李鑫玲，孫曉菲，李欣

α-淀粉酶產(chǎn)生菌的篩選鑒定及其發(fā)酵條件的優(yōu)化

李鑫玲，孫曉菲，李欣

（河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南洛陽(yáng)471003）

從土壤樣本中分離出一株產(chǎn)α-淀粉酶的菌株，經(jīng)形態(tài)學(xué)初步鑒定為熱紅短芽孢桿菌。對(duì)該菌株產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定其最佳碳源為麩皮，最佳氮源為明膠，最佳pH值為10，最佳初始裝液量為60 mL。

α-淀粉酶；熱紅短芽孢桿菌；篩選；優(yōu)化

淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶類的總稱，廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中。根據(jù)水解淀粉生成糖類產(chǎn)物的異頭碳原子構(gòu)型的不同可將淀粉酶分為α-淀粉酶和β-淀粉酶。α-淀粉酶是商品化生產(chǎn)最早、應(yīng)用最早、應(yīng)用范圍最廣和用量最大的工業(yè)酶類之一。目前，α-淀粉酶已廣泛應(yīng)用于燃料酒精、淀粉糖漿、傳統(tǒng)釀造、食品加工、紡織退漿等行業(yè)[1-2]。

本文對(duì)α-淀粉酶產(chǎn)生菌進(jìn)行分離，并對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在為該菌的應(yīng)用研究提供參考。發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.2方法

1.2.1菌種初篩

稱取5 g土壤樣品溶于45 mL無(wú)菌水（含玻璃珠）中震蕩10 min，上清液為菌原液。無(wú)菌水梯度稀釋至10-7濃度。取10-5、10-6和10-7稀釋度涂布于平板篩選培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)48 h。選擇有單菌落的平板，噴灑稀碘液觀察有無(wú)透明圈，記錄菌落特征，透明圈大小等。挑取透明圈明顯且透明圈直徑與菌落直徑之比較大的單菌落斜面保藏，作為初篩菌株。

1.2.2菌種復(fù)篩及發(fā)酵方法

初篩菌株接種于50 mL種子培養(yǎng)基中30℃、150 r/min搖床培養(yǎng)24 h。種子液按10%的接種量接種于50 mL產(chǎn)酶液體培養(yǎng)基中，30℃、150 r/min搖床培養(yǎng)48 h后取發(fā)酵液4.5 mL于離心管中10 000 r/min離心5 min，取上清液測(cè)酶活，每個(gè)樣品重復(fù)3次，最后結(jié)果求平均值。取酶活最高的一個(gè)作為復(fù)篩菌株。

1.2.3淀粉酶活的測(cè)定

YoungJ.Yo改良法[4]：取5 mL 0.5%的可溶性淀粉

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品

土樣來(lái)源于河南洛陽(yáng)，河南科技大學(xué)學(xué)校周圍淀粉含量豐富的果園中，共采集45份土樣，供分離用。

1.1.2培養(yǎng)基[3]

斜面培養(yǎng)基、平板分離培養(yǎng)基、篩選培養(yǎng)基、固態(tài)溶液，在40℃水浴中預(yù)熱10 min，然后加適當(dāng)稀釋的酶液0.5 mL，反應(yīng)5 min后，用5 mL 0.1 mol/L硫酸終止反應(yīng)。取0.5 mL反應(yīng)液與5 mL工作碘液顯色，在620 nm處測(cè)光密度。以0.5 mL水代替0.5 mL反應(yīng)液為空白，以不加酶液（加緩沖液）的管為對(duì)照。調(diào)整D使（R0-R）/R0在0.2～0.7之間。淀粉酶活計(jì)算公式如下：

酶活力/（U/mL）=（R0-R）/R0×D×50

式中：R0、R分別表示對(duì)照和反應(yīng)液的吸光光度值；D為酶的稀釋倍數(shù)。

酶活力單位定義：在40℃，pH6.0，1 g干曲5 min內(nèi)水解1 mg淀粉（0.5%淀粉）的酶量為一個(gè)活力單位。

2　結(jié)果與分析

2.1菌種篩選

通過(guò)用含淀粉的平板篩選培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，得到4株產(chǎn)酶較穩(wěn)定的菌株，經(jīng)產(chǎn)酶液體培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)5號(hào)菌株產(chǎn)酶能力最強(qiáng)。因此，選定5號(hào)菌株為本次篩選的結(jié)果，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2菌株的鑒定結(jié)果

5號(hào)菌株為桿狀兼性厭氧、革蘭氏陽(yáng)性菌，芽孢為圓形或橢圓，菌落呈乳白色，干燥，圓形，扁平，表面皺褶，邊緣不整齊，不透明。接觸酶試驗(yàn)陽(yáng)性，甲基紅試驗(yàn)陽(yáng)性，明膠液化試驗(yàn)陽(yáng)性，檸檬酸鹽試驗(yàn)陰性，V.P.試驗(yàn)陰性。根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》初步判斷此菌為熱紅短芽孢桿菌[5-6]。

2.3發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1不同碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響

不同碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響見圖1。

圖1　不同碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.1　Effects of different carbon sources on enzyme production

碳源是微生物生命活動(dòng)的重要能源物質(zhì)，菌種對(duì)碳源的利用程度直接影響到酶的產(chǎn)量。結(jié)果顯示，碳源的產(chǎn)酶順序?yàn)辂熎ぃ咸烟?，蔗糖，乳糖，麥芽糖，糊精。以麩皮為碳源時(shí)酶活最高，糊精最低。故選麩皮作為碳源。

2.3.2不同氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響

不同氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響見圖2。

圖2　不同氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.2　Effects ofdifferentnitrogen sources on enzyme production

由圖2可知，添加不同氮源的產(chǎn)酶順序?yàn)槊髂z、黃豆粉、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、（NH4）H2PO4、NH4Cl、NaNO3。以明膠作為氮源時(shí)酶活最高，黃豆粉次之，無(wú)機(jī)鹽較低。故選明膠作為最佳氮源。工業(yè)生產(chǎn)時(shí)考慮成本需求可選價(jià)格低廉的黃豆粉作為氮源。

2.3.3初始pH值對(duì)產(chǎn)酶的影響

在pH 6～pH12的范圍內(nèi)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始pH，結(jié)果見圖3。

圖3　初始pH值對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.3　Effects ofdifferentinitialpH on enzyme production

由圖可知菌株在初始pH 8～pH11范圍內(nèi)酶活較高，其中pH值為10時(shí)酶活最高。

2.3.4裝液量對(duì)產(chǎn)酶的影響

不同裝液量影響搖床培養(yǎng)時(shí)的通氣量，其對(duì)產(chǎn)酶的影響見圖4。

圖4　裝液量對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.4　Effects of different amounts on enzyme production

由圖4可知，酶活隨著裝液量的增加而增大，60 mL時(shí)達(dá)到最大，隨后酶活有所下降。其原因是隨著裝液量的減少菌體濃度降低，故酶活低；而裝液量過(guò)大時(shí)，通氣較差，酶活也有所降低。故選60 mL為最佳裝液量。

2.3.5底物（淀粉及葡萄糖）含量對(duì)產(chǎn)酶的影響底物含量對(duì)產(chǎn)酶的影響結(jié)果見圖5、圖6。

圖5　淀粉含量對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.5　Effects ofstarch contenton enzyme production

圖6　葡萄糖含量對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.6　Effects ofglucose contenton enzyme production

由圖5可知，不含淀粉時(shí)酶活最高，隨淀粉含量的增加酶活逐漸降低?？赡苁且?yàn)榘l(fā)酵液中菌體分解淀粉所致。

由圖6可知，葡萄糖添加量為1%時(shí)酶活最大，之后隨著葡萄糖添加量的增加酶活逐漸降低。其原因可能是葡萄糖是較容易被利用的碳源，當(dāng)添加量適當(dāng)時(shí)促進(jìn)菌體生長(zhǎng)，即促進(jìn)產(chǎn)酶；但添加量過(guò)高時(shí)存在葡萄糖抑制作用，即抑制產(chǎn)酶。

2.3.6離子（Ca2+與Na+）含量對(duì)產(chǎn)酶的影響

離子（Ca2+與Na+）含量對(duì)產(chǎn)酶的影響見圖7。

由圖7可知，Ca2+促進(jìn)產(chǎn)酶，其中0.2%～0.4%的Ca2+促進(jìn)效果最好；Na+則抑制產(chǎn)酶，酶活力隨著Na+含量的增加而降低。其原因可能是Ca2+使該酶保持適當(dāng)構(gòu)象，起到穩(wěn)定作用；而Na+增加發(fā)酵液中鹽離子濃度[7]。

圖7　離子（Ca2+與Na+）含量對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.7　Effects ofion（Ca2+and Na+）content on enzyme production

3　結(jié)論

土壤中蘊(yùn)含豐富的微生物資源，α-淀粉酶在微生物中分布廣泛。從微生物中篩選出具有新特性和高活力的α-淀粉酶是一項(xiàng)非常有意義的工作。本研究從淀粉含量豐富的果園土壤中篩選出一株α-淀粉酶產(chǎn)生菌的菌株，經(jīng)形態(tài)鑒定和生理生化鑒定，初步確定為熱紅短芽孢桿菌。對(duì)該菌株產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定其最佳碳源為麩皮；最佳氮源為明膠；最佳pH值為10；最佳初始裝液量為60 mL；底物淀粉抑制產(chǎn)酶，1%的葡萄糖促進(jìn)產(chǎn)酶；0.2%～0.4%的Ca2+促進(jìn)產(chǎn)酶，Na+抑制產(chǎn)酶。

[1]洪新,唐克.耐酸性α-淀粉酶產(chǎn)生菌發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2009,36(1):145-147

[2]蔣若天.一株產(chǎn)耐高溫α-淀粉酶的地衣芽孢桿菌的篩選與分離及產(chǎn)酶條件與酶學(xué)性質(zhì)的研究[D].成都:四川大學(xué),2007

[3]李江華,房峻.真菌α-淀粉酶產(chǎn)生菌的篩選及其固態(tài)發(fā)酵條件的初步研究[J].食品科學(xué),2007(11):373-378

[4] 張強(qiáng),劉成君,蔣芳,等.耐高溫α-淀粉酶產(chǎn)生菌的分離鑒定及發(fā)酵條件與酶性質(zhì)研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2005(2):34-37

[5] 東秀珠,蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M].北京:科學(xué)出版社, 2001:43-377

[6]R E布坎南,N E吉本斯.伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)[M].8版.北京:科學(xué)出版社,1984:65-128

[7]劉雪崢,吳京平,何立千.淺析金屬離子對(duì)α-淀粉酶活力的影響[J].中國(guó)釀造,2000(2):12-15

Identification of theα-Amylase Producing Strain and Optimization of the Fermentation Conditions

LIXin-ling，SUN Xiao-fei，LIXin
（Food and Bioengineering Department，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003，Henan，China）

Anα-amylase-producing strain was screened and isolated from soilsamples.The strain was preliminarily identified as B.thermonber by morphologic taxonomy.The lipase fermentation condition for the strain was optimized by studying on effect of nitrogen sources，carbon sources and other influence factors.The optimum carbon and nitrogen source was bran and gelatin.The optimum pH was 10 and the bestamountwas 60 mL.

α-amylase；B.thermonber；screening；optimization

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.12.038

李鑫玲（1982—），女（漢），實(shí)驗(yàn)師，碩士，研究方向：畜產(chǎn)品加工及食品質(zhì)量與安全。

2015-09-01