陳　鎮(zhèn)，崔海霞，申　佳，何楓潔，丁　露，劉慧龍，熊興良

(重慶醫(yī)科大學(xué)　生物醫(yī)學(xué)工程研究室，重慶　400016)

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功能化納米金比色檢測水中Cr3+

陳鎮(zhèn)，崔海霞，申佳，何楓潔，丁露，劉慧龍，熊興良*

(重慶醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程研究室，重慶400016)

采用檸檬酸鈉還原法制備粒徑13 nm的金納米顆粒(AuNPs)作為比色信號報告分子,3-氨基-5-巰基-1,2,4-三唑(AMT)作為Cr3+的識別分子，構(gòu)建了一種水中Cr3+的比色傳感檢測方法。將AMT修飾于AuNPs表面，形成穩(wěn)定的AMT-AuNPs水溶復(fù)合物；根據(jù)AMT與Cr3+之間的特異性結(jié)合，引起溶液中AMT-AuNPs聚集，進而導(dǎo)致溶液顏色由紅色變?yōu)樗{紫色以及最大吸收峰紅移的現(xiàn)象，實現(xiàn)了水中Cr3+的比色檢測。在優(yōu)化實驗條件(AMT修飾濃度為0.8 μmol/L，pH 7.0)下，該方法的檢測范圍為6～14 μmol/L,檢出限可達100 nmol/L，其他重金屬離子幾乎不存在干擾。由于該方法具有響應(yīng)快(5 min)、制備和操作簡單、無需讀取裝置等優(yōu)點，可望用于水體中Cr3+的現(xiàn)場快速檢測。

Cr3+檢測；3-氨基-5-巰基-1,2,4-三唑；納米金；比色傳感器；水

重金屬鉻(Cr)在水溶液中主要以Cr3+和Cr6+形式存在，兩種價態(tài)之間可相互轉(zhuǎn)換。Cr3+是人體必需的微量元素，對調(diào)節(jié)體內(nèi)糖代謝、維持正常的葡萄糖耐量起重要作用，同時還能影響機體的脂質(zhì)代謝，降低血中膽固醇和甘油三酯的含量。此外，Cr3+還是DNA和RNA的穩(wěn)定劑，可防止細胞內(nèi)某些基因的突變，從而預(yù)防癌癥。但體內(nèi)過量攝入的Cr3+則會與DNA結(jié)合，影響細胞結(jié)構(gòu)和破壞細胞的組成成分，甚至誘發(fā)腫瘤[1]。此外在電鍍行業(yè)，電鍍液中Cr3+含量的控制對保證鍍鉻層的質(zhì)量也起著至關(guān)重要的作用[2]。因此開發(fā)一種快速、高靈敏檢測水中Cr3+的簡單方法尤為必要。但是，目前廣泛采用的原子吸收光譜法和電感耦合等離子質(zhì)譜法[3-4]均存在費時、儀器昂貴以及操作繁瑣等問題。近年提出的一些用于Cr3+檢測的熒光化學(xué)傳感器雖克服了以上缺點，但普遍存在制備難度大、檢出限過高等不足[5-6]。

物理性質(zhì)上，納米金(AuNPs)具有高摩爾消光系數(shù)、大比表面積,以及聚集程度與粒子尺寸和粒子間距相關(guān)等獨特的光學(xué)性質(zhì)；化學(xué)性質(zhì)上，AuNPs具有非常容易實現(xiàn)表面功能化處理等優(yōu)點[7]，因而在重金屬離子檢測中備受關(guān)注[8-9]。目前已有諸多文獻報道利用無標記AuNPs或生物化學(xué)分子(DNA、蛋白質(zhì)、肽以及小分子)修飾的AuNPs檢測Hg2+，Pb2+，Cu2+，Cd2+和Cr6+等重金屬離子[8,10-14]。在檢測Cr3+方面也有少量報道，如Xin等[15]和Dang等[16]分別用三聚磷酸鹽和二巰基對硝基苯甲酸修飾的AuNPs檢測溶液中Cr3+。但這些方法在選擇性或靈敏度上有待提高。

本文利用3-氨基-5-巰基-1,2,4-三唑(AMT)作為Cr3+的識別分子，粒徑為13 nm 的AuNPs作為比色信號報告分子，將AMT修飾于AuNPs表面，形成AMT-AuNPs復(fù)合物，利用Cr3+與復(fù)合物混合前后顏色的變化，構(gòu)建了一種快速、可視化檢測水中Cr3+的比色傳感方法。該方法的檢測靈敏度為100 nmol/L，且對Cr3+具有非常高的選擇性。

1　實驗部分

1.1試劑與儀器

氯金酸(HAuCl4·4H2O)、3-氨基-5-巰基-1,2,4-三唑(AMT)均為分析純，購自Sigma-Aldrich公司；檸檬酸三鈉(分析純，上海生工生物試劑公司)；氯化鎂、氯化鈷、氯化汞、硝酸鋁、硝酸鉻、硝酸錳、硝酸銅、硝酸鎘、硝酸鉛(分析純，上海強順化學(xué)試劑公司)。實驗用緩沖液為10 mmol/L的4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)緩沖溶液，用0.1 mol/L的NaOH或鹽酸調(diào)節(jié)pH值。實驗用水為電阻率≥18.25 MΩ·cm的超純水，實際分析水樣取自重慶醫(yī)科大學(xué)校園人工渠水。

Multiskan GO全波長酶標儀(美國賽默飛世爾科技)；756S紫外-可見分光光度計(上海棱光技術(shù)公司)；Hitachi-7500透射電子顯微鏡(日本日立公司)；PowerShot SD1100 IS佳能數(shù)碼相機；78HW-1恒溫磁力攪拌器(江蘇金壇環(huán)宇科學(xué)儀器)；FA/JA型系列電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器)；UPH-Ⅱ-20T優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)(成都優(yōu)普超純科技有限公司)。

1.2AuNPs的制備與修飾

AuNPs的合成參考Turkevich-Frens法[17-18]：250 mL圓底燒瓶中加入100 mL 0.01%的HAuCl4溶液，持續(xù)攪拌條件下油浴加熱至沸騰，迅速加入3 mL 1%的檸檬酸三鈉溶液，保持溶液沸騰15 min，停止加熱，繼續(xù)攪拌自然冷卻至室溫。制備的AuNPs溶液于4 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

AMT修飾AuNPs方法：將不同濃度的AMT溶液分別與AuNPs溶液混合均勻，配成AMT終濃度在0.2～2.0 μmol/L范圍的系列梯度混合溶液，調(diào)節(jié)混合溶液pH值，室溫反應(yīng)過夜后，離心再分散于不同pH值 的HEPES緩沖液中，即得AMT-AuNPs溶液。

1.3分析方法

500 μL AMT-AuNPs溶液中加入不同濃度的Cr3+或其他金屬離子，混合均勻，5 min后觀察溶液顏色變化，并進行紫外-可見吸收光譜掃描和TEM表征。

2　結(jié)果與討論

2.1AMT-AuNPs溶液的穩(wěn)定性

按上述方法制備的AuNPs溶液光譜在520 nm處出現(xiàn)吸收峰(圖1a)。根據(jù)Haiss與Khlebtsov的研究[19-20]，計算出AuNPs的平均粒徑約為13 nm；另據(jù)AuNPs在520 nm處的摩爾吸光系數(shù)為5.0×108L/(mol·cm)[21]，計算其濃度約為3.0 nmol/L。

眾所周知，AuNPs與—SH之間有很強的共價作用，因而含—SH的AMT分子非常容易固定于AuNPs表面形成AMT-AuNPs復(fù)合物。AMT-AuNPs復(fù)合物溶液的吸收光譜如圖1b所示，其吸收峰仍為520 nm ，說明經(jīng)AMT修飾后絕大多數(shù)AuNPs的顆粒尺寸未發(fā)生明顯變化，這是由于AuNPs的粒徑遠大于AMT分子，因此表面修飾AMT后，幾乎不影響AMT-AuNPs復(fù)合物的平均粒徑。圖1b中650 nm處的吸光度略有上升，表明僅有極少量的AMT-AuNPs復(fù)合物發(fā)生了輕微的聚集。后續(xù)AMT-AuNPs溶液的TEM結(jié)果也證實其處于很好的分散狀態(tài)。因此，AMT-AuNPs溶液體系具有較好的穩(wěn)定性。

實驗進一步考察了不同pH值下AMT-AuNPs溶液的穩(wěn)定性。發(fā)現(xiàn)當pH≥5.0時，AMT-AuNPs溶液體系能保持長時間穩(wěn)定；pH<5.0時，AMT-AuNPs溶液變?yōu)樗{紫色，說明此時溶液體系不穩(wěn)定，發(fā)生了聚集。

2.2比色檢測Cr3+原理

AuNPs比色檢測Cr3+的原理如圖2所示，實驗選取AMT為 Cr3+的識別分子，AMT分子結(jié)構(gòu)中含有—SH，—NH2以及雜環(huán)N原子等功能基團。其中—SH用于共價固定于AuNPs表面并形成穩(wěn)定的AMT-AuNPs復(fù)合物。當溶液中不存在Cr3+時，復(fù)合物在溶液中呈穩(wěn)定分散態(tài)，溶液顏色為紅色(圖2A)；而當溶液中存在Cr3+時，Cr3+通過與AuNPs表面上AMT分子中的—NH2和雜環(huán)N原子之間發(fā)生絡(luò)合作用(圖2B)，導(dǎo)致AuNPs顆粒之間的間距縮小而聚集，由于AuNPs具有距離依賴的顏色響應(yīng)，從而導(dǎo)致溶液顏色由紅色變?yōu)樗{紫色(圖2C)。光譜圖表現(xiàn)為吸收峰紅移(圖1c)。AMT-AuNPs溶液中加入Cr3+前后的TEM圖像(圖3)也可清楚地觀察到顆粒由均勻分散態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榫奂瘧B(tài)。

2.3檢測條件的優(yōu)化

2.3.1AMT濃度的影響圖4為pH 7.0條件下，用不同濃度(0.2～2 μmol/L)AMT修飾AuNPs后，AMT-AuNPs溶液的紫外-可見吸收光譜。由圖可見，隨AMT濃度的增加，A650/A520的值逐漸增大(圖4插圖曲線a)，AMT-AuNPs溶液的吸收光譜紅移逐漸明顯，表明經(jīng)高濃度AMT修飾后溶液中部分AuNPs開始聚集，AMT-AuNPs穩(wěn)定性開始下降。在上述溶液中分別加入相同濃度的Cr3+(20 μmol/L)后，表征溶液體系響應(yīng)的光譜比值A(chǔ)650/A520先逐漸增加，后趨于平緩(如圖4插圖曲線b)。綜合考慮背景干擾和靈敏度，實驗選取修飾AuNPs的AMT濃度為0.8 μmol/L。

2.3.2pH值的影響溶液體系pH值會影響AMT-AuNPs的穩(wěn)定性以及檢測的選擇性。實驗發(fā)現(xiàn)，當溶液pH≤5.0時，在未加入Cr3+情況下，溶液為藍紫色，說明AMT-AuNPs顆粒已發(fā)生聚集。其原因可能為過量的H+中和了AuNPs表面的負電荷，降低了AuNPs間的靜電排斥，從而導(dǎo)致AMT-AuNPs發(fā)生聚集。而當溶液在pH 5.0～10.0時，溶液體系對Cr3+的響應(yīng)隨pH值的增加，呈現(xiàn)先增強后減弱現(xiàn)象。這可能是由于溶液中兩種相反趨勢共同作用的結(jié)果。一種是AMT-AuNPs本身的聚集變色反應(yīng)在一定范圍內(nèi)隨溶液pH值的增加變強；另一種是隨溶液pH值的增加，體系中的Cr3+因與OH-結(jié)合(包括水解或產(chǎn)生沉淀)逐漸減少，從而與AMT配位引起AMT-AuNPs聚集的Cr3+減少，導(dǎo)致溶液體系對Cr3+的響應(yīng)隨pH值增加而減弱。溶液pH值對響應(yīng)結(jié)果影響的詳細機理仍待進一步研究。此外，當溶液pH≥8.0后，其他金屬離子對Cr3+檢測的干擾也逐漸增強。綜上，選取pH 7.0作為較優(yōu)化反應(yīng)條件。

2.4傳感性能

2.4.1響應(yīng)時間在上述優(yōu)化條件下，向AMT-AuNPs中加入20 μmol/L Cr3+后，體系對Cr3+的響應(yīng)(A650/A520)在5 min后即趨于穩(wěn)定，并在72 h內(nèi)保持穩(wěn)定，說明本方法具有快速可靠的特點，且穩(wěn)定時間長。

2.4.2檢出限與檢測范圍在上述優(yōu)化條件下，在AMT-AuNPs溶液中分別加入不同濃度(0～20 μmol/L)的Cr3+，反應(yīng)5 min。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無Cr3+存在時，溶液保持紅色不變；Cr3+濃度為2 μmol/L時，即可觀察到紅色變深；隨Cr3+濃度的增加，溶液逐漸由紅色變?yōu)樗{紫色，且在520 nm處的吸光度逐漸降低，而在650 nm處的吸光度則逐漸增加最后趨于穩(wěn)定。體系對不同濃度Cr3+的響應(yīng)表明，在6～14 μmol/L濃度范圍內(nèi)，A650/A520(y)與Cr3+濃度(x,μmol/L)呈良好的線性關(guān)系，線性方程為y=0.113 5x-0.307 7，r2=0.990 6。以信噪比S/N=3計算，本方法的檢出限可達100 nmol/L。

2.4.3選擇性考察了AMT-AuNPs傳感體系對水環(huán)境中常見重金屬離子的響應(yīng)情況(見圖5)。結(jié)果顯示，除Cr3+出現(xiàn)明顯的顏色變化外，其他離子均未出現(xiàn)顏色變化，說明該方法具有很好的選擇性。金屬離子與化學(xué)分子間的親和程度取決于化學(xué)分子的基團分布、空間構(gòu)象以及金屬離子本身的半徑、電荷數(shù)等因素。固定化的AMT對Cr3+具有高選擇性的原因推測為：首先，AMT分子結(jié)構(gòu)中含有的—NH2和雜環(huán)N原子等功能基團對重金屬離子具有很好的親和性(但不具有選擇性)，這保證了Cr3+與AMT的可結(jié)合性；其次，AMT分子雜環(huán)上的N與環(huán)上鄰近的—NH2構(gòu)成了一個類似于“Y”型的空間構(gòu)象(如圖2C)。該“Y”型結(jié)構(gòu)中凹槽區(qū)域的尺寸可能與Cr3+的半徑匹配，使與Cr3+半徑相當?shù)碾x子進入該結(jié)構(gòu)；同時，該“Y”型結(jié)構(gòu)與金屬離子之間的親和程度還與離子所帶電荷數(shù)有關(guān)，推測帶3個正電荷的Cr3+與AMT的“Y”型結(jié)構(gòu)具有最強的結(jié)合能力，這保證了AMT對Cr3+的選擇性。詳細的結(jié)合機理有待進一步研究。

2.5實際水樣分析

向預(yù)處理過的100 mL水樣中加入不同濃度的Cr3+標準溶液，分別取10 μL按照本方法進行測定，在本方法線性濃度范圍內(nèi)對Cr3+進行7.00,9.00,13.00 μmol/L 3個水平的加標回收實驗，計算得回收率為95%～108%，相對標準偏差(RSD，n=5)為2.1%～4.6%，說明本方法有望用于實際水樣中Cr3+的檢測分析。

3　結(jié)　論

基于Cr3+能引起AMT修飾的AuNPs發(fā)生聚集導(dǎo)致溶液顏色發(fā)生變化，構(gòu)建了一種 AMT-AuNPs比色傳感器，實現(xiàn)了對水中Cr3+的快速檢測，其檢出限為100 nmol/L，大多數(shù)重金屬離子不干擾測定；同時，該方法具有無需昂貴儀器、操作簡單、成本低等優(yōu)點。因此，在水環(huán)境中Cr3+的檢測方面具有很好的應(yīng)用前景。

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Colorimetric Detection of Cr3+in Aqueous Solution Using AMT-modified Gold Nanoparticles

CHEN Zhen，CUI Hai-xia，SHEN Jia，HE Feng-jie，DING Lu，LIU Hui-long，XIONG Xing-liang*

(Department of Biomedical Engineering,Chongqing Medical University,Chongqing400016,China)

A colorimetric method was developed to determine chromium ions(Cr3+) in water,by using 13 nm diameter gold nanoparticles(AuNPs) synthesized by the citrate-mediated reduction of HAuCl4as the transducer component for signaling color change,and 3-amino-5-mercapto-1,2,4-triazole(AMT) as the recognition element for Cr3+.AMT was assembled onto the surface of AuNPs to form a stable water-soluble AMT-AuNPs compound.In the presence of Cr3+,the specific binding of AMT and Cr3+in solution could lead to the aggregation of AMT-AuNPs and a red shift of the maximum absorption wavelength,simultaneously producing an obvious color change from red to blue-purple,which could be used for Cr3+visual detection.Under the optimized conditions(concentration of AMT:0.8 μmol/L；pH 7.0),the detection limit(3σ) of the method could be as low as 100 nmol/L for Cr3+with linear detection range of 6-14 μmol/L,and there was almost no interference from other metal ions.With the advantages of fast response(5 min)，simplicity of preparation and manipulation,and no need of reading device,the presented method is promising in the application of on-site fast detection of Cr3+in water.

Cr3+detection；3-amino-5-mercapto-1,2,4-triazole；gold nanoparticles；colorimetric sensor；water

2015-11-08；

2015-12-28

重慶市基礎(chǔ)與前沿研究計劃(cstc2015jcyjA20014)

熊興良，博士，教授，研究方向：生物傳感器，Tel：023-68485446，E-mail：xxlsober@sina.com

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.06.008

O657.3；O614.41

A

1004-4957(2016)06-0681-05