藍　英，徐　娟，卞曉軍，趙　勇,2,3，潘迎捷,2,3，張煒佳,2,3*

(1.上海海洋大學　食品學院，上?！?01306；2.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風險評估實驗室，上?！?01306；3.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海　201306)

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基于單螺旋微流控芯片的細菌氣溶膠的高效富集

藍英1，徐娟1，卞曉軍1，趙勇1,2,3，潘迎捷1,2,3，張煒佳1,2,3*

(1.上海海洋大學食品學院，上海201306；2.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風險評估實驗室，上海201306；3.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海201306)

設計了一種單螺旋通道的聚二甲基硅氧烷(Poly(dimethylsiloxane),PDMS)微流控芯片，用于副溶血性弧菌氣溶膠的快速有效富集。該芯片的特征在于其通道呈螺旋分布，且通道內(nèi)部含有均勻分布的魚骨形結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，在不同富集時間段內(nèi)，采用該芯片方法捕獲的細菌總數(shù)均遠高于傳統(tǒng)落板法。對于傳統(tǒng)落板法無法有效捕獲的低濃度樣本(104CFU/mL)的缺陷，該方法的優(yōu)勢在于：芯片內(nèi)部的螺旋通道可增大對氣溶膠中微生物的離心力；魚骨形結(jié)構(gòu)的設計增加了待測樣品與芯片內(nèi)壁間的接觸幾率。此外，以無魚骨形的螺旋芯片作為對照，驗證了魚骨形結(jié)構(gòu)對于高效富集的意義。此芯片設計巧妙、易于制備、高效便攜、富集效果較好，在氣溶膠污染嚴重的水產(chǎn)加工等場所具有較大的應用前景。

單螺旋微流控芯片；副溶血性弧菌；富集；魚骨結(jié)構(gòu)

氣溶膠是指懸浮在空氣中的液體或固體顆粒物的膠態(tài)系統(tǒng)。如果氣溶膠中包含微生物則被稱為微生物氣溶膠[1]。微生物氣溶膠對人類的生命健康具有極大影響，全球因微生物氣溶膠引起的呼吸道感染率高達20%，世界上約有500多種致病菌，經(jīng)氣溶膠傳播的至少有100多種[2]。我國疾病感染亦以呼吸道感染率最高。曾肆虐全球的非典型肺炎病毒(又名SARS病毒)是最典型的微生物氣溶膠傳播；此外，對于禽流感、甲型流感以及目前在局部地區(qū)肆虐的手足口病等流行病、傳染病，微生物氣溶膠都是其重要的傳播途徑[3-4]。

副溶血性弧菌是一種廣泛存在于海水、海底沉積物以及魚、蝦、貝等海產(chǎn)品中的常見革蘭氏陰性嗜鹽細菌[5]，是海水養(yǎng)殖中重要的條件致病菌，也是我國沿海地區(qū)食物中毒和夏季腹瀉的重要病原，高居微生物性食物中毒首位[6-7]。在水產(chǎn)品的加工處理過程中，制造的懸浮顆粒污染尤為明顯。通常，在加工過程中產(chǎn)生的肌肉、內(nèi)臟、表皮、粘液和膠原蛋白等大量碎末可能含有副溶血性弧菌，造成室內(nèi)污染甚至是室外一定區(qū)域范圍內(nèi)的污染，引起人類腹痛、嘔吐、腹瀉等疾病。因此，評估水產(chǎn)品加工場所的副溶血性弧菌污染對于保障食品安全具有重要意義。

現(xiàn)階段對微生物氣溶膠進行采樣的最基本最常用的方法為傳統(tǒng)的自然落板法以及借助儀器進行采樣的方法。自然落板法由科赫于1881年創(chuàng)立，該方法中，空氣中微生物顆粒在重力作用下沉降到瓊脂培養(yǎng)基上[8]。機械采樣法根據(jù)采樣原理的不同，可分為沉降模式、震動模式、離心撞擊式、過濾模式、電化學采樣類以及氣流分離器等[9]。目前尚無生物氣溶膠戶外監(jiān)測的標準方法。因而開發(fā)靈敏、高效、可重復、便攜的生物氣溶膠采樣器具有重要的現(xiàn)實意義。微流控芯片因具有體積小、比表面積大、試劑和樣品用量少、反應時間短、分析速度快、靈敏度高、易集成化及自動化等優(yōu)點，非常適用于微生物氣溶膠的采樣和富集[10]。

本文設計了一個具有魚骨形結(jié)構(gòu)和螺旋通道的聚二甲基硅氧烷(Poly(dimethylsiloxane),PDMS)微流控芯片，并將其用于副溶血性弧菌氣溶膠的富集。芯片采用螺旋通道設計，使氣體在其中流動時受較大的離心力影響而在芯片側(cè)壁上富集，采用的魚骨形結(jié)構(gòu)也能增加氣溶膠中微生物與管道內(nèi)壁的接觸幾率，雙方協(xié)同作用可增加富集效率。文中還討論了富集時間和流速對富集效率的影響。設計了一個具有相同螺旋通道而沒有魚骨形結(jié)構(gòu)的微流控芯片，以驗證魚骨形結(jié)構(gòu)對富集效率的影響。實驗結(jié)果表明，該芯片使用方法簡單、快速、便攜，在微生物氣溶膠富集方面具有較大的應用潛力。

1　實驗部分

1.1材料與儀器

1.1.1細菌副溶血性弧菌ATCC 33847，美國菌種保藏中心。

1.1.2試劑乙醇(分析純，上海展云化工有限公司)；氯化鈉(分析純，上海生工生物工程有限公司)；胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB，北京陸橋技術(shù)有限責任公司)；硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(TCBS，北京陸橋技術(shù)有限責任公司)；SU-8 2050光刻膠(美國MicroChem公司)；Sylgard 184硅橡膠彈性體和Sylgard 184固化劑(美國Dow Corning公司)。

1.1.3儀器設備URE-2000/35型光刻機(中科院光電技術(shù)研究所)；2XZ-2型真空泵(上?？崛鸨瞄y制造有限公司)；BPZ-6063LC型真空干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)；KW-4A型臺式勻膠機；BP-2B型烘膠臺；WH-1000等離子表面處理機；LSP01-1A型微量注射泵；ZJ-250型真空攪拌器(保定蘭格恒流泵有限公司)；Eppendorf 離心機(美國 Eppendorf 公司)；Bio-Tek 酶標儀(美國伯騰儀器有限公司)；ZR-1050型氣溶膠發(fā)生器(青島眾瑞智能儀器有限公司)。

1.2實驗方法

1.2.1微流控芯片的設計與加工本實驗設計的單螺旋微流控芯片如圖1所示，分為單螺旋通道層和魚骨結(jié)構(gòu)層。單螺旋通道高為130 μm，寬為600 μm，螺旋底面半徑4 000 μm，頂面半徑14 000 μm，螺旋圈數(shù)為3圈，進出口直徑均為2 000 μm。魚骨形結(jié)構(gòu)由兩個平行四邊形拼接而成，角度為100°，高為130 μm，長為600 μm，寬為150 μm，魚骨形結(jié)構(gòu)沿螺旋通道均勻分布，分布間距為1 000 μm。

該微流控芯片采用多次軟光刻技術(shù)以及模塑法制作。具體工藝流程如圖2所示。芯片制作的關鍵工藝是制作雙層的SU-8負性光刻膠模具以及熱鍵合法制作雙層PDMS微流控芯片。首先利用多次曝光，一次顯影的工藝制作SU-8光刻膠雙層的芯片模具[11]。將SU-82.50光刻膠甩涂至清洗干凈的硅片基底上，厚度約為130 μm，在烘膠臺上前烘(Soft bake)，即65 ℃加熱5 min，95 ℃加熱30 min后，緩慢降至室溫。將設計好的單螺旋通道掩模放置于甩涂光刻膠的基片上，應用光刻機曝光后，將硅片置于烘膠臺后烘(Post bake)，即65 ℃加熱5 min，95 ℃加熱12 min后，緩慢降至室溫。第一層單螺旋通道圖形即可轉(zhuǎn)移至SU-8光刻膠上。再重復甩膠和前烘，將魚骨形結(jié)構(gòu)掩模與第一層的單螺旋通道對準，第二次曝光和后烘，最后顯影并用氮氣吹干，即形成雙層圖形結(jié)構(gòu)的SU-8模具。

聚二甲基硅氧烷單體及固化劑按質(zhì)量配比10∶1混勻，倒在SU-8模具上，在真空干燥箱中抽真空除盡氣泡，80 ℃加熱20 min。冷卻后將PDMS從模具上剝離，在管道的入口和出口處打孔，將該層PDMS與空白PDMS經(jīng)氧等離子體處理后貼合，放置于烘箱內(nèi)80 ℃加熱2 h，完成PDMS的熱化學鍵合反應，形成封閉通道，完成微流控芯片的制作[12-14]。PDMS芯片管道的內(nèi)表面分別用酒精、HCl(1.0%)，H2O2(1.0%)以及超純水沖洗后，用潔凈的空氣吹干備用[15]。

1.2.2氣溶膠樣品的制備將副溶血性弧菌接種于含10 mL TSB(含30 g/L NaCl)的試管中，于37 ℃下以180 r/min搖床培養(yǎng)10 h，連續(xù)活化2次。細菌培養(yǎng)液離心后重懸于0.85%生理鹽水中，將終濃度調(diào)至108CFU/mL。將100 mL菌液置于氣溶膠發(fā)生儀中產(chǎn)生一定濃度的氣溶膠，氣溶膠發(fā)生器產(chǎn)生氣溶膠的時間設定為10 min。將產(chǎn)生的副溶血性弧菌氣溶膠通入盛有20 mL 0.85%生理鹽水的燒杯中，用封口膜密封燒杯。將收集氣溶膠后的液體梯度稀釋后涂布于TCBS平板，于37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h。獲得菌落數(shù)后計算出副溶血性弧菌氣溶膠的濃度。實驗重復3次。

1.2.3芯片富集系統(tǒng)實驗裝置如圖3所示。利用氣溶膠發(fā)生器將一定濃度的菌懸液噴制成細菌氣溶膠進入容積108 L(60 cm×45 cm×40 cm)的密閉亞克力缸中?？諝庵懈比苎曰【w粒在重力作用下沉降到TCBS瓊脂培養(yǎng)基上，將落板法收集的細菌樣本于37 ℃培養(yǎng)箱24 h。在微型真空泵的作用下，細菌氣溶膠進入微流控芯片，并被物理性富集。未被富集的細菌則順著出口的管道進入1.5 mL離心管中被收集[16]。富集完成后，用100 μL TSB液體培養(yǎng)基將富集在芯片管道的細菌反向洗脫。將洗脫后的菌液梯度稀釋涂布于TCBS平板，于37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h。

1.2.4流速對富集效率的影響富集時間設定為3 min，觀察不同流速下(1.6，4.0，6.4 mL/min)微流控芯片的富集效率，選定最優(yōu)流速。每個實驗重復3次。

1.2.5芯片富集效率分析了最優(yōu)流速下不同的富集時間(0，3，6，9，12，15，20，30，40 min)微流控芯片的富集效率，同時以落板法作為對照。每個實驗重復3次。

1.2.6微流控芯片與落板法的比較為了檢測微流控芯片對副溶血性弧菌氣溶膠的富集效果，實驗配制了4種不同濃度的副溶血性弧菌菌液(107，106，105，104CFU/mL)，均通過初始濃度為108CFU/mL的菌液梯度稀釋得到。富集時間設定為20 min，流速為最優(yōu)流速。同時以傳統(tǒng)的落板法作為對照。每個實驗重復3次。

1.2.7魚骨結(jié)構(gòu)對富集效率的影響實驗對比了有魚骨結(jié)構(gòu)微流控芯片與無魚骨結(jié)構(gòu)微流控芯片的富集效率(除有無魚骨結(jié)構(gòu)外無其他區(qū)別)。實驗富集時間設定為10 min，流速為最優(yōu)流速。每個實驗重復3次。

1.2.8副溶血性弧菌的統(tǒng)計分析將落板法收集的細菌樣本和微流控芯片富集的細菌樣本于37 ℃培養(yǎng)24 h，計算平板上生長的細菌菌落數(shù)。

1.2.9數(shù)據(jù)處理與分析記錄通過培養(yǎng)后細菌的菌落數(shù)。芯片的富集效率=富集在芯片中的菌落數(shù)/(富集在芯片中的菌落數(shù)+溢出芯片的菌落數(shù))。

2　結(jié)果與討論

2.1微流控芯片的設計與加工

通過微加工技術(shù)制作微流控芯片的模具由SU-8負性光刻膠制作。SU-8光刻膠具有良好的力學性能和抗化學腐蝕性，不僅可以制作高深寬比的厚膜圖形，同時還能通過多次光刻形成具有多層結(jié)構(gòu)的復雜圖形[17]。本實驗的芯片模具采用兩次曝光，一次顯影的方法制作，方法簡便易行、經(jīng)濟耐用。

通過熱鍵合方式將具有圖案的PDMS與空白的PDMS貼合，從而形成封閉通道制作微流控芯片。微流控芯片載體的材料很多，最常見的是硅片、玻璃，以及聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、PDMS等聚合物。硅片不透明且剛性較大，成本較高；玻璃要加工制作復雜的多層結(jié)構(gòu)比較困難，工藝復雜；PMMA等聚合物則由于其本身的物理化學性質(zhì)，加工精度難以達到要求。而PDMS是目前微流控技術(shù)中被廣泛應用的材料，具有很好的透光、透氣性和生物相容性，成本低，加工工藝簡單，重復性好[18]。此外通過熱化學反應，兩層未完全固化的PDMS之間的界面可發(fā)生交聯(lián)，完成兩層PDMS的鍵合。通過這種方法鍵合的微流控芯片，可以承受6×105Pa以上的壓力[19]。

2.2氣溶膠樣品制備

細菌計數(shù)采用平板計數(shù)法。20 mL 0.85%生理鹽水中含有的細菌濃度約為8.80×105CFU/mL，細菌總數(shù)約為1.76×107CFU。因此，分散到108 L密閉亞克力缸中的副溶血性弧菌氣溶膠濃度約為163 CFU/mL。

2.3芯片富集系統(tǒng)及富集機制

整個裝置對副溶血性弧菌的富集機制如下：一定濃度的菌懸液在氣溶膠發(fā)生器的作用下被噴制成副溶血性弧菌氣溶膠進入密閉亞克力缸中。在微型真空泵的作用下，副溶血性弧菌氣溶膠被泵入微流控富集芯片通道中。進入芯片通道的細菌在離心力及魚骨結(jié)構(gòu)的作用下，粘附到通道內(nèi)壁上。如果產(chǎn)生未被富集的細菌，則會順著出口的管道進入離心管中的TSB培養(yǎng)基中。

2.4流速對富集效率的影響

如表1所示，當流速從1.6 mL/min增至4.0 mL/min時，富集的細菌總數(shù)明顯增多。但當流速繼續(xù)增至6.4 mL/min時，有未被富集的細菌從出口逸出，富集效率從100%降至96.67%。流速增加，富集的細菌總數(shù)升高，但過快的流速增加了目標細菌從富集管道逸出的風險。因此，最終選定4.0 mL/min為最優(yōu)流速。

表1　不同流速對副溶血性弧菌富集效率的影響

2.5時間對富集效率的影響

富集效率隨時間的變化情況如表2所示。以富集時間0 min作為對照，沒有副溶血性弧菌在0 min檢出。當實驗時間為3 min時，檢出21個菌落，而落板法只檢出7個菌落。在6，9，12，15，20，30，40 min富集的細菌數(shù)量分別為180，2 257，4 767，9 133，11 600，14 933和17 300個。落板法富集的細菌數(shù)量分別為27，88，117，237，296，319和336個。當富集時間達到40 min時，約有9個細菌從離心管收集的液體中檢出。在實驗的前30 min內(nèi)，進入管道的細菌均被富集，即芯片的富集效率達100%。由此可見，在30 min內(nèi)，所設計的微流控芯片能夠有效富集副溶血性弧菌。

表2　微流控芯片富集時間對副溶血性弧菌富集效率的影響

2.6微流控芯片與落板法的比較

對比了由微流控芯片富集的副溶血性弧菌數(shù)與落板法培養(yǎng)得到的副溶血性弧菌數(shù)。結(jié)果表明，在20 min的富集時間內(nèi)，副溶血性弧菌在4種濃度(104，105，106，107CFU/mL)下均可通過微流控芯片富集得到。當副溶血性弧菌的濃度為107CFU/mL時，微流控芯片收集的副溶血性弧菌數(shù)目約為570個，而落板法僅有86個。利用微流控芯片富集的副溶血性弧菌數(shù)目是落板法的6.63倍。當副溶血性弧菌的濃度為106CFU/mL時，微流控芯片富集的細菌數(shù)目為294個，落板法則為19個。當副溶血性弧菌的濃度為105CFU/mL時，微流控芯片富集的細菌數(shù)目為65個，落板法僅為5個。利用微流控芯片富集的副溶血性弧菌數(shù)比落板法高出12倍。當副溶血性弧菌的濃度降至104CFU/mL時，微流控芯片可富集到3個細菌，而落板法則無細菌被富集。由實驗結(jié)果可知，微流控富集芯片能夠在很短的時間內(nèi)高效富集低濃度的副溶血性弧菌，且富集到的數(shù)量遠高于傳統(tǒng)的落板法。

2.7有魚骨結(jié)構(gòu)的富集芯片與無魚骨結(jié)構(gòu)的富集芯片效率對比

對比了有、無魚骨結(jié)構(gòu)存在下，微流控芯片的富集效率，無魚骨結(jié)構(gòu)的微流控芯片結(jié)構(gòu)如圖4所示。結(jié)果顯示，實驗時間為6 min時，有魚骨結(jié)構(gòu)存在的芯片的富集效率比無魚骨結(jié)構(gòu)的微流控芯片的富集效率高。有魚骨結(jié)構(gòu)存在時，微流控富集芯片對副溶血性弧菌的富集效率為100%(約富集273個副溶血性弧菌，無細菌從管道中逸出)。而無魚骨結(jié)構(gòu)的富集芯片對副溶血性弧菌的富集效率為93.48%(約258個細菌被富集，18個細菌從出口逸出)。由此可見，魚骨結(jié)構(gòu)在對副溶血性弧菌的富集過程中發(fā)揮了重要作用。這種結(jié)構(gòu)可以打破流體在通道內(nèi)的平流狀態(tài)，變?yōu)闊o序混亂的狀態(tài)，從而增加氣溶膠中微生物與管道內(nèi)壁的接觸幾率，提高微流控芯片的富集效率[17]。此外，螺旋通道可利用離心力增大氣溶膠中的微生物與管道壁的接觸幾率，提高富集效率。

表3　魚骨結(jié)構(gòu)和無魚骨結(jié)構(gòu)的微流控富集芯片富集效率對比

3　結(jié)　論

本文設計了一個具有魚骨形結(jié)構(gòu)的螺旋式PDMS微流控芯片，并將其用于副溶血性弧菌氣溶膠的富集，該芯片對副溶血性弧菌的富集效率達100%，遠高于傳統(tǒng)的落板法。高富集效率得益于芯片的魚骨形結(jié)構(gòu)和螺旋通道的協(xié)同作用。芯片采用的螺旋通道設計，增大了氣體在其中流動時所受到的離心力，從而使氣溶膠中的微生物在芯片側(cè)壁上得到富集；而魚骨形的結(jié)構(gòu)設計增加了氣溶膠中微生物與管道內(nèi)壁的接觸幾率。對于傳統(tǒng)落板法無法捕獲到的低濃度細菌氣溶膠，該芯片的富集優(yōu)勢更為突出。通過設計沒有魚骨結(jié)構(gòu)的對照芯片，進一步證實了魚骨形結(jié)構(gòu)對于富集效率的提高發(fā)揮了較為關鍵的作用。整個微流控富集芯片因結(jié)構(gòu)設計巧妙，加工方法簡單，應用操作便捷，在微生物氣溶膠快速富集方面具有很好的應用前景。為了進一步驗證該芯片對微生物氣溶膠的富集效果，本研究將繼續(xù)優(yōu)化芯片及整體器件，并建立多重熒光定量PCR方法用于檢驗多種微生物氣溶膠的富集效果。

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Highly Efficient Enrichment of Bacteria Aerosol Based on a Single Spiral Microfluidic Chip

LAN Ying1,XU Juan1,BIAN Xiao-jun1,ZHAO Yong1,2,3,PAN Ying-jie1,2,3,ZHANG Wei-jia1,2,3*

(1.College of Food Science and Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai201306,China；2.Shanghai Engineering Research Center of Aquatic-Product Processing & Preservation,Shanghai201306,China；3.Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Aquatic Products on Storage and Preservation(Shanghai),Ministry of Agriculture,Shanghai201306,China)

Highly efficient enrichment is the key for rapid analysis and detection of microbiological aerosol.Herein,a poly(dimethylsiloxane)(PDMS) microfluidic chip which has a single spiral channel was developed,and the chip was used forVibrioparahaemolyticusenrichment.The characteristic of this chip is that it has a single spiral channel which contains a herringbone structure with uniform distribution.During different enrichment times,the number of captured bacteria by microfluidic chip is far bigger than that by the traditional sediment method.Moreover,the chip shows more enrichment advantages when capturing microbiological aerosol in low concentration.This excellent enrichment ability,on one hand,benefits from the unique spiral channel design which can put greater centrifugal force to the microbiological aerosol.On the other hand,the herringbone structures design endows the chip larger surface specific area increasing the contact probability between microbiological aerosol and chip.In addition,a similar spiral microfluidic chip without herringbone structures was also designed.The results validated the contribution of herringbone structures to the enrichment efficiency. With the advantages of delicate design and fabrication,portability and high enrichment capacity,this microfluidic chip shows a great application potential in field like aquatic products processing industry.

single spiral microfluidic chip；Vibrioparahaemolyticus；enrichment；herringbone structure

2015-11-22；

2015-12-11

國家自然科學基金項目(31501555,21405167)；中組部青年千人項目；上海市青年東方學者項目；上海市科委項目(14DZ1205100,14320502100)；浦江人才計劃(14PJ1404300)；上海市科技興農(nóng)重點攻關項目(滬農(nóng)科攻字2015第4-8號)；上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心(11DZ2280300)

張煒佳，博士，教授，研究方向：微流控生物化學分析技術(shù)，Tel:021-61908113,E-mail:wj-zhang@shou.edu.cn

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.06.001

O657.1;R378

A

1004-4957(2016)06-0635-06

研究報告