孫敏秋，林克冰，葛　輝，黃種持，鄭樂云，周　宸

(福建省水產(chǎn)研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門 361013)

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基于宏基因組比較分析石斑魚育苗兩種模式水體中的菌群多樣性和分布特點

孫敏秋，林克冰，葛輝，黃種持，鄭樂云，周宸

(福建省水產(chǎn)研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門 361013)

為比較分析石斑魚育苗新舊模式水體中菌群的分布差異性，研究應(yīng)用高通量測序技術(shù)測定六批次(A1、A2、B1、B2、C1和C2)水樣的菌群16S rDNA V4變異區(qū)序列，并使用Qiime和Mothur等軟件整理和統(tǒng)計樣品序列數(shù)目和操作分類單元(OTUs)數(shù)量，分析物種的豐度、分布和Alpha多樣性以及物種豐度的差異性。結(jié)果顯示，獲得用于分析的序列和OTU數(shù)為667 27/3 724(A1)、66 418/3 391(A2)、87 403/3 980(B1)、57 519/3 438(B2)、62 349/3 530(C1)和66 673/3 004(C2)；稀疏曲線表明測序深度充分，OTU的數(shù)量接近實際情況。A1、A2、B1、B2、C1和C2 六個樣品的豐富度指數(shù)分別為6 535.21/8 872.16、6 583.85/8 855.40、8 062.60/10 640.49、6 878.85/9 352.25、6 859.85/9 295.45和5 291.87/6 868.28，多樣性指數(shù)分別為0.05/4.72、0.04/4.77、0.04/4.69、0.04/4.74、0.05/4.45和0.08/4.06。傳統(tǒng)模式育苗場暴發(fā)石斑魚病毒性神經(jīng)壞死病的同一時期，對兩種模式育苗水體中的菌群在門、屬水平分別進行單樣品物種豐度、多樣品物種分布和物種豐度差異性分析。在門水平，兩種育苗模式育苗水體的優(yōu)勢菌群分布相似，但在屬水平，傳統(tǒng)模式育苗水體的優(yōu)勢菌群中易致病菌假單胞菌屬含量顯著高于新模式育苗水體。獲得了暴發(fā)病毒性神經(jīng)壞死病前后，石斑魚育苗新舊兩種模式共6批次育苗水樣的細菌均勻度、豐富度和菌群結(jié)構(gòu)，推測石斑魚“生態(tài)優(yōu)化及病害防控人工育苗創(chuàng)新模式”可能有利于抑制致病菌，富集益生菌。

斜帶石斑魚；育苗創(chuàng)新模式；細菌菌群；宏基因組學(xué)

石斑魚(Epinephelussp.)是一種重要的名貴海水魚類，其肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富、深受人們喜愛。21世紀初，石斑魚苗種的人工繁育進入蓬勃發(fā)展時期，然而病毒性神經(jīng)壞死病(Viral nervous necrosis，VNN)的出現(xiàn)和肆虐嚴重阻礙了石斑魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，神經(jīng)壞死病毒(Nervous necrosis virus，NNV)已成為現(xiàn)今石斑魚育苗過程中危害最大的病原[1]。由于至今，仍未能找到有效治療病毒性神經(jīng)壞死病的方法，因此，現(xiàn)階段病毒防控成為苗種培育的關(guān)鍵[2]。福建省水產(chǎn)研究所石斑魚課題組多年來致力于新型石斑魚育苗養(yǎng)殖模式研發(fā)，總結(jié)各方經(jīng)驗，在傳統(tǒng)育苗模式基礎(chǔ)上趨利避害，建立“石斑魚生態(tài)優(yōu)化及病害防控人工育苗”創(chuàng)新模式，旨在由受精卵發(fā)育到大規(guī)格苗種的過程中，從養(yǎng)殖水環(huán)境、餌料、日常用具、管理等各個環(huán)節(jié)對神經(jīng)壞死病毒病進行有效的防控[3]。

研究表明，細菌環(huán)境與疾病的產(chǎn)生存在相關(guān)性。Boissiere等[4]揭示了按蚊腸道共生菌可影響瘧疾病原體(瘧原蟲)的發(fā)育。Menno R.等[5]發(fā)現(xiàn)，嬰幼兒患上呼吸道疾病與同時存在于上呼吸道的多種細菌和病毒的相互作用有關(guān)。因此，研究推測石斑魚患神經(jīng)壞死病毒病并不是一個單一的過程，該病毒病的暴發(fā)也許跟水體及周圍細菌的分布存在著一定的聯(lián)系，水體中細菌的結(jié)構(gòu)種類可能促進或抑制神經(jīng)壞死病毒病的發(fā)生。為證實這一點，研究比較分析了石斑魚“生態(tài)優(yōu)化及病害防控人工育苗創(chuàng)新模式”(以下簡稱新模式)與傳統(tǒng)育苗模式下育苗水體中的菌群分布特點。

長久以來，微生物研究都依靠實驗室培養(yǎng)，這一局限性被宏基因組學(xué)(Metagenomics)的出現(xiàn)打破。宏基因組學(xué)誕生于20世紀90年代[6-8]，通過直接從環(huán)境樣品中提取全部微生物的總DNA，構(gòu)建宏基因組文庫，利用高通量測序技術(shù)等策略研究環(huán)境樣品所包含的全部微生物的遺傳組成及其群落功能，使對占微生物總體99%以上不可培養(yǎng)微生物的研究成為現(xiàn)實[9]。研究者可通過對宏基因組文庫進行分析，探討在各種環(huán)境下微生物間相互作用和微生物與周圍環(huán)境間相互影響的規(guī)律[10]。南春燕等[11]就曾采用宏基因組方法研究了中華按蚊幼蟲腸道細菌的組成；也有研究者利用宏基因組高通量測序技術(shù)分析污水及飲用水中的細菌群落結(jié)構(gòu)[12-13]。但目前，采用宏基因組研究水產(chǎn)生物的報道還不多見。邢孟欣[14]采用高通量Solexa測序技術(shù)分析了養(yǎng)殖大菱鲆(Scophthalmusmaximus)腸道微生物的多樣性及其功能；楊章武等[15]利用宏基因組測序技術(shù)分析凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)育苗中生物絮團的細菌群落結(jié)構(gòu)。本文是首次于易發(fā)病毒性神經(jīng)壞死病的石斑魚育苗過程中，采用基于細菌16S rDNA[16-17]的宏基因組學(xué)高通量測序技術(shù)對比分析石斑魚育苗新模式與傳統(tǒng)模式間育苗水體的菌群多樣性和分布特點，了解石斑魚育苗新舊模式間細菌的物種豐富度和均勻度，以期為進一步探討石斑魚病毒性神經(jīng)壞死病的暴發(fā)與育苗水體中細菌組成分布的相互關(guān)系，以及驗證“石斑魚生態(tài)優(yōu)化及病害防控人工育苗”創(chuàng)新模式的確實可行性和高效性積累研究數(shù)據(jù)。

1　材料和方法

1.1樣品采集與處理

水樣分別取自漳州市詔安縣的兩個斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)育苗場——詔安大華水產(chǎn)有限公司(“石斑魚種業(yè)創(chuàng)新與產(chǎn)業(yè)化工程建設(shè)”項目育苗新模式示范基地)和另一傳統(tǒng)模式育苗場。依次于2013年3月27日(A)、4月11日(B)、4月27日(C)分三批次分別采集兩個場的育苗水樣，每次每場采五個育苗池，每池等量采集五個點的水樣混合成一個樣，每個水樣的采集量為5 L(其中4月11日，傳統(tǒng)育苗場暴發(fā)神經(jīng)壞死病毒病，大華場正常。)。采集的水樣先依次經(jīng)由2 μm、0.8 μm濾膜除去雜質(zhì)，再經(jīng)0.22 μm濾膜富集水樣中的細菌，將附有細菌的濾膜勻漿，以備提取細菌的基因組DNA。

1.2主要試劑、材料和儀器

細菌基因組快速提取試劑盒購自上海生物工程技術(shù)公司，操作步驟參照試劑盒說明書。采用超微量分光光度計(Nano drop 2000，美國Thermo Scientific公司)和瓊脂糖凝膠電泳對提取的細菌基因組DNA進行質(zhì)量檢測。MisSeq宏基因組測序和生物信息學(xué)部分由上海派森諾生物科技有限公司利用測序儀(MisSeq System SY-410-1003，美國Illumina公司)完成。

1.3細菌MiSeq宏基因組測序和生物信息學(xué)分析

擴增細菌的16S rDNA-V4區(qū)片段引物如下：正向引物5-AYTGGGYDTAAAGNG-3′；反向引物 5′- TACNVGGGTATCTAATCC-3′。PCR產(chǎn)物膠回收后進行定量，通過3′→5′核酸外切酶和聚合酶的共同作用，修復(fù)帶有突出末端的DNA片段，在3′端引入單堿基“A-”，與3′端含有單堿基“T-”的接頭連接，利用PCR選擇性富集連有接頭的DNA片段，同時擴增DNA文庫，定量并質(zhì)檢后，逐步稀釋定量上機測序，按照美國Illumina公司標(biāo)準流程進行。對測得的原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制，舍棄低質(zhì)量序列，應(yīng)用Flash(V1.0.3)軟件連接序列，過濾連接的序列(連續(xù)相同堿基<6，模糊堿基N<1)，獲得最終用于分析的序列。用軟件Qiime，將相似度大于0.97的序列歸為1個操作分類單元(Operational taxonomic unit，OTU)，統(tǒng)計各樣品所含OTU的數(shù)量，去除無法分類的OTU后進行后續(xù)分析，繪制稀疏曲線?；谖锓N豐度的分析，包括應(yīng)用Mothur軟件計算Alpha多樣性指數(shù)中的豐富度(Chao/Ace)、覆蓋率(coverage)和多樣性(Simpson/Shannon)?；谌郝浣Y(jié)構(gòu)分析，在門和屬兩個分類水平上統(tǒng)計單樣品的物種豐度；在門和屬水平統(tǒng)計多樣品的物種分布；分析物種豐度差異性時在門和屬水平，先將原始豐度歸一到同數(shù)量級，以log2(樣品1/樣品2)計算倍數(shù)差異，差異倍數(shù)>1和<-1者，均被認為差異具有顯著性。

2　結(jié)果

2.1水樣細菌宏基因組DNA質(zhì)量

分別提取新模式石斑魚育苗場水樣(按時間依次編號為A1、B1、C1)和傳統(tǒng)模式育苗場水樣[按時間依次編號為A2、B2(暴發(fā)神經(jīng)壞死病毒病)、C2]共六批次的細菌基因組DNA，其質(zhì)量均符合宏基因組測序的基本要求(表1、圖1)。

表1　水樣細菌宏基因組DNA濃度質(zhì)量檢測結(jié)果

2.2水樣細菌物種豐度分析

2.2.1樣品序列數(shù)目和稀疏曲線

六個水樣獲得最終用于分析的序列條數(shù)分別為66 727(A1)、66 418(A2)、87 403(B1)、57 519(B2)、62 349(C1)和66 673(C2)。對比分析各序列，分別得到的OTU數(shù)目為3 724(A1)、3 391(A2)、3 980(B1)、3 438(B2)、3 530(C1)和3 004(C2)。

從稀疏曲線看，總體的趨勢為：在<10 000條序列時，OTU數(shù)量隨著樣品的序列數(shù)增加而迅速增加；在10 000～30 000條序列時，OTU數(shù)目增加緩慢；之后則趨于平臺期。本研究中的六個水樣均趨于平臺期(圖2)。

注：橫坐標(biāo)：各水樣序列數(shù)；縱坐標(biāo)：OTU數(shù)量。

Notes:X-axis:No.sequences per water sample;Y-axis:No.OTUs.

2.2.2Alpha多樣性

Alpha多樣性是指一個特定區(qū)域或生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的多樣性，經(jīng)常用物種豐富度來度量。在OTU水平，A1、A2、B1、B2、C1和C2等六個水樣的豐富度指數(shù)(Chao/Ace)分別為6 535.21/8 872.16、6 583.85/8 855.40、8 062.60/10 640.49、6 878.85/9 352.25、6 859.85/9 295.45和5 291.87/6 868.28，覆蓋率指數(shù)(Coverage)分別為97%、97%、97%、96%、97%和98%，多樣性指數(shù)(Simpson/Shannon)分別為0.05/4.72、0.04/4.77、0.04/4.69、0.04/4.74、0.05/4.45和0.08/4.06。

2.3水樣細菌群落結(jié)構(gòu)分析

2.3.1單樣品物種豐度

對單個水樣中OTU在門和屬水平進行歸類和整理。分析了4月11日(舊模式育苗場暴發(fā)病毒性神經(jīng)壞死病)新舊模式兩育苗場水樣的情況，即水樣B1和水樣B2(暴發(fā)病毒性神經(jīng)壞死病水樣)。

在門水平，B1水樣細菌隸屬18個門，其中變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)共占99%，變形菌門所占比例最大(占57%)，其余14個門僅占1%(圖3)。B2水樣細菌隸屬20個門，變形菌門、擬桿菌門、放線菌門和厚壁菌門共占99%，變形菌門所占比例仍最大(占62%)，而其余16個門僅占1%(圖3)。B2中有18個門與B1的重疊，其它2個為獨有的門——梭桿菌門(Fusobacteria)和OP10。

在屬水平，B1水樣細菌隸屬154個屬，豐度≥3%的屬有嗜冷桿菌屬(Psychrobacter，44%)、希瓦氏菌屬(Shewanella，27%)、假單胞菌屬(Pseudomonas，11%)和不動桿菌屬(Acinetobacter，3%)，其余150個屬占15%(圖4)。B2水樣細菌隸屬159個屬，豐度≥3%的屬有假單胞菌屬(46%)、嗜冷桿菌屬(24%)、不動桿菌屬(8%)和希瓦氏菌屬(4%)，其余155個屬占18%(圖4)。

2.3.2多樣品物種分布

在門和屬水平對各水樣的菌種分布進行了統(tǒng)計(圖5，圖6)。在門水平，B1水樣和B2水樣中細菌隸屬的各門所占比例相似。在屬水平，兩個水樣共檢測到76個屬，B1水樣檢測到59個屬，B2水樣檢測到64個屬，其中47個屬為兩者共有，12個屬為B1水樣獨有，17個屬為B2水樣獨有。且B2水樣中假單胞菌屬(占16.33%)所占比例明顯高于B1水樣(占4.09%) ，相反B2水樣中嗜冷桿菌屬(占8.29%)所占比例明顯低于B1水樣(占17.08%)。

2.3.3物種豐度差異性

在門和屬水平分析兩個水樣間的細菌豐度差異性。水樣B1和B2相比，有7個門存在顯著差異，差異最大的為梭桿菌門(Fusobacteria)(差異倍數(shù) -11.35)(表2)。

水樣B1和B2有差異的屬有169個，由于數(shù)量較大，在此僅列出兩者差異倍數(shù)超過10倍以上的屬。其中，水樣B1獨有的屬25個，B2獨有的屬47個。假單胞菌屬雖不在列，但兩者具有顯著性差異(差異倍數(shù)-2.00，<-1)。

表2　兩個水樣在門水平的豐度及差異倍數(shù)

注：*差異顯著。

Note：*indicated significant difference.

表3　兩個水樣在屬水平的豐度及差異倍數(shù)(大于10)

續(xù)表3

3　討論

細菌的16S rDNA由于突變率小、分子大小適中、具有物種特異性，因此常被用作分子標(biāo)志，鑒定實驗中分離出的細菌種類[13，18]。本研究利用細菌16S rDNA V4可變區(qū)序列的擴增與宏基因組高通量測序技術(shù)相結(jié)合，分析新舊兩種石斑魚育苗模式間育苗水體中細菌群落分布的特點和差異。

結(jié)果顯示，抽提的宏基因組DNA質(zhì)量較高，稀疏曲線表明測序深度充分，評估OTU的數(shù)量應(yīng)接近實際情況。當(dāng)傳統(tǒng)模式育苗場暴發(fā)病毒性神經(jīng)壞死病時，采用高通量測序獲得新舊兩種模式在同一時期育苗水體細菌豐度。在門水平，豐度較高的有變形菌門、擬桿菌門、放線菌門和厚壁菌門等；在屬水平，豐度較高的有假單胞菌屬、嗜冷桿菌屬、不動桿菌屬和希瓦氏菌屬等。在門水平，新舊兩種模式育苗場水體中細菌隸屬的各門所占比例相差不大，但在屬水平，假單胞菌屬在傳統(tǒng)模式育苗場(當(dāng)時暴發(fā)病毒性神經(jīng)壞死病)水體中所占比例明顯高于新模式育苗場水體。同時，在物種豐度差異性分析中，雖然假單胞菌屬、嗜冷桿菌屬等分別在兩水體間的豐度差異倍數(shù)小于10，但在各自水體中都屬于較優(yōu)勢菌群，更具有宏觀比較的意義，且豐度差異數(shù)據(jù)顯示，兩水體間假單胞菌屬的豐度差異是具有顯著性的。

在哺乳動物疾病研究中，Pettigrew等[19]發(fā)現(xiàn)特定細菌與病毒的相互作用會提高兒童患上呼吸道感染并發(fā)癥——急性中耳炎的風(fēng)險；同一科研團隊的Ruohola等[20]比較分析了患急性中耳炎的兒童和正常兒童的鼻咽中細菌和呼吸道病毒的關(guān)系，得出兒童患急性中耳炎的風(fēng)險與其鼻咽中細菌和病毒間的相互作用存在相關(guān)性的結(jié)論。由此說明，同一區(qū)域范圍內(nèi)的細菌和病毒并非各自孤立，而是密切聯(lián)系的。在石斑魚育苗過程中，育苗水體所含的微生物種類繁多，其中細菌含量尤為豐富。眾所周知，石斑魚病毒性神經(jīng)壞死病常規(guī)暴發(fā)于每年的特定時節(jié)，推測除了受宏觀的氣溫等因素影響外，與水體中微觀的細菌群體也應(yīng)存在一定聯(lián)系。上述研究結(jié)果顯示，當(dāng)傳統(tǒng)模式育苗場暴發(fā)病毒性神經(jīng)壞死病時，大多為致病菌的假單胞菌屬成為育苗水體中的絕對優(yōu)勢菌群，在水體菌群中所占比例顯著高于同一時期未暴發(fā)病毒性神經(jīng)壞死病的新模式育苗場。

因此，由研究結(jié)果推測，傳統(tǒng)育苗模式，育苗水體中有害菌群含量較石斑魚育苗新模式下的要高。同時，傳統(tǒng)育苗模式下石斑魚病毒性神經(jīng)壞死病的暴發(fā)很可能與其育苗水體中假單胞菌屬等有害菌群含量增加有關(guān)。至于這之間具體存在著怎樣的相關(guān)性，以及它們相互間是如何作用的還需在今后的研究中進一步探索。然而，可以初步確定的是，石斑魚育苗新模式下的育苗水體中致病菌含量顯著低于傳統(tǒng)育苗模式，表明石斑魚育苗新模式水體小生態(tài)調(diào)控方法較為可行，育苗前期水體菌群結(jié)構(gòu)較為均衡，有益菌占優(yōu)勢，有害菌群含量較低，體現(xiàn)出“石斑魚生態(tài)優(yōu)化及病害防控人工育苗”創(chuàng)新模式的明顯優(yōu)勢。

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Comparative analysis of bacterial diversity and distribution characteristics in water collected from two Epinephelus coioides seedling models with Metagenomics

SUN Minqiu，LIN Kebing，GE Hui，HUANG Zhongchi，ZHENG Leyun，ZHOU Chen

(Key Laboratory of Cultivation and High-value Utilization of Marine Organisms in Fujian Province，F(xiàn)isheries Research Institute of Fujian，Xiamen 361013，China)

To compare the difference of bacterial distribution in water of new or traditional grouper seedling model，the 16S rDNA V4 region of six water samples(A1，A2，B1，B2，C1 and C2)collected from one farm using “the new breeding model of ecological optimization and disease control and prevention” and another traditional model farm on Zhao’an county of Zhangzhou City were sequenced by high-throughput pyrosequencing.Using Qiime and Mothur software，the number of sequences and operational taxonomic units(OTUs)for each sample were sorted and calculated，the species abundance and distribution，Alpha diversity index and difference times of species abundance among samples were analyzed.The number of sequences and OTUs for each sample were 66 727/3 724(A1)，66 418/3 391(A2)，87 403/3 980(B1)，57 519/3 438(B2)，62 349/3 530(C1)and 66 673/3 004(C2).The rarefaction curves showed that adequate sampling was achieved.The number of OTUs was close to actual situation.The value of richness index was 6 535.21/8 872.16(A1)，6 583.85/8 855.40(A2)，8 062.60/10 640.49(B1)，6 878.85/9 352.25(B2)，6 859.85/9 295.45(C1)and 5 291.87/6 868.28(C2)；diversity index was 0.05/4.72(A1)，0.04/4.77(A2)，0.04/4.69(B1)，0.04/4.74(B2)，0.05/4.45(C1)and 0.08/4.06(C2).At the time NNV breaking in the traditional model farm，the single sample species abundance，multi-samples species abundance and different times of species abundance at phylum and genus levels between two model samples were analyzed.At phylum level，the distribution of dominant bacterial communities in seedling water between two models were similar.At genus level，the content of pathogenicPseudomonasof dominant bacterial community in traditional model sample was significantly higher than the new model.Evenness and richness of bacteria flora in the six water samples collected from new and traditional grouper seedling model were obtained before and after the onset of NNV breaking.It was suggested that “the new breeding model of ecological optimization and disease control and prevention” for grouper seedling might good for inhibition of pathogenic bacteria and enrichment of probiotics.

Epinepheluscoioides；new seedling model；bacterial flora；Metagenomics

2016-05-09

廈門南方海洋研究中心項目(14GZP75NF39)；閩海洋高新項目[2014]21號；省屬公益類科研院所基本科研專項(2014R1003-15)；省屬公益類科研院所基本科研專項(2014R1003-11)；閩臺重要海洋生物資源高值化開發(fā)技術(shù)公共服務(wù)平臺(2014FJPT01)；福建重要海洋經(jīng)濟生物種質(zhì)庫與資源高效開發(fā)技術(shù)公共服務(wù)平臺(14PZY017NF17).

孫敏秋(1986-)，女，實習(xí)研究員，碩士，研究方向：微生物及水產(chǎn)動物免疫學(xué).E-mail：minqiusun@sina.com

S917.1

A

1006-5601(2016)03-0181-11

孫敏秋，林克冰，葛輝，等.基于宏基因組比較分析石斑魚育苗兩種模式水體中的菌群多樣性和分布特點[J].漁業(yè)研究，2016，38(3)：181-191.