耿金峰，張惠敏，楊建強，馬欣欣，石蕾，滕杰，馮倩，張凱（新奧科技發(fā)展有限公司煤基低碳能源國家重點試驗室，河北廊坊065001）

雨生紅球藻中蝦青素含量的快速測定方法

耿金峰，張惠敏，楊建強，馬欣欣，石蕾，滕杰，馮倩，張凱
（新奧科技發(fā)展有限公司煤基低碳能源國家重點試驗室，河北廊坊065001）

證實雨生紅球藻在培養(yǎng)過程中體內(nèi)所含的類胡蘿卜素含量與蝦青素含量是呈穩(wěn)定的線性關系，使用相比蝦青素測定方法簡便的葉綠素測定方法，可快速測定出類胡蘿卜素的含量，再根據(jù)研究所得的類胡蘿卜素和蝦青素的線性方程，可快速推算出雨生紅球藻體內(nèi)蝦青素的含量。

雨生紅球藻；蝦青素；檢測方法

蝦青素（Astaxanthin）被認為是自然界最強的抗氧化劑，其化學名稱為3，3’-二羥基-β，β’-胡蘿卜素-4，4’-二酮，屬于酮式類胡蘿卜素，β-胡蘿卜素是蝦青素合成的前體[1]。蝦青素不僅具有抗氧化活性，還具有抗輻射、抗衰老、抗腫瘤及防治心血管疾病等功能。蝦青素的應用十分廣泛[2-4]，包括保健食品、人的食品添加劑，同時在生物醫(yī)藥制劑、化妝品和水產(chǎn)餌料等領域也有非常廣闊的市場。因此，利用雨生紅球藻高產(chǎn)蝦青素是目前的研究熱點。

雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）是天然蝦青素含量最高的生物，在特定條件下，雨生紅球藻可以積累占其干重1%～3%以上的蝦青素，最高含量達干質(zhì)量的4%[5]，被公認為天然蝦青素的最理想的生物來源。近年來，國內(nèi)外研究者對雨生紅球藻的培養(yǎng)條件及蝦青素合成的誘導條件進行了大量的分析研究，其中多數(shù)研究過程均涉及兩種重要參數(shù)的測定[6-10]，一種是葉綠素，一種是蝦青素；該兩種測定方法均涉及到有毒、有害的化學試劑的使用。在實際應用過程中，葉綠素的測定方法簡便，操作用時短，全程約0.5 h；而蝦青素最常用的方法是Boussiba和Vonshak的方法，采取甲醇和二甲基亞砜的提取的方法，操作復雜，全程耗時約為1.5 h。因此，如果能夠找到使用葉綠素測定方法測定出來的類胡蘿卜素含量與蝦青素含量存在某種比例關系，將可使用葉綠素測定方法來代替蝦青素的測定方法，利于減少工作量，提高工作效率。因此，本文主要研究在雨生紅球藻養(yǎng)殖過程利用葉綠素測定方法測定的類胡蘿卜素與蝦青素存在何種關系，是否可以使用葉綠素測定方法代替蝦青素的測定方面。

1　材料與方法

1.1藻種與培養(yǎng)

雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）：由ENN生物質(zhì)能源技術中心藻種質(zhì)庫提供。培養(yǎng)基采用BG-11培養(yǎng)基[11-12]，采用連續(xù)培養(yǎng)的方式進行。

1.2試劑與儀器

硝酸鉀、磷酸氫二鉀、7水硫酸鎂、2水氯化鈣、6水三氯化鐵、EDTA2鈉、碳酸鈉、甲醇、氫氧化鈉、二甲基亞砜：均為分析純試劑，天津市華東試劑廠。

UV-2550型分光光度計：日本島津；Mini-Bead Beater-8型珠磨機：美國Biospec；5417R型高速離心機：德國Eppendorf；GM-0.5A真空泵：天津市津騰實驗設備有限公司；DK-8D型電熱恒溫水槽：上海森信實驗儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1試驗用反應器規(guī)格

0.6m（長）×0.05 m（直徑）的圓柱形玻璃反應器。

1.3.2接種密度

各試驗組的接種細胞密度為（2.1±0.1）g/L。

1.3.3雨生紅球藻培養(yǎng)方法

1）設置3組試驗組，分別為試驗組1、試驗組2、試驗組3；每個試驗組為3個平行，試驗設計見表1。

表1　試驗設計Table 1　Experiment design

2）在恒定光源下連續(xù)培養(yǎng)13 d。

3）每2 d測定各試驗組的生物量，葉綠素含量、類胡蘿卜素含量和蝦青素含量，具體測定方法如下介紹。

1.4生物量的測定[13]

取一定體積量V的藻液進行抽濾，將藻細胞截留在濾膜（恒定質(zhì)量，m0）上，并用等體積量蒸餾水懸浮藻細胞3次，最后將濾膜于105℃的烘箱過夜至恒定質(zhì)量，冷卻后稱量m1。

細胞質(zhì)量濃度/（g/L）=（m1-m0）/V

1.5類胡蘿卜素的測定[10]

類胡蘿卜素根據(jù)試驗具體情況進行了微調(diào)，具體步驟：取2 mL的藻液進行離心，離心后的藻細胞進行珠磨機研磨1 min，向研磨后的含有藻細胞的離心管中加入2 mL的無水乙醇，70℃水浴5 min后離心，取上層液體至相應編號的具塞玻璃管中，重復水浴和離心2次～3次，至藻細胞基本無色為止，將具塞玻璃管中的液體用無水甲醇定容至10 mL處，晃動幾次，使液體混合均勻。用分光光度計在665、652、470 nm下測定吸光值。（甲醇作為空白對照）

Ca=16.72 A665-9.16 A652

Cb=34.09 A652-15.28 A665

Ca+b=1.44 A665+24.93 A652

Ccar=（1 000 A470-1.63 Ca-104.96 Cb）/221

葉綠素a含量（mg/L）=Ca×U/V

葉綠素b含量（mg/L）=Cb×U/V

葉綠素a+b含量（mg/L）=Ca+b×U/V

類胡蘿卜素含量（mg/L）=Ccar×U/V

式中：Ca為萃取液中葉綠素a含量，mg/L；Cb為萃取液中葉綠素b含量，mg/L；Ca+b為萃取液中葉綠素a和葉綠素b的總含量，mg/L；Ccar為萃取液中類胡蘿卜素含量，mg/L；U為萃取液體積，L；V為樣品體積，L。

注：全程操作盡量避光；若蝦青素含量較高，可少取藻液，計算含量時須按比例乘以倍數(shù)。

1.6蝦青素測定方法

蝦青素含量的測定參照Boussiba等的方法[14-15]取出10 mL藻液5 000 r/min離心5 min，離心后的藻細胞加入5%氫氧化鈉+30%甲醇混合液，放置70℃水浴5 min，離心棄去上清液收集到藻體，重復上述步驟1次。含蝦青素的藻細胞保留在離心管中，之后再加入10 mL的二甲基亞砜（DMSO）在70℃恒溫水浴保溫5 min，離心上清液轉(zhuǎn)移至容量瓶中，重復抽提至藻體變白，用分光光度計在492 nm波長下測定吸光值A492。用下列公式計算所測定溶液的蝦青素含量：

C（mg/mL）=A492×100/A1%1cm

蝦青素含量/%=C（mg/mL）/細胞質(zhì)量濃度（g/L）× 100

式中：A1%1cm=2 220；C為萃取液中蝦青素濃度，mg/mL。

注：全程操作盡量避光；若蝦青素含量較高，可少取藻液，計算含量時須按比例乘以倍數(shù)。

2　結(jié)果與分析

2.1不同條件下雨生紅球藻培養(yǎng)過程葉綠素和類胡蘿卜素含量變化情況

葉綠素是藻類養(yǎng)殖過程中重要的參數(shù)，體現(xiàn)藻細胞處于生長的不同時期，當葉綠素降低時表明雨生紅球藻向蝦青素方向積累進行。不同條件下雨生紅球藻培養(yǎng)過程葉綠素和類胡蘿卜素含量變化情況見圖1、圖2。

圖1　培養(yǎng)過程總?cè)~綠素含量變化情況Fig.1　The change ofchlorophyllcontentduring cultivation

圖2　培養(yǎng)過程類胡蘿卜素含量變化情況Fig.2　The change ofcarotenoid content during cultivation

如圖1所示，試驗組1和試驗組2由于氮和磷含量較高，葉綠素含量均是前3天成上升趨勢，之后葉綠素含量逐漸降低；而試驗組3由于氮和磷含量低，細胞內(nèi)的葉綠素含量僅上升1天，而且增量較少，隨后葉綠素含量呈下降的趨勢。而且隨著培養(yǎng)基初始的氮濃度降低，藻細胞的葉綠素含量呈下降趨勢，而且比較明顯。如圖2所示，當雨生紅球藻在培養(yǎng)過程中當葉綠素開始下降時，類胡蘿卜素含量在生物質(zhì)體內(nèi)開始增加。說當培養(yǎng)基中初始氮濃度低時，有利于類胡蘿卜素的積累。

2.2不同條件下雨生紅球藻培養(yǎng)過程蝦青素含量變化情況

不同條件下雨生紅球藻培養(yǎng)過程蝦青素含量變化情況見圖3。

圖3　培養(yǎng)過程蝦青素含量變化情況Fig.3　The change of astaxanthin contentduring cultivation

如圖3所示，試驗組1和試驗組2的蝦青素含量未有顯著差別，均是逐漸增加，后期含量趨于平緩；試驗組3蝦青素含量要明顯高于試驗組1和試驗組2，其變化規(guī)律同樣為前期含量逐漸增加，后期趨于平穩(wěn)。試驗數(shù)據(jù)證明，雨生紅球藻在養(yǎng)殖初期，初始的氮源和磷源濃度低至一定程度后，利于類胡蘿卜素的積累，促進蝦青素的轉(zhuǎn)化。

2.3類胡蘿卜素含量與蝦青素含率關系分析

通過對圖2和圖3對比可得，類胡蘿卜素和蝦青素含率在微藻培養(yǎng)過程其含量變化趨勢存在相似性；而且蝦青素屬于酮式類胡蘿卜素，β-胡蘿卜素是蝦青素合成的前體，因此推測蝦青素和類胡蘿卜素存在一定關系。將3個試驗組的不同培養(yǎng)時間的類胡蘿卜素含量和蝦青素含量數(shù)據(jù)列表比對（見表2），并作圖進行分析，見圖4。

表2　不同養(yǎng)殖條件下類胡蘿卜素含量和蝦青素含率的比較Table 2　Comparation ofcarotenoid content and astaxanthincontent in diferent cultivation condition

圖4　培養(yǎng)過程類胡蘿卜素含量與蝦青素含率關系圖Fig.4　The relationship between carotenoid contentand astaxanthin contentduring cultivation

如圖4所示，可知類胡蘿卜素含量和蝦青素含量基本成線性關系，擬合公式為：蝦青素含率/%=0.079 1×類胡蘿卜素含量（mg/g生物質(zhì)）-0.490 6，R2=0.973 6；蝦青素的含率與各試驗組的初始N濃度無關。在低氮/磷濃度的試驗組3，蝦青素積累速度較快的情況；或試驗組1和試驗組2，蝦青素積累速度略慢的情況，雨生紅球藻體內(nèi)所含有類胡蘿卜素含量和蝦青素含率均呈一定的線性關系。

2.4驗證試驗

為了驗證本研究所給出的類胡蘿卜素含量與蝦青素含率之間的關系式是否正確以及其準確度如何，隨機進行了兩種培養(yǎng)條件進行雨生紅球藻的養(yǎng)殖。其中一組為按照BG-11培養(yǎng)基N/P加量，即為驗證試驗組1；另外一組為BG-11按照培養(yǎng)基1/4的N/P加量，即為驗證試驗組2，其它試驗條件按照本研究條件設置。驗證試驗組的類胡蘿卜素含量和蝦青素含率隨培養(yǎng)時間的增加變化如下表3和表4所示。

表3　驗證試驗組1的蝦青素含量實測與推測的對比Table 3　Comparation ofthe measured and inferred values of astaxanthin contentin the experimentgroup I

表4　驗證試驗組2的蝦青素含量實測與推測的對比Table 4　Comparation of the measured and inferred values of astaxanthin content in the experimentgroup II

根據(jù)表3和表4驗證試驗結(jié)果可得，公式推測蝦青素含率的結(jié)果與實測數(shù)據(jù)結(jié)果趨勢一致，其誤差在10%以內(nèi)，說明雨生紅球藻中的類蘿卜素含量與蝦青素含率確實存在一定相關性，而且本研究給出的關系公式所推測蝦青素含率準確性較高，可以作為日常雨生紅球藻培養(yǎng)過程中蝦青素監(jiān)控的快速檢測手段。

3　討論

通過數(shù)據(jù)分析得到，雨生紅球藻在積累蝦青素過程其體內(nèi)所含的類胡蘿卜素與終產(chǎn)物蝦青素存在比較穩(wěn)定的線性關系。而類胡蘿卜素含量可以通過測定葉綠素的方法獲得，其中葉綠素測定方法相比目前研究所用的蝦青素測定方法要便捷、快速，測定過程僅需要0.5 h，而蝦青素測定方法較為復雜，全過程需要1.5 h。因此本研究證實，在不同養(yǎng)殖條件下營養(yǎng)藻雨生紅球藻體內(nèi)含有的類胡蘿卜素和蝦青素存在線性關系情況下，可以通過測定類胡蘿卜素含量而間接的計算出蝦青素的含率，數(shù)據(jù)可信度高。這種方法更利于快速獲得研究過程中的相關重要參數(shù)，促進研究的進度，提高工作效率；而且還同時減少工作人員的有機溶劑接觸時間。

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A Method for Rapid Determination of Astaxanthin from Haematococcus pluvialis

GENG Jin-feng，ZHANG Hui-min，YANG Jian-qiang，MA Xin-xin，SHILei，TENG Jie，F(xiàn)ENG Qian，ZHANG Kai
（State Key Laboratory of Coal-based Low Carbon Energy，ENN Science&DevelopmentCo.，Ltd.，Langfang 065001，Hebei，China）

This study confirmed that a stable linear relationship lies in the carotenoid pigment content and astaxanthin content in Haematococcus pluvialis during cultivation.Method of determintion of carotenoid in Haematococcus Pluvialis was more simple and rapid than method of determination of astaxanthin in Haematococcus Pluvialis.Astaxanthin contentin Haematococcus pluvialis could be calculated according to the linear relationship.

Haematococcus pluvialis；astaxanthin；rapid determination

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.12.029

國家“973”計劃重點項目（微藻高效固碳產(chǎn)能應用基礎研究2012CB723606）

耿金峰（1982—），男（漢），工程師，碩士，從事微藻生長機理與規(guī)?；B(yǎng)殖工藝等方面研究。

2016-03-08