.

polypeptide;fluorescence labeling;HPLC;mass spectrometric characterization;ion extraction

2015-10-29；

2015-12-14

國家青年自然科學(xué)基金(41106111/41306074)；孫承君-2012泰山學(xué)者海外人才項目；國家基金委-山東省聯(lián)合基金項目(U1406403)

李景喜，博士，助理研究員，研究方向:海洋化學(xué)，Tel:0532-88967105，E-mail:jxli@fio.org.cn

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.06.006

O657.63;O629.7

A

1004-4957(2016)06-0668-06