楊求華，陸　振，林　琪，黃瑞芳，何麗斌，葛　輝，周　宸*，杜　虹*

(1.福建省水產(chǎn)研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361013；2.汕頭大學(xué)生物系，廣東 汕頭 515063)

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南移池塘養(yǎng)殖仿刺參腸道菌群結(jié)構(gòu)分析

楊求華1，陸振2，林琪1，黃瑞芳1，何麗斌1，葛輝1，周宸1*，杜虹2*

(1.福建省水產(chǎn)研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361013；2.汕頭大學(xué)生物系，廣東 汕頭 515063)

本文基于MiSeq高通量測序技術(shù)對南移福建池塘養(yǎng)殖仿刺參(Apostichopusjaponicus)腸道菌落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，仿刺參前腸(1C_1)、中腸(1C_2)和后腸(1C_3)測得的分類操作單元(OTUs)分別為424、444和414；三組樣品的菌群物種豐度沒有較大差別，但優(yōu)勢菌種存在較大差異；優(yōu)勢菌群方面，后腸的優(yōu)勢菌群為Haliea屬和乳球菌屬(Lactococcus)(分別占后腸總菌數(shù)的11.97%和10.37%)，而前腸和中腸的優(yōu)勢菌群均是乳球菌屬和芽孢桿菌屬(Bacillus)，兩者在前腸菌落中的占比分別為27.91%和6.08%，在中腸中的占比分別為33.24%和6.97%。在重復(fù)性方面，三組樣品的菌落組成都有重疊，重疊率為74.35%，其中前腸與中腸相似度較高，菌株種類有90%以上重疊。本文研究為仿刺參腸道益生菌的開發(fā)利用提供基礎(chǔ)資料。

MiSeq高通量測序；仿刺參；池塘養(yǎng)殖；腸道菌群

仿刺參(Apostichopusjaponicus)，隸屬于棘皮動物門、海參綱、刺參科、刺參屬，主要分布在西北太平洋沿岸、日本海、朝鮮半島南部以及中國的黃海、渤海等地[1-3]。我國海參共有140余種，其中以仿刺參的品質(zhì)最好，位于連云港海州灣的前三島是仿刺參自然分布的最南界[4]。不過，自2003年起仿刺參的養(yǎng)殖就逐步擴(kuò)展到福建等南方省份，“北參南養(yǎng)”的成功試驗(yàn)帶動了福建省仿刺參養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展[5]，每年的十一月到來年的三月是福建省的仿刺參養(yǎng)殖期[6-7]。仿刺參的養(yǎng)殖不僅帶來了較好的經(jīng)濟(jì)效益，同時(shí)也存在一定的養(yǎng)殖風(fēng)險(xiǎn)。隨著養(yǎng)殖密度和養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，仿刺參的病害發(fā)生日益嚴(yán)重，研究結(jié)果表明，塔式弧菌(Vibriotubiashii)、燦爛弧菌(V.splendidus)等病原會引起仿刺參患上“腐皮綜合征”等疾病[5-6]。

腸道菌群不僅是腸道的重要組成部分，還影響著動物的免疫調(diào)節(jié)、代謝吸收等生命機(jī)理[8-10]，對腸道菌群結(jié)構(gòu)的研究將為提高養(yǎng)殖產(chǎn)量、減少疾病發(fā)生提供基礎(chǔ)參考數(shù)據(jù)?，F(xiàn)有的腸道菌群結(jié)構(gòu)分析方法包括傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法、變性梯度凝膠電泳(Denatured gradient gel electrophoresis，DGGE)和隨機(jī)擴(kuò)增引物多態(tài)性分析(Random amplified polymorphim DNA，RAPD)等[11]，但這些方法存在一定的局限性。近年來，隨著測序手段的不斷發(fā)展，為了克服多數(shù)細(xì)菌不可培養(yǎng)和基因組多樣性的問題，高通量測序技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動物腸道菌群結(jié)構(gòu)分析中?；贛iSeq高通量測序技術(shù)克服了傳統(tǒng)方法的局限性，應(yīng)用該技術(shù)對環(huán)境微生物的菌群結(jié)構(gòu)分析均獲得了較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[12-19]。本文基于微生物16S rRNA的MiSeq高通量測序技術(shù)對福建省池塘養(yǎng)殖仿刺參的腸道菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，為南移養(yǎng)殖仿刺參腸道益生菌的開發(fā)提供基礎(chǔ)資料。

1　材料和方法

1.1材料、儀器

實(shí)驗(yàn)用仿刺參采自福建省莆田市城關(guān)鎮(zhèn)某池塘養(yǎng)殖場，選擇體質(zhì)健壯體、體表顏色正常、個(gè)頭大小一致、體表完好的個(gè)體用于實(shí)驗(yàn)研究，采樣時(shí)間為2015年1月29日。

超微量分光光度計(jì)(Nano drop 2000；美國Thermo Scientific公司)用于DNA濃度測定，細(xì)菌DNA提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)用于腸道菌群DNA提取。

1.2樣品采集方法

選取大小一致的仿刺參10頭，在無菌環(huán)境下，用75%酒精沖洗仿刺參體表2～3遍，用剪刀剪開仿刺參體腔，取出腸道，用無菌生理鹽水(0.9%)沖洗腸道外壁，取出內(nèi)含物；將采集的前腸(1C_1)、中腸(1C_2)、后腸(1C_3)內(nèi)含物混合分別置于無菌EP管中稱重；在無菌研缽內(nèi)充分研磨，沖洗研缽用5 mL無菌生理鹽水從而得到仿刺參腸道內(nèi)含物勻漿[18]。

1.3MiSeq高通量測序流程

正向引物338F 5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′；

反向引物806R 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。

先PCR擴(kuò)增，檢測方法采用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行，切膠回收產(chǎn)物按照Illumina公司標(biāo)準(zhǔn)流程測序。

2　結(jié)果

2.1池塘養(yǎng)殖仿刺參腸道提取DNA質(zhì)量

提取仿刺參前腸(1C_1)、中腸(1C_2)和后腸(1C_3)的腸道內(nèi)含物細(xì)菌基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，提取的DNA產(chǎn)物濃度符合MiSeq高通量測序的要求(表1)。

表1　仿刺參腸道內(nèi)容物基因組DNA質(zhì)量檢測結(jié)果

2.2樣品序列數(shù)目

三組樣品測得的序列條數(shù)分別為39 620(1C_1)、32 700(1C_2)和38 895(1C_3)，序列的平均長度為450 bp左右，符合高通量測序要求(表2)。

表2　樣品序列數(shù)統(tǒng)計(jì)表

2.3稀釋性曲線(Rarefaction curve)

樣品稀釋性曲線的總體趨勢為：在序列數(shù)小于10 000條時(shí)，操作分類單元[OTU：Operational Taxonomic Units是在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)或群體遺傳學(xué)研究中，為了便于進(jìn)行分析，人為給某一個(gè)分類單元(品系、屬、種、分組等)設(shè)置的同一標(biāo)志]的數(shù)量迅速增加；隨序列數(shù)的增加，OTU數(shù)量增加速度減緩；當(dāng)序列數(shù)達(dá)到10 000～25 000時(shí)趨于平臺期。本文的樣品在最后都趨于平臺期(圖1)，說明三組樣品的數(shù)據(jù)可靠，測序數(shù)量接近飽和，通過對樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行抽平分析，三組樣品的取樣條數(shù)為25 943。

2.4細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

2.4.1南移池塘養(yǎng)殖仿刺參前、中、后腸腸道菌群結(jié)構(gòu)多樣性指數(shù)分析

如表3中所示，三組樣品的覆蓋率均在99%以上，表明數(shù)據(jù)測序完整；各組樣品的OTU數(shù)量都在430左右；三組樣品(1C_1、1C_2、1C_3)的豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)差異不大，其中豐富度指數(shù)(Chao/Ace)分別為457/445、474/466、438/436，多樣性指數(shù)(Simpson/Shannon)分別為0.065/4.28、0.087 7/4.14和0.027/1.24。

表3　三個(gè)樣品多樣性指數(shù)

注：Chao 是用Chao1算法估計(jì)樣品中所含OTU數(shù)目的指數(shù)，Chao1在生態(tài)學(xué)中常用來估計(jì)物種總數(shù)，由Chao(1984)最早提出。Ace：用來估計(jì)群落中OTU數(shù)目的指數(shù)，由Chao提出，是生態(tài)學(xué)中估計(jì)物種總數(shù)的常用指數(shù)之一，與Chao 1的算法不同。Simpson：用來估算樣品中微生物多樣性指數(shù)之一，由Edward Hugh Simpson(1949)提出，在生態(tài)學(xué)中常用來定量描述一個(gè)區(qū)域的生物多樣性；Simpson指數(shù)值越大，說明群落多樣性越低。Shannon：用來估算樣品中微生物多樣性指數(shù)之一，它與Simpson多樣性指數(shù)常用于反映alpha多樣性指數(shù)；Shannon值越大，說明群落多樣性越高。

2.4.2池塘養(yǎng)殖仿刺參前、中、后腸腸道群落結(jié)構(gòu)分析

表4　實(shí)驗(yàn)樣品在門水平上的豐度

分類Taxonomy豐度/% Abundance1C_11C_21C_3厚壁菌門Firmicutes52.5149.9816.24變形菌門Proteobacteria22.0324.4550.16放線菌門Actinobacteria8.469.343.48擬桿菌門Bacteroidetes6.291.5324.28藍(lán)藻門Cyanobacteria3.284.941.72梭桿菌門Fusobacteria2.630.200.00綠彎菌門Chloroflexi2.465.891.69疣微菌門Verrucomicrobia0.590.930.51酸桿菌門Acidobacteria0.160.660.20衣原體門Chlamydiae0.120.580.05硝化螺旋菌門Nitrospirae0.120.010.00浮霉菌門Planctomycetes0.040.050.84軟壁菌門Tenericutes0.030.010.00芽單胞菌門Gemmatimonadetes0.020.150.14螺旋菌門Spirochaetae0.000.000.00TM70.770.660.43SR10.290.010.00OD10.040.090.07TM60.110.470.17SHA-1090.040.020.00CKC40.000.040.02

在門的水平上(圖2、表4)，南移池塘養(yǎng)殖仿刺參的前腸、中腸、后腸腸道菌群主要包括21個(gè)細(xì)菌門，分別為厚壁菌門、軟壁菌門、變形菌門、綠彎菌門、放線菌門、擬桿菌門、酸桿菌門、藍(lán)藻門、疣微菌門、梭桿菌門、酸桿菌門、衣原體門、硝化螺旋菌門、浮霉菌門、軟壁菌門、芽單胞菌門等。其中厚壁菌門和變形菌門在前腸、中腸中的占比較高，二者在前腸中占細(xì)菌總數(shù)的百分比分別為52.51%和22.03%，在中腸中占的百分比分別為49.98%和24.45%；而后腸則以變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門含量最高，分別占細(xì)菌總數(shù)的50.16%、24.28%和16.24%。此外，在中腸內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)螺旋菌門，后腸中沒有發(fā)現(xiàn)梭桿菌門、軟壁菌門和硝化螺旋菌門。

表5　實(shí)驗(yàn)樣品在科、屬水平上的豐度

分類Taxonmy豐度/% Abundance1C_11C_21C_3乳球菌屬Lactococcus27.9133.2410.37芽孢桿菌屬Bacillus6.086.973.20鏈球菌屬Streptococcus4.051.190.24普氏菌屬Prevotella3.890.280.00節(jié)桿菌屬Arthrobacter2.332.700.27羅氏菌屬Rothia2.260.080.00奈瑟氏菌屬Neisseria2.230.120.00紅桿菌科Rhodobacteraceae2.202.153.93韋永氏球菌屬Veillonella2.090.120.00藍(lán)細(xì)菌Cyanobacteria2.084.091.61

續(xù)表5

在屬的水平上(圖3，表5)，南移池塘養(yǎng)殖仿刺參前腸、中腸、后腸中共檢測到268個(gè)細(xì)菌種屬，主要包括乳球菌屬、Haliea、鏈球菌屬、芽孢桿菌屬、黃桿菌科等。其中乳球菌屬在前腸和中腸中所占比例最高，分別為27.91%和33.24%；而后腸中以Haliea屬和乳球菌屬的含量最高，占后腸細(xì)菌總數(shù)的比例分別為11.97%和10.37%。

2.4.3Venn圖和樣本聚類樹

將所得結(jié)果用作圖軟件和層類聚類分析做Venn圖(圖4)和樣品聚類樹(圖5)。結(jié)果表明，在重復(fù)性方面，三組樣品的菌群組成都有重疊，重疊率為74.35%，其中前腸和中腸的菌群相似度較高，菌群種類上有90%以上的重疊。而特異性菌株方面，在前腸、中腸和后腸中都有發(fā)現(xiàn)特有菌株，數(shù)量分別為14、3、55，以后腸中發(fā)現(xiàn)的特有菌株數(shù)量最多，其功能有待進(jìn)一步研究。從樣品聚類樹可以看出前腸和中腸的菌群結(jié)構(gòu)具有較高的相似度，而后腸與前、中腸的菌群結(jié)構(gòu)間存在一定的差異性。

3　討論

本研究參考高菲[20]等人的方法選取多個(gè)仿刺參的前腸、中腸和后腸，分別混合裝在滅菌的凍存管內(nèi)混合均勻。高通量結(jié)果顯示，福建南移池塘養(yǎng)殖仿刺參的腸道菌群總體以厚壁菌門為主(主要為芽孢桿菌屬和乳球菌屬)，其次為擬桿菌門和變形菌門。乳球菌屬、芽孢桿菌屬和鏈球菌屬等厚壁菌門菌株主要存在于仿刺參的前腸和中腸；擬桿菌門中的黃桿菌屬和Winogradskyella屬在后腸中的占比(所占比例分別為8.55%和4.39%)明顯高于前腸和中腸，而同一門中的普氏菌屬則在前腸中占比較高(占比為3.85%)；變形菌門的紅桿菌科和Haliea屬在后腸中的占比分別為3.39%和11.97%，尤其是Haliea屬在后腸中占比較高。有研究結(jié)果表明，厚壁菌門的細(xì)菌含有多種與淀粉降解酶有關(guān)基因，當(dāng)厚壁菌門在腸道內(nèi)占優(yōu)勢時(shí)，有助于宿主分解營養(yǎng)物質(zhì)為宿主提供能量[21-23]。本研究中，前腸和中腸中的厚壁菌門占有較高優(yōu)勢，分析此類菌株有助于宿主對營養(yǎng)物質(zhì)的分解和吸收；而后腸中多為仿刺參的消化物，是營養(yǎng)物質(zhì)經(jīng)消化分解后的堆積場所，其優(yōu)勢菌株變?yōu)樽冃尉T和擬桿菌門為主。

在本研究中，仿刺參前腸、中腸和后腸的多樣性差異不大，僅在菌群結(jié)構(gòu)的組成方面存在差異。而高菲等[20]采用PCR-DGGE技術(shù)對北方養(yǎng)殖仿刺參腸道內(nèi)含物的群落組成研究結(jié)果顯示，仿刺參前腸內(nèi)含物的微生物多樣性最低，后腸最高，中腸其次；造成差異的原因也許是由于不同的研究手段及不同地域生長環(huán)境。有資料指出，海參的前腸是用酶對事物進(jìn)行消化的場所，后腸的主要作用為對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收[24-25]。因此，前、中、后腸中種類繁多的細(xì)菌群落組成是與仿刺參腸道的具體功能密切相關(guān)。

本文采用高通量測序技術(shù)與微生物16S rDNA V3-V4可變區(qū)序列分析技術(shù)相結(jié)合[26-27]，分析福建省南移的池塘養(yǎng)殖仿刺參腸道菌群結(jié)構(gòu)組成。結(jié)果表明，MiSeq高通量測序技術(shù)能快速、準(zhǔn)確地分析腸道中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，克服了細(xì)菌常規(guī)分離培養(yǎng)的限制。腸道的微生物菌群是腸道的重要組成部分，仿刺參的生理狀態(tài)不同能夠影響腸道菌群的變化，相對應(yīng)的腸道菌群結(jié)構(gòu)變化又會反過來影響仿刺參的生理狀態(tài)；仿刺參的腸道菌群組成會受外部環(huán)境的影響，從而影響仿刺參的吸收、消化等功能。本研究首次利用高通量測序技術(shù)揭示了南移養(yǎng)殖仿刺參腸道菌群結(jié)構(gòu)的多樣性和豐度，且檢測到的細(xì)菌多數(shù)是傳統(tǒng)方法未檢測到的，對于這些細(xì)菌的分離培養(yǎng)方法以及其與仿刺參的生理功能之間的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。本研究將為仿刺參的健康養(yǎng)殖和疾病防控等方面的研究提供參考資料。

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Bacterial component analysis of the gut of South Apostichopus japonicus cultured in pond

YANG Qiuhua1，LU Zhen2，LIN Qi1，HUANG Ruifang1，HE Libin1，GE Hui1，ZHOU Chen1*，DU Hong2*

(1.Key Laboratory of Cultivation and High-value Utilization of Marine Organisms in Fujian Province，F(xiàn)isheries Research Institute of Fujian，Xiamen 361013，China；2.Department of Biology，Shantou University，Shantou 515063，China)

The gut microbiota is essential in shaping many of its host’s functional attributes.The gut microbiota is necessary for the proper physiological development of the gut and for the animal’s ability to digest and convert plant mass into food products.Thus based on high throughput sequencing technology MiSeq，the research aims at analyzing the structure of intestinal bacterial colonies ofApostichopusjaponicuscultured in pond polyculture of Fujian.The results showed that the units of classification operation(OTUs)of the three samples were 424，444 and 414，respectively.The dominant strains were quite different among these samples.The hindgut dominant bacteria wereHaliea(11.97%)andLactococcus(10.37%)，while both foregut and midgut’s dominance wereLactococcus andBacillus.In addition， the percentage ofLactococcus in foregut and midgut were 27.91% and 6.08%，respectively，as forBacilluswere 33.24% and 6.97%.In repeatability，colonies consisting of three samples had overlapping(74.35%)，which foregut and midgut had high similarity，the strain types more than 90% overlap.Therefore，the study aimed at providing basic information for the development and utilization ofApostichopusjaponicuintestinal flora.

MiSeq high-throughput sequencing；Apostichopusjaponicus；pond culture；gut microbiota

2016-03-17

福建省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014R1003-1)；福建省海洋高新產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(xiàng)項(xiàng)目(閩海洋高新[2015]29號)；閩臺重要海洋生物資源高值化開發(fā)技術(shù)公共服務(wù)平臺(2014FJPT01)；福建重要海洋經(jīng)濟(jì)生物種質(zhì)庫與資源高效開發(fā)技術(shù)公共服務(wù)平臺(14PZY017NF17).

楊求華(1988-)，男，碩士，工程師，從事水產(chǎn)生物疾病研究.E-mail：qhyang1314@163.com

周宸(1961-)，男，教授級高工，從事水產(chǎn)病害防治技術(shù)研究.E-mail： ccdafj@fjscs.ac.cn

杜虹(1976-)，女，教授，從事海洋生態(tài)學(xué)等方面的研究.E-mail：hdu@stu.edu.cn

S 917.4

A

1006-5601(2016)03-0192-10

楊求華，陸振，林琪，等.南移池塘養(yǎng)殖仿刺參腸道菌群結(jié)構(gòu)分析[J].漁業(yè)研究，2016，38(3)：192-201.