余衛(wèi)軍，王　佩，邱月升，容敏賢，鄧　紅

(南方醫(yī)科大學　公共衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學學院　營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學系，廣東　廣州　510515)

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氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用法檢測市售臘腸中9種揮發(fā)性亞硝胺

余衛(wèi)軍，王佩，邱月升，容敏賢，鄧紅*

(南方醫(yī)科大學公共衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學系，廣東廣州510515)

采用QuEChERS方法對市售臘腸中的N-亞硝基二甲胺(NDMA)、N-亞硝基二乙胺(NDEA)、N-亞硝基甲乙胺(NMEA)、N-亞硝基二丙胺(NDPA)、N-亞硝基吡咯烷(NPYR)、N-亞硝基哌啶烷(NPIP)、N-亞硝基二丁胺(NDBA)、N-亞硝基嗎啉(NMOR)、N-亞硝基二苯胺(NDPhA)9種對人體有致癌活性的揮發(fā)性亞硝胺進行分離凈化，氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS/MS)檢測。最佳實驗條件下，9種揮發(fā)性亞硝胺的線性范圍為0.25～200 μg/L，檢出限為0.01～0.10 μg/kg，加標回收率為90.7%～116.0%，相對標準偏差(RSD)為1.8%～14.0%。市售臘腸樣品中NDMA，NMOR，NPYR，NDPA，NPIP，NDBA，NDPhA均有不同程度的檢出，總揮發(fā)性亞硝胺的含量為1.85～13.44 μg/kg。該方法靈敏度高、操作簡單，適合批量樣品的快速檢測。

揮發(fā)性亞硝胺；氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用；臘腸

N-亞硝胺類化合物是食物中危害性極高的化合物之一,一次或多次攝入過量的含亞硝胺類化合物的食物后，可引起急性毒性，主要為破壞血小板及損傷肝臟，以N-亞硝基二甲胺(NDMA)為例的急性毒性實驗中，大鼠的經(jīng)口半數(shù)致死含量(LD50)為27～41 mg/kg[1]。許多國家和地區(qū)的流行病學調(diào)查表明，食用咸魚和腌制食品中高濃度的揮發(fā)性亞硝胺是患鼻咽癌的高危因素[2-3]。1987年國際癌癥研究機構(gòu)(IARC)將亞硝胺定義為有強致癌性的食物污染物，NDMA和N-亞硝基二乙胺(NDEA)被列為2A類致癌物，具有潛在的致癌性，其他亞硝胺為2B級，是可能的致癌物[4]。食品是人體攝入亞硝胺的重要來源，其中我國《食品中污染物限量》(GB 2762-2012)規(guī)定肉制品中的NDMA不超過3 μg/kg。

廣州市居民素有喜食動物性腌制食品的飲食習慣，其中臘腸的市場比例更高達80%左右，因此本研究選取廣州市居民消費量大的市售臘腸為研究對象，分析其中揮發(fā)性亞硝胺的人體暴露風險。關(guān)于肉制品中揮發(fā)性亞硝胺的檢測，目前的提取凈化方法有水蒸氣蒸餾[5-7]、固相萃取[8-9]等，由于肉制品中揮發(fā)性亞硝胺的含量一般為10-9水平且基質(zhì)復雜，因此對樣品前處理和儀器分析技術(shù)要求較高。GC-TEA對N-亞硝胺化合物的檢測具有強選擇性和高靈敏度[10-13]的特點，已被眾多權(quán)威標準所采用，但TEA檢測器的應用范圍狹窄，且造價昂貴，普適性差。GC-MS/MS是高靈敏度和普適性較好的檢測方法，目前已有研究應用GC-MS/MS對肉制品中的N-亞硝胺進行分析[14]，效果較好。本研究采用QuEChERS方法對市售臘腸中的9種揮發(fā)性亞硝胺進行分離、凈化，再用氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS/MS)對其進行定性定量分析，避免了傳統(tǒng)方法的樣品前處理復雜、耗時、可操作性差等問題，取得了較好的效果。

1　實驗部分

1.1儀器設備

氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀(7000A GC/MS Triple Quad，美國安捷倫公司)，CP100WX高速冷凍離心機(日本日立公司)，VORTEX-2 GENE旋渦混勻器(美國Scientific 公司)、MTN-2800W氮吹儀(天津奧特賽恩斯公司)、 AL104電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。

1.2試劑與材料

9種揮發(fā)性亞硝胺(NDMA,NDEA,NMEA,NDPA,NPYR,NPIP,NDBA,NMOR,NDPhA)的混合標準品購于美國Sigma公司(濃度均為2 000 mg/L)；內(nèi)標N-亞硝基二甲胺-D6(NDMA-D6)和N-亞硝基二丙胺-D14(NDPA-D14)購于德國CNW公司(濃度均為1 000 mg/L)；陶瓷均質(zhì)子、QuEChERS萃取包(包含4 g硫酸鎂和1 g氯化鈉)、QuEChERS基質(zhì)分散凈化包(包含50 mg N-丙基乙二胺固相吸附劑(PSA)、150 mg C18反向吸附劑和900 mg硫酸鈉)均購自美國Agilent公司；乙腈(色譜純，德國CNW公司)，實驗用水經(jīng)Milli-Q超純水系統(tǒng)過濾。市售臘腸樣品均于2015年2月采集于廣州市大型超市或農(nóng)貿(mào)市場，共15份代表性樣品，并在24 h內(nèi)帶回實驗室，-20 ℃冰箱冷藏待測。

1.3標準溶液的制備

準確吸取一定體積的9種亞硝胺混合標準溶液，用乙腈定容至1 mL得到200 mg/L的混合標準儲備液，于-20 ℃儲存。準確吸取一定體積的混合標準儲備液，以乙腈為溶劑逐級稀釋成0.25，0.5，2.5，5.0，10，25，50，200 μg/L系列濃度的混合亞硝胺標準溶液，內(nèi)標濃度均為10 μg/L。

1.4樣品前處理

樣品經(jīng)液氮處理后，用粉碎機攪碎，稱取10 g均質(zhì)樣品，加入適量內(nèi)標(NDMA-D6和NDPA-D14，濃度均為2 μg/L)，再加入10 mL乙腈，渦旋混勻，于-20 ℃冰箱中冷凍30 min，加入2個陶瓷均質(zhì)子和bond elut QuEChERS 萃取鹽，迅速振蕩30 s，8 000 r/min于0 ℃低溫離心10 min，取上清液6 mL加至15 mL bond elut QuEChERS 基質(zhì)分散凈化管中，渦旋1 min，于0 ℃8 000 r/min離心10 min，取5 mL上清液在室溫下氮吹濃縮至1 mL，過 0.2 μm針頭式濾膜，待測。

1.5儀器分析

1.5.1色譜條件采用DB-WAXETR(30 m×0.25 μm×0.25 μm)對目標物進行分析；升溫程序：起始柱溫為50 ℃，保留1 min，以10 ℃/min升至110 ℃，再以15 ℃/min升至200 ℃，然后以4 ℃/min升至280 ℃，保留13.75 min；進樣口溫度為250 ℃；進樣體積為2 μL，采用不分流進樣；載氣為高純氮氣，柱流量：1.2 mL/min。

1.5.2質(zhì)譜條件采用電子轟擊離子源(EI)，電離能量70 eV，溶劑延遲2 min，離子源溫度為230 ℃，四極桿溫度為150 ℃，SRM多反應監(jiān)測模式。9種揮發(fā)性N-亞硝胺的保留時間及質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

表1　9種揮發(fā)性亞硝胺的保留時間、定量定性離子對和碰撞能量(CE)

2　結(jié)果與討論

2.1樣品前處理的優(yōu)化

肉制品中揮發(fā)性亞硝胺的常用提取方法有蒸餾法[5-7]和固相萃取法[8-9]，傳統(tǒng)的提取方法存在回收率差、前處理耗時、耗費大量有機溶劑、操作繁瑣、樣品用量大以及不利于批量處理等缺點。本實驗采用QuEChERS方法結(jié)合氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用法檢測市售臘腸中9種揮發(fā)性亞硝胺，該前處理方法具有快速，簡便，有機溶劑使用量較少，有利于批量處理等優(yōu)點，回收率為90.7%～116.0%，符合檢測要求。

本研究采用乙腈作為提取溶劑，可同時去除臘腸樣品中油脂等雜質(zhì)和沉淀蛋白質(zhì)[15]?？紤]到臘腸樣品中的亞硝胺含量低，本研究將上清提取液直接上機，優(yōu)化成取5 mL提取溶液常溫氮吹濃縮至1 mL后上機，改進后方法檢出限理論上降低為未濃縮直接上機的1/5。本實驗選取1種臘腸，分別添加不同濃度(相當于10 g樣品中添加1.5，3.0，10 μg/kg)的亞硝胺混合標準溶液后，按照上述樣品制備方法處理，3次重復試驗取平均值，扣除樣品空白試驗中亞硝胺含量。結(jié)果如表2所示，其加標回收率為90.7%～116.0%，相對標準偏差(RSD)為1.8%～14.0%。由此可見，用該前處理方法對肉制品中9種揮發(fā)性亞硝胺進行分離凈化和富集具有良好的回收率和重復性。

表2　市售臘腸中9種揮發(fā)性亞硝胺的回收率和相對標準偏差(n=3)

* no detected

2.2儀器條件的優(yōu)化

分別考察不同儀器(超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLC-MS/MS)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS/MS))分析檢測目標亞硝胺的靈敏度是否滿足檢測需求。UPLC-MS/MS用ESI源調(diào)諧，發(fā)現(xiàn)重點關(guān)注的亞硝胺(如NDMA)響應值極低，無法滿足檢出限要求，而GC-MS(EI源)調(diào)諧發(fā)現(xiàn)亞硝胺(如NDMA)檢出限欠佳，靈敏度不理想，而用GC-MS/MS(EI源)調(diào)諧時靈敏度符合檢測要求，因此選用GC-MS/MS(EI源)進行檢測。進一步考察不同極性色譜柱：非極性色譜柱(DB-5，(5%-苯基)-甲基聚硅烷)和極性色譜柱(DB-WAXETR，聚乙二醇(PEG))對9種揮發(fā)性亞硝胺的色譜分離效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用DB-5時色譜峰拖尾，而選用極性色譜柱(DB-WAXETR)時各組分的色譜峰尖銳對稱，滿足方法學要求。在“1.5”所述條件下，對9種揮發(fā)性N-亞硝胺混合標準溶液進行分析，得到標準品的總離子流圖(見圖1)，實現(xiàn)了對9種揮發(fā)性亞硝胺的良好分離。

2.3線性范圍與檢出限

配制一系列質(zhì)量濃度分別為0.25,0.5,2.5,5.0,10,25,50,200 μg/L的標準工作溶液，在選定的色譜及質(zhì)譜條件下進行測定，以定量離子對的峰面積與內(nèi)標定量離子對的峰面積之比(Y)為縱坐標，以質(zhì)量濃度(X，μg/L)為橫坐標進行線性回歸。結(jié)果顯示，在0.25～200 μg/L范圍內(nèi)，9種待測物與對應響應值呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)不低于0.999 8。根據(jù)3倍信噪比(S/N)和10倍S/N，得出9種揮發(fā)性亞硝胺的儀器檢出限和定量下限(表3)?！禛B-T5009.26-2003食品中N-亞硝胺類的測定》中要求方法檢出限為1.0 μg/kg，本實驗方法靈敏度高可以滿足臘腸中9種揮發(fā)性亞硝胺檢測要求。由于揮發(fā)性亞硝胺含量在肉質(zhì)品中含量為10-9水平，低的檢出限能更好的監(jiān)測肉制品中揮發(fā)性亞硝胺水平。

表3　9種揮發(fā)性亞硝胺化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限及定量下限

2.4實際樣品的分析

采用本方法對15個不同種類的市售臘腸進行檢測，結(jié)果7種揮發(fā)性亞硝胺(NDMA，NMOR，NPYR，NDPA，NPIP，NDBA和NDPhA)均有檢出，其中NDMA檢出量為0.20～6.14 μg/kg，NMOR為0.07～1.78 μg/kg，NPYR為n.d.～4.92 μg/kg，NDPA為n.d.～3.05 μg/kg，NDBA為n.d.～0.20 μg/kg，NPIP為n.d.～1.05 μg/kg，NDPhA為n.d.～2.17 μg/kg;其中以NDMA，NMOR，NPYR和NDPA的檢出率較高，其檢出率大于80%，實驗結(jié)果與文獻[14]接近。且33%的市售臘腸樣品(5份)中NDMA含量超過我國肉制品限量標準(NDMA≤3 μg/kg)，分別為3.05，3.59，4.57，5.87，6.14 μg/kg。

以樣品中9種揮發(fā)性亞硝胺含量總和為總揮發(fā)性亞硝胺含量，得到樣品的總揮發(fā)性亞硝胺含量為1.85～13.44 μg/kg。目前我國尚無總揮發(fā)性亞硝胺的含量標準，參照2005年美國農(nóng)業(yè)部規(guī)定食品中總揮發(fā)性亞硝胺不能超過10 μg/kg，而本研究中有2個樣品的總揮發(fā)性亞硝胺含量已超過10 μg/kg，其值分別為13.21 μg/kg和13.44 μg/kg。圖2為某市售臘腸樣品的總離子流圖。

3　結(jié)　論

本文采用QuEChERS/GC-MS/MS對肉制品中9種揮發(fā)性亞硝胺進行分析，優(yōu)化了提取凈化方法，并通過濃縮降低了檢出限。該方法樣品前處理成本較低，簡便快速，靈敏可靠，適用于臘腸中揮發(fā)性亞硝胺的篩查和定量分析，便于市售臘腸樣品中亞硝胺檢測的推廣應用。

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Determination of Nine Volatile Nitrosamines in Local Sausage on Sale by Gas Chromatography Tandem Triple Quadrupole Mass Spectrometry

YU Wei-jun，WANG Pei,QIU Yue-sheng,RONG Min-xian,DENG Hong*

(Department of Nutrition and Food Hygiene,School of Public Health and Tropical Medicine,Southern Medical University,Guangzhou510515,China)

A selective gas chromatography tandem triple quadrupole mass spectrometry was used to detect nine volatile nitrosamines,including N-nitrosodimethylamine(NDMA),N-nitrosodiethylamine(NDEA),N-nitrosomethylethylamine(NMEA),N-nitrosodipropylamine(NDPA),N-nitrosopyrrolidine(NPYR),N-nitrosopiperidine(NPIP),N-nitrosodibutylamine(NDBA),N-nitrosomorpholine(NMOR),N-nitrosodiphenylamine(NDPhA) in local sausage on sale by using QuEChERS sample pretreatment.The calibration curves of nine volatile nitrosamines were linear in the range of 0.25-200 μg/L,with detection limits of 0.01-0.10 μg/kg.The recoveries were in the range of 90.7%-116.0% at three spiked concentration levels in sample,with relative standard deviations(RSDs) of 1.8%-14.0%.The method was applied in the detection of local sausage on sale,and seven volatile nitrosamines were all detected.The detection rates of NDMA，NMOR，NPYR，NDPA were higher than that of the others.The contents of total volatile nitrosamines were in the range of 1.85-13.44 μg/kg.The developed method was simple,rapid,sensitive and accurate.Key words：volatile nitrosamines；gas chromatography tandem triple quadrupole mass spectrometry；local sausage

2016-03-08；

2016-04-23

國家自然科學基金(81373008)

鄧紅，博士，副教授，研究方向：營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學，Tel：020-62789446，E-mail：1792835456@qq.com

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.06.015

O657.63;O623.732

A

1004-4957(2016)06-0719-05