張惠峰，閆先春，甄　昕

(長春市水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心，吉林 長春 130033)

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利用不確定度評(píng)定對(duì)改進(jìn)后水產(chǎn)品中喹乙醇的檢測方法進(jìn)行確證研究

張惠峰，閆先春，甄昕

(長春市水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心，吉林 長春 130033)

建立了水產(chǎn)品中喹乙醇測定的改進(jìn)方法。改進(jìn)了前處理方式，樣品用熱水提取后，經(jīng)硅藻土和正己烷凈化，并對(duì)色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，從而提高檢測效率。結(jié)果表明，改進(jìn)后的方法高效簡易、靈敏準(zhǔn)確，在4個(gè)不同基質(zhì)樣品的2個(gè)加標(biāo)水平下的平均回收率為77.2%～87.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.4%～6.3%，檢出限10 μg/kg，定量限30 μg/kg 。建立了不確定度評(píng)定數(shù)學(xué)模型，通過計(jì)算和分析測量過程中各不確定度，對(duì)方法和測試條件進(jìn)行確證。測量系統(tǒng)相對(duì)不確定度小于8%，主要受測量過程的隨機(jī)效應(yīng)、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、回收率等因素影響。該方法高效便捷、準(zhǔn)確可靠、快速且節(jié)約成本，適用于水產(chǎn)品中喹乙醇的檢測。此外，本研究對(duì)利用不確定度評(píng)定進(jìn)行檢測方法確證有十分重要的指導(dǎo)意義。

喹乙醇；不確定度；水產(chǎn)品；檢測；確證

喹乙醇(Olaquindox，OLA)又名喹酰胺醇、快育靈、倍育諾等，屬喹喔啉類抑菌促生長劑[1-2]，被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)品養(yǎng)殖業(yè)[3-6]。因喹乙醇具有光敏毒性[7]、致突變和致癌作用[8-12]，國家已明令禁止在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用喹乙醇[13]。目前國內(nèi)外對(duì)水產(chǎn)品中喹乙醇的檢測主要采用高效液相色譜法、高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法等。水產(chǎn)品中喹乙醇?xì)埩袅繖z測行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[14]實(shí)際回收率極低[15]。于慧娟、艾曉輝等[16-17]采用熱水提取后去凈化后高效液相色譜法測定喹乙醇，操作簡單，但檢出限高。田強(qiáng)兵[18-20]等采用有機(jī)溶劑提取凈化濃縮后高效液相色譜法測定喹乙醇，操作復(fù)雜，所需耗材昂貴。曾靜等[21-22]采用高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法測定喹乙醇，方法檢出限低，但所用儀器設(shè)備昂貴，適應(yīng)范圍受限。本研究的檢測方法，與原國家頒布的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法相比，操作較簡便，使用的有機(jī)試劑較少，方法檢出限低，準(zhǔn)確度較高，樣品回收率可達(dá)85%左右。本方法不僅降低了檢測成本，還縮短了檢測時(shí)間，可廣泛適用于水產(chǎn)品中喹乙醇的定量檢測分析。

測量不確定度對(duì)于方法的確認(rèn)、檢測過程重點(diǎn)因素質(zhì)控、能力驗(yàn)證、檢驗(yàn)結(jié)論意見解釋等都有著十分重要的意義，因此在水產(chǎn)品安全檢測等各領(lǐng)域越來越受到重視[23-26]，但尚未有利用不確定度評(píng)定對(duì)新檢測方法進(jìn)行確證的報(bào)道。本文依據(jù)不確定度評(píng)定的基本方法、程序[27-30]，建立了本方法的測量不確定度數(shù)學(xué)模型，首次利用不確定度評(píng)定對(duì)檢測新方法進(jìn)行了確證，并通過對(duì)各不確定度分量的計(jì)算分析，確定該測量系統(tǒng)是否滿足需要，以及測量系統(tǒng)所需要的環(huán)境、儀器、試劑等因素是否具有所需要的統(tǒng)計(jì)特性，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)顯著影響因素，從而不斷改進(jìn)方法以提高檢測質(zhì)量，以期為指導(dǎo)利用不確定度評(píng)定進(jìn)行方法確證和證實(shí)及日常檢測工作的不確定度評(píng)定和結(jié)果質(zhì)量控制提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

喹乙醇標(biāo)準(zhǔn)品(純度99%)：德國Dr.Ehrenstorfer公司；硅藻土(Celite545)：美國Sigma-Aldrich公司；甲醇(色譜純)：美國Fisher公司；試驗(yàn)用水均符合GB/T 6682一級(jí)水的要求，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。水產(chǎn)品樣品：購于長春東北亞物流有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1200高效液相色譜儀(配紫外檢測器和自動(dòng)進(jìn)樣器)：美國Agilent公司；TDL-40B臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；TE212-L電子天平：德國 Sartorius公司；Research plus可調(diào)量程移液器：德國Eppendorf公司；XS205分析天平：瑞士Mettler公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：精密稱取喹乙醇標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，用少量水溶解。用甲醇定容于100 mL棕色容量瓶中，質(zhì)量濃度為100 μg/mL，避光冷藏保存。標(biāo)準(zhǔn)使用液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2 樣品提取

稱取試樣10 g(精確到0.01 g)置于50 mL離心管中，加入硅藻土1 g，準(zhǔn)確加入10 mL水，渦旋振蕩2 min，60℃恒溫水浴振蕩提取15 min，全程注意避光，以4 000 r/min離心5 min，將上清液倒入另一個(gè)50 mL離心管中，再向殘留物中加入10 mL水，同上操作，合并上清液，混勻。

1.3.3凈化

取2 mL提取液于5 mL離心管中，加入正己烷2 mL，漩渦振蕩2 min，靜置分層。棄去正己烷相，再加入正己烷2 mL，重復(fù)上述操作。取水相層，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后，供液相色譜測定。

1.3.4 色譜條件

色譜柱：Agilent C18柱(ZORBAX Eclipse XDB 150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-水(15∶85 ，V/V)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：380 nm；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2　結(jié)果與分析

2.1 喹乙醇色譜圖

按色譜條件進(jìn)行分析，喹乙醇與干擾物質(zhì)完全分離，峰形良好。喹乙醇標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見圖1。

2.2 提取凈化與上機(jī)檢測

依據(jù)喹乙醇微溶于熱水、難溶于冷水、不溶于一般有機(jī)溶劑及對(duì)熱穩(wěn)定在70～90℃經(jīng)30 min無變化的特性，采用熱水做提取劑，60℃振蕩提取15 min。提取過程中加入硅藻土，能均勻分散基質(zhì)且有效去除提取液中的很多雜質(zhì)。處理后的提取液經(jīng)正己烷脫脂，經(jīng)微孔濾膜過濾后可直接上機(jī)。使用ZORBAX Eclipse XDB 150 mm×4.6 mm色譜柱，優(yōu)化色譜條件，減少了色譜測定時(shí)間。喹乙醇見光分解速度很快，試驗(yàn)全過程需要避光。該方法操作簡便，有效縮短了試驗(yàn)時(shí)間，從而避免喹乙醇在檢測過程中見光分解，提高了回收率，滿足水產(chǎn)品中殘留檢測的要求。

2.3 不確定度評(píng)定數(shù)學(xué)模型建立及來源分析

不確定度的來源主要包括曲線校準(zhǔn)過程(標(biāo)儲(chǔ)液定容、標(biāo)液稀釋、最小二乘法曲線擬合)、樣品質(zhì)量、試樣定容、儀器測試、測試過程隨機(jī)效應(yīng)及平均回收率校正結(jié)果引入的不確定度等。本研究依據(jù)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度小于0.006時(shí)可忽略不計(jì)的原則(結(jié)果保留2位有效數(shù)字，故擴(kuò)展不確定度最小為1μg/kg。另考慮數(shù)據(jù)修約，當(dāng)擴(kuò)展不確定度小于0.50μg/kg時(shí)可視為0μg/kg，故當(dāng)測試結(jié)果在38～45μg/kg時(shí)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度小于0.006時(shí)可忽略不計(jì))，通過對(duì)各不確定度分量的計(jì)算，分析測量系統(tǒng)所需要的環(huán)境、儀器、試劑等因素的測試要求。2.4 曲線校準(zhǔn)引入的不確定度評(píng)定和線性范圍、檢出限的確證

2.4.1曲線校準(zhǔn)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(cal)rel

u(cal)rel主要來源于標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液制備、標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過程及曲線擬合。

1)標(biāo)儲(chǔ)溶液配制引入的相對(duì)不確定度uVsrel及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)確證

原始標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度為B類評(píng)定：據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(純度99%)證書給出的擴(kuò)展不確定度Up=0.01，包含因子k=2，得up=Up/k=0.005，即標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的相對(duì)不確定度uprel=up/p=0.005 1。故由原始標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度可忽略不計(jì)，所用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)滿足方法要求。依據(jù)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度小于0.006時(shí)可忽略不計(jì)的原則，計(jì)算得，原始標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度大于83%時(shí)，所引入相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度均可忽略。

標(biāo)儲(chǔ)溶液配制相對(duì)不確定度合成為uVsrel==0.006 1。若標(biāo)儲(chǔ)溶液配制時(shí)使用B級(jí)容量瓶定容引入相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.001 2，對(duì)最終結(jié)果影響不大。如溫度變化范圍為9℃時(shí)，標(biāo)儲(chǔ)定容時(shí)因溫度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.006 2，故在檢測過程中控制溫度范圍為12～28℃較為適宜。

2)標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度uVWrel

表1　量器校準(zhǔn)引入的不確定度

注：所使用定容容量瓶均為A級(jí)。

Note：Volumetric flasks used were A-levels.

表2　環(huán)境溫度變化引入的不確定度

3)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(xpred)rel

配制喹乙醇的5個(gè)不同質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液(5、10、50、100、500 ng/mL)，采用最小二乘法擬合相應(yīng)的峰面積A。線性回歸方程為Y=0.051 252 9X+0.018 933 6(Y=bX+a，a為截距，b為斜率)，方程的線性相關(guān)系數(shù)為，r=0.999 99，詳見表3。

表3　 喹乙醇標(biāo)準(zhǔn)曲線測定結(jié)果

用最小二乘法擬合的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線引入的相對(duì)不確定度為A類評(píng)定，計(jì)算公式見式(2)。

4)曲線校準(zhǔn)過程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度合成

2.4.2 線性范圍確證

利用相關(guān)系數(shù)法對(duì)該回歸方程的線性進(jìn)行檢驗(yàn)：查相關(guān)系數(shù)檢驗(yàn)表得r =0.917，因?yàn)閞=0.999 99>0.917= r(0.01，n=6)，且殘余標(biāo)準(zhǔn)誤差小于0.05(s=0.048 70)，故該曲線各點(diǎn)擬合較好，線性相關(guān)關(guān)系特別顯著。

2.4.3 方法檢出限確證

根據(jù)高若梅[34]等對(duì)分析方法的檢出限和測定下限的研究，通過對(duì)5 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液測定21次，獲得目標(biāo)峰與4.500～6.500 min信號(hào)的平均信噪比的S/N=2.9，按稱樣量10.00 g，經(jīng)換算(式1)得方法檢出限為10μg/kg，結(jié)合平均回收率統(tǒng)計(jì)得本方法的定量限為30 μg/kg 。

表4　 信噪比

2.5樣品質(zhì)量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度umrel

使用賽多利斯TE212-L電子天平(Ⅲ級(jí)天平，最大允許誤差為±0.05 g)，稱量10.00 g樣品。按照均勻分布計(jì)算得um=0.0289g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為umrel=0.0029，為B類評(píng)定。由樣品稱量引入的相對(duì)不確定度遠(yuǎn)小于0.006，可忽略不計(jì)。

2.6 測試過程隨機(jī)效應(yīng)導(dǎo)致的不確定度和回收率、精密度確證

表 5　樣品試驗(yàn)結(jié)果

2.6.2 方法回收率和精密度

分別稱取大黃魚(Larimichthyscrocea)、鯉魚(Cyprinuscarpio)、草魚(Ctenopharyngodonidellus)、鯽魚(Carassiusauratus)陰性樣品各2份于離心管中，加標(biāo)進(jìn)行方法的精密度和回收率測定，結(jié)果見表6。 本方法在2個(gè)不同添加水平的平均回收率為82.7%，對(duì)應(yīng)的平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.7%。精密度和回收率均滿足水產(chǎn)品中喹乙醇的測定要求。采用本方法對(duì)長春市流通市場及產(chǎn)地水產(chǎn)品的69份樣品進(jìn)行了測定，均未檢出喹乙醇。

表 6 　回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)美國ASTMCS94制定的測試性能指標(biāo)評(píng)價(jià)法評(píng)價(jià)本方法的精密度。據(jù)相關(guān)質(zhì)量控制規(guī)范[35-36]及標(biāo)準(zhǔn)方法要求，查CV≤15%，則經(jīng)計(jì)算r=0.124 1，Lsd=0.039 02，得TPIr=0.89，則當(dāng)0.7

TPIr=Lsd/Sr

(3)

2.8 由定容體積引起的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度uVrel

樣品使用10 mL移液器加入20 mL水定容，計(jì)算過程同uVWrel。20℃時(shí)10 mL移液器容量允許誤差為±0.6%，由環(huán)境溫度變化引起溶劑體積改變極其微小，故不考慮。則由定容體積引起的相對(duì)不確定度合成為uVrel=0.004 9。該相對(duì)不確定度小于0.006，可忽略不計(jì)。

2.9由液相色譜儀引入的不確定度uuvwrel

由液相色譜儀引入的不確定度為B類評(píng)定：查儀器檢定證書得整機(jī)定量重復(fù)性RSD6%=0.12，得uuvwrel=0.001 2。該部分引入的相對(duì)不確定度遠(yuǎn)小于0.006，在不確定度評(píng)定時(shí)可忽略不計(jì)。

2.10 合成不確定度及擴(kuò)展

2.11測量結(jié)果報(bào)告

2.12各影響因素的不確定結(jié)果

各影響因素的不確定結(jié)果見表7。

表 7　各影響因素的不確定度結(jié)果

3　結(jié)論

1)改進(jìn)方法以水為提取劑，經(jīng)硅藻土和正己烷凈化后用反相高效液相色譜法測定水產(chǎn)品中喹乙醇，節(jié)省部分檢測時(shí)間和有機(jī)試劑，高效便捷、安全環(huán)保。經(jīng)驗(yàn)證，方法的線性范圍、檢出限、精密度、加標(biāo)回收率等均滿足水產(chǎn)品中喹乙醇的測定要求，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2)該方法不確定度評(píng)定模型的建立，對(duì)于不確定度評(píng)定和質(zhì)量控制工作具有十分重要的指導(dǎo)意義。在評(píng)估過程中，對(duì)測量系統(tǒng)所需要的環(huán)境、儀器、試劑等因素的統(tǒng)計(jì)特性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)測量過程的隨機(jī)效應(yīng)、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、樣品回收率等因素對(duì)測量系統(tǒng)有顯著的影響。日常進(jìn)行不確定度評(píng)定時(shí)，可根據(jù)情況不考慮稀釋標(biāo)液時(shí)的溫度、樣品質(zhì)量稱量、定容體積及液相色譜儀等引入的不確定度。

3)通過對(duì)各不確定度分量的評(píng)估，進(jìn)一步確證該測量系統(tǒng)的測定要求。因此建議在實(shí)際操作過程中全程注意避光，試驗(yàn)應(yīng)使用純度較高的喹乙醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(至少應(yīng)大于83%)；稱量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)時(shí)應(yīng)使用檢定等級(jí)為I級(jí)的分析天平；溶液制備過程中應(yīng)使用精度較高的A級(jí)器皿進(jìn)行溶液的移取和定容；在檢測過程中控制溫度范圍為12～28℃較為適宜；應(yīng)增加平行樣品的測定次數(shù)并根據(jù)預(yù)估值選擇適當(dāng)?shù)墓ぷ髑€線性范圍。

4)根據(jù)t檢驗(yàn)判斷平均回收率與1.0有顯著性差異，檢測結(jié)果必須經(jīng)過修正；此外應(yīng)不斷熟悉樣品處理過程以提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性且增加平行樣的測定次數(shù)，盡量選擇適當(dāng)?shù)墓ぷ髑€線性范圍。

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Evaluation of uncertainty was used to verify a new improved detection method on Olaquindox in aquatic products

ZHANG Huifeng，YAN Xianchun，ZHEN Xin

(Changchun Inspection Center for Aquatic Products Safety and Quality，Changchun 130033，China)

An improved method was established for the detection of Olaquindox in aquatic products.An improved pre-treatment method was used in this study.The samples were extracted with hot water and separated by diatomite and n-Hexane，and the chromatographic parameters were optimized，so detection efficiency was raised significantly.The results showed that the average recoveries at two different samples and four different spiked levels was 77.2%～87.0%，the relative standard deviation of 0.4%～6.3%，the detection limit 10 μg/kg，the limit of quantification 30 μg/kg.A mathematical model of uncertainty evaluation was established.Reliability and test conditions were verified by uncertainty analysis and calculation.Relative uncertainty of this method was less than 8%，which was affected by random effect and calibration curve and recovery.This method is not only simple,sensitive and accurate，but also rapid and cost savings，so it is very suitable for the determination of Olaquindox in aquatic products.This study that uncertainty evaluation is used to verify the detection method is very important.

Olaquindox；uncertainty；aquatic products；detection；verify

2016-05-27

長春市水產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估專項(xiàng)(2014-1485).

張惠峰(1982-)，女，助理研究員，碩士，主要從事水產(chǎn)品質(zhì)量安全及水環(huán)境研究. E-mail：xiaoqiutong@126.com

TS

A

1006-5601(2016)03-0244-10

張惠峰，閆先春，甄昕.利用不確定度評(píng)定對(duì)改進(jìn)后水產(chǎn)品中喹乙醇的檢測方法進(jìn)行確證研究[J].漁業(yè)研究，2016，38(3)：244-253.