文志州（佛山市海天調(diào)味食品股份有限公司，廣東佛山528000）

響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)合酶酶解牡蠣蛋白的工藝研究

文志州
（佛山市海天調(diào)味食品股份有限公司，廣東佛山528000）

為提高牡蠣蛋白的利用率，以新鮮牡蠣為原料，采用水解蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶對(duì)新鮮牡蠣進(jìn)行復(fù)合酶解，并利用響應(yīng)面法對(duì)牡蠣酶解工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：牡蠣蛋白的最優(yōu)酶解條件為，復(fù)合酶的加酶量為0.70%、pH6.87，酶解溫度58.6℃，酶解時(shí)間為3.4 h。在此條件下，新鮮牡蠣酶解后的水解度最高，為40.71%。

牡蠣；復(fù)合酶解；響應(yīng)面分析法；水解度

牡蠣又名蠔，是世界上第一大養(yǎng)殖海產(chǎn)貝類，全球發(fā)現(xiàn)有100多種，主要分布在熱帶和溫帶，為我國(guó)四大養(yǎng)殖貝類之一。我國(guó)沿海牡蠣分布較廣，自渤海、黃海至南沙群島均有生長(zhǎng)，約有20種[1]。牡蠣肉鮮味美，營(yíng)養(yǎng)豐富，素有“海底牛奶”之稱[2]，是我國(guó)首批列為藥食同源的保健食品之一[3]。牡蠣中的蛋白含量高達(dá)50%，其中必需氨基酸占氨基酸總量的40%，是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)資源。牡蠣肉中富含?；撬?，?；撬峋哂邢捉舛?、降血脂、促進(jìn)幼兒大腦發(fā)育等作用[4]。此外，牡蠣肉的糖原含量豐富，約為22.41%，是一種重要的生理活性物質(zhì)，可改善心臟和血液功能[5]。且蠔肉中還含有DHA和EPA等不飽和脂肪酸、維生素以及硒和鋅等礦物質(zhì)，具有一定的保健功能[6]。

蠔汁是蠔油生產(chǎn)的主要原料，其質(zhì)量?jī)?yōu)劣對(duì)蠔油的質(zhì)量有重要的影響。目前，蠔汁的生產(chǎn)方式主要有兩種：一是煮制工藝，直接利用牡蠣蒸、煮后的汁液進(jìn)行濃縮制得。另一種是酶解工藝，將蠔肉酶解，再對(duì)酶解液進(jìn)行處理制得蠔汁[7]。通過(guò)酶解法制備蠔汁，不僅可以提高蛋白的利用率，還能增加酶解液中的營(yíng)養(yǎng)成分及功能活性物質(zhì)。酶解工藝多采用單酶或雙酶水解法，且采用的單酶多為胰蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶等[8-10]。雙酶多采用中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶等的組合[11]。本試驗(yàn)采用水解蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶對(duì)牡蠣進(jìn)行復(fù)合酶解，利用響應(yīng)面法對(duì)牡蠣酶解工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，得出了牡蠣雙酶酶解的最佳工藝條件，提高牡蠣肉的水解度，增加牡蠣蛋白的利用率，為牡蠣的深加工和綜合利用提供理論依據(jù)。

1　材料和方法

1.1材料與試劑

新鮮牡蠣：海南東岸水產(chǎn)開(kāi)發(fā)有限公司；風(fēng)味蛋白酶（100 000 U/g）、水解蛋白酶（100 000 U/g）、中性蛋白酶（100 000 U/g）、木瓜蛋白酶（200 000 U/g）、復(fù)合蛋白酶（120 000 U/g）：諾維信公司；分析純氯化鈉、氫氧化鈉等：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

1030Analyzer定氮儀：Tetator；DHG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：北京市雅士林試驗(yàn)設(shè)備有限公司；Delta 320 pH計(jì)：梅特勒-托利多（上海）儀器有限公司；3-18K冷凍離心機(jī)：德國(guó)sigma。

1.3方法

1.3.1基本成分的測(cè)定

水分含量的測(cè)定：參照GB 5009.3-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測(cè)定》采用常壓干燥法進(jìn)行；粗脂肪含量的測(cè)定：參照GB/T 5009.6-2003《食品中脂肪的測(cè)定》采用索氏提取法；灰分含量的測(cè)定：參照GB 5009.4-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中灰分的測(cè)定》采用干法灰化法測(cè)定；粗蛋白含量的測(cè)定：參照GB 5009.5-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)》采用凱氏定氮法測(cè)定；總糖含量的測(cè)定：參照GB/T 9695.31-2008《肉制品總糖含量測(cè)定》。

1.3.2蠔汁的制備工藝

取一定量的新鮮牡蠣，加入一定量的水，打漿處理，加入一定量的蛋白水解酶，在適宜的酶解條件下，酶解一定時(shí)間后，100℃煮沸10 min滅酶，冷卻后3 000 r/min離心15 min，得到蠔汁。

1.3.3蛋白質(zhì)水解度的測(cè)定

水解度的測(cè)定采用甲醛滴定法[12]。水解度是指蛋白質(zhì)分子中由于生物或化學(xué)水解而斷裂的肽鍵占蛋白質(zhì)分子中總肽鍵的比例。DH/%=水解液中斷裂的肽鍵數(shù)/蛋白質(zhì)中總的肽鍵數(shù)×100

1.3.4數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所涉及到的測(cè)定結(jié)果均做3次平行，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Origin8.6進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用SPSS軟件進(jìn)行顯著性分析處理。

2　結(jié)果與討論

2.1蠔肉的主要成分分析

蠔肉的主要成分見(jiàn)表1。

表1　蠔肉的主要成分Table 1　Chemicalcomposition ofoyster meat

由表1可知，解凍后的蠔肉中的主要成分為水分，水分含量為80.64%，而蠔肉的干物質(zhì)中，蛋白質(zhì)的含量最高，占49.83%，且其氨基酸的組成較為合理，必需氨基酸含量較高，占氨基酸總量的40.00%，是一種優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)[13]。蠔肉中還含有約3.30%的?；撬?，對(duì)人體具有很重要的生理活性[14]。其次是糖類，占干物質(zhì)的24.08%，其中含有大量的活性多糖，能改善心臟和血液功能，對(duì)人體有良好的保健作用[15]。蠔肉中的脂肪含量較低，僅為7.14%，且其脂肪中的DHA、EPA等不飽和脂肪酸的比例較高，能改善和提高記憶力[6]。蠔肉中的灰分含量較高為9.49%，含有豐富的微量元素，特別是鋅和硒的含量豐富[17]。

2.2響應(yīng)面優(yōu)化水解蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶復(fù)合酶解牡蠣的工藝條件

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上（單因素試驗(yàn)結(jié)果為水解蛋白酶∶風(fēng)味蛋白酶=2∶1（體積比），酶解溫度60℃、加酶量0.6%、pH=7、酶解時(shí)間3 h），選取加酶量（A）、pH （B）、酶解溫度（C）、酶解時(shí)間（D）4個(gè)因素為自變量，以水解度（Y）為目標(biāo)函數(shù)，采用四因素三水平的響應(yīng)面分析法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，其因素水平編碼表如表2所示。

表2　響應(yīng)面優(yōu)化因素及水平表Table 2　Factors and levels of RSMexperiment

根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，按表2的因素水平編碼表，以水解度（Y）為響應(yīng)值，采用四因素三水平的響應(yīng)面分析方法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表3所示。

表3　響應(yīng)面分析方案及結(jié)果Table 3　Response surface experimentaldesign and results

續(xù)表3　響應(yīng)面分析方案及結(jié)果Continue table 3　Response surface experimentaldesign and results

利用Design Expert8.0.6軟件對(duì)上表中的試驗(yàn)結(jié)果作回歸擬合分析，得到Y(jié)水解度（%），A加酶量（%），B pH，C酶解溫度（℃），D酶解時(shí)間（h）二次項(xiàng)方程：Y=37.16＋2.79×A-2.95×B-1.13×C＋1.95×D-0.51×A× B-2.86×A×C＋0.35×A×D＋1.29×B×C＋-1.33×B×D-0.51× C×D－3.91×A2－3.40×B2－4.27×C2－0.66×D2。對(duì)方程分別進(jìn)行顯著性方差分析和可信度分析，結(jié)果分別如表4和表5所示。

表4　二次回歸方程的顯著性檢驗(yàn)及方差分析Table 4　ANOVA for response surface quadratic model

表5　二次回歸方程的可信度分析Table 5　The credibility analysis ofregression model

由上表可知：P﹤0.000 1，故該回歸模型極顯著，其中的一次項(xiàng)A、B、C、D和二次項(xiàng)A2、B2、C2表現(xiàn)為極顯著，二次項(xiàng)D2表現(xiàn)為顯著。而交互項(xiàng)AC、BC、BD表現(xiàn)為極顯著，AC、AD、CD表現(xiàn)為不顯著。由表6中F值可以看出，加酶量（A）、pH（B）、酶解溫度（C）及酶解時(shí)間（D）4個(gè)因素中，pH對(duì)牡蠣蛋白水解度的影響最大，其次是加酶量、酶解時(shí)間，最后是酶解溫度。同時(shí)失擬項(xiàng)P=0.340 6，為不顯著，表明失擬誤差相對(duì)于純誤差是不顯著的，同時(shí)該模型具有較好的回歸系數(shù)（R2=0.98）說(shuō)明該試驗(yàn)設(shè)計(jì)是可靠的，能夠很好地描述試驗(yàn)結(jié)果。

圖1直觀地反映出各因素間的交互效應(yīng)以及對(duì)牡蠣蛋白水解度的影響。

圖1　四因素的等高線圖及響應(yīng)面三維分析圖Fig.1　Four-dimensionalchart and corresponding contour plot

其中酶解溫度-加酶量、pH-加酶量及酶解時(shí)間-加酶量的交互作用對(duì)牡蠣蛋白水解度的影響較為顯著。由圖1可知，其他幾種因素的交互作用對(duì)牡蠣蛋白水解度也存在一定影響。因此，當(dāng)提取溫度、保溫時(shí)間、加酶量及酶解時(shí)間4個(gè)因素間合理組合時(shí)才能獲得較好的水解度。

綜合以上單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果，使用Design-expert軟件，得到水解度最高的新鮮牡蠣的復(fù)合酶解條件如下：加酶量為0.70%、pH=6.87，酶解溫度58.57℃，酶解時(shí)間為3.39 h時(shí)，酶解后的水解度最高，為40.50%。按照確定的最佳酶解條件進(jìn)行3次實(shí)際酶解試驗(yàn)，實(shí)際酶解條件為，加酶量0.70%、pH= 6.87、酶解溫度58.6℃、酶解時(shí)間3.4 h，并測(cè)定此時(shí)酶解液的水解度，所得的實(shí)際水解度為（40.71±1.03）%，說(shuō)明所建立的試驗(yàn)?zāi)Ｐ湍軌蛘鎸?shí)的反應(yīng)4種因素對(duì)牡蠣蛋白酶解效果的影響，所得的酶解條件可靠穩(wěn)定，對(duì)實(shí)際生產(chǎn)具有一定的指導(dǎo)作用。

3　結(jié)論

本研究以新鮮牡蠣為原料，采用水解蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶對(duì)牡蠣蛋白進(jìn)行復(fù)合酶解，利用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法對(duì)牡蠣蛋白酶解工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，得出了牡蠣雙酶酶解的實(shí)際最佳工藝條件為復(fù)合酶中水解蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶的復(fù)配比例為2∶1（體積比），復(fù)合酶加酶量為0.70%、pH=6.87，酶解溫度58.6℃，酶解時(shí)間為3.4 h，在此條件下，新鮮牡蠣酶解后的水解度最高，為40.71%。

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Optimization of Enzymatic Hydrolysis of Oyster Protein Using Response Surface Methodology

WEN Zhi-zhou
（Foshan Haitian Flavouring and Food Co.，Ltd.，F(xiàn)oshan 528000，Guangdong，China）

In order to improve the utilization of oysters protein.Fresh oysters was used as raw material，The fresh oysters was hydrolyzed with proteolytic enzyme and flavourzyme.And then the Box-Behnken response surface method was used to optimize the combination of enzymatic hydrolysis process.Results showed that the best conditions for oysters proteolysis was the quantity of compound enzyme was 0.70%，pH 6.87，the enzyme hydrolysis temperature 58.6℃，the hydrolysis time was 3.4 h.Under this condition the hydrolysis degree was the highest，which was 40.71%.

oyster；enzymatic hydrolysis；response surface methodology；degree ofhydrolysis

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.12.022

文志州（1978—），男（漢），工程師，本科，研究方向：食品調(diào)味料研發(fā)與管理。

2016-01-28