楊麗維，陳穎，張峻（天津市林業(yè)果樹研究所，天津300384）

葛根超微粉總黃酮的雙頻超聲輔助提取與純化

楊麗維，陳穎，張峻
（天津市林業(yè)果樹研究所，天津300384）

以葛根超微粉為原料，采用雙頻超聲強(qiáng)化法進(jìn)行葛根黃酮的提取，利用大孔樹脂吸附法進(jìn)行純化，并采用HPLC法進(jìn)行葛根素的含量測(cè)定。結(jié)果表明，雙頻超聲輔助提取中總黃酮含量為275.16 mg/g，明顯高于單頻超聲輔助提取的190.8 mg/g，說明雙頻超聲技術(shù)與超微粉碎技術(shù)相結(jié)合可以促進(jìn)有效成分的提取。葛根素含量由純化前的11.15%提高到82.47%，純化效果較好。

葛根；超微粉；黃酮；雙頻超聲輔助提取；純化

葛根為豆科植物野葛和粉葛的干燥塊根。葛根除了含有很高的淀粉成分外，還含有黃酮類物質(zhì)和異黃酮類化合物，其中主要有效成分為葛根素，具有提高免疫、增強(qiáng)心肌收縮力、保護(hù)心肌細(xì)胞、降低血壓、抗血小板聚集等作用。

近年來，人們用超聲波輔助提取葛根中的有效成分頗有成效，但是其聲場(chǎng)不夠均勻，較易產(chǎn)生駐波，從而影響提取效果[1]。雙頻超聲強(qiáng)化提取法是一種頗具發(fā)展?jié)摿Φ男碌妮腿〖夹g(shù)，可將葛根中的有效成分快速高效地提取出來[2]。另外除了提取方式，葛根前處理也是影響有效成分提取的關(guān)鍵因素。超微粉碎可使葛根細(xì)胞壁破碎，促使細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)有效成分直接釋放出來，提高葛根中有效成分的溶出速度和溶出率。本試驗(yàn)采用雙頻超聲輔助提取法對(duì)葛根超微粉進(jìn)行提取，利用大孔樹脂吸附法對(duì)提取液進(jìn)行純化，同時(shí)采用高效液相色譜法對(duì)葛根超微粉進(jìn)行定量測(cè)定和有效成分質(zhì)量檢測(cè)的研究。試驗(yàn)將雙頻超聲技術(shù)與超微粉碎技術(shù)相結(jié)合，突破了傳統(tǒng)的萃取方法，旨在為葛根生產(chǎn)加工實(shí)踐提供理論參考。

1　材料與儀器

葛根：產(chǎn)自云南；葛根素標(biāo)準(zhǔn)品：中國(guó)藥品生物制品檢定所；無水乙醇：天津市恒昊公司化學(xué)試劑廠；大孔吸附樹脂NKA-2：南開大學(xué)化工廠。

YM-40C研磨式超微粉碎機(jī)：青州市邁德森制藥機(jī)械廠；BILON-2009型智能溫控雙頻超聲波萃取儀：上海比朗儀器制造有限公司；Thermo Fisher R404A離心機(jī)：賽默飛世爾科技公司；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科技有限公司；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司；Agilent1100型高效液相色譜儀：美國(guó)安捷倫公司。

2　方法

2.1樣品處理

將葛根洗凈、晾干、切片、烘干，用粉碎機(jī)將葛根片粉碎后過80目篩得葛根粗粉。將葛根粗粉經(jīng)過超微粉碎后過300目篩得到的細(xì)粉即為葛根超微粉[3]。

2.2葛根總黃酮的提取及含量測(cè)定

采用25/35 kHz、電功率200 W的雙頻超聲和25 k Hz、電功率200 W的單頻超聲分別對(duì)葛根超微粉進(jìn)行處理，以40%乙醇為提取劑，葛根超微粉的投料量為5 g，固液比1∶20（g/mL），超聲溫度50℃，超聲時(shí)間30 min，提取后離心取上清液，剩余濾渣繼續(xù)超聲提取，分別提取4次，所得提取液在紫外分光光度計(jì)上250 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度值，并計(jì)算葛根黃酮含量。

式中：X為濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；W為樣品重量，g。

2.3葛根黃酮的純化

2.3.1大孔樹脂的純化

樣品提取液的濃度為13 mg/mL，按1 mL/min的流速通過NKA-2大孔吸附樹脂，同時(shí)檢測(cè)收集液，直至吸附飽和出現(xiàn)泄漏點(diǎn)，停止上樣，再用2 BV蒸餾水洗脫，然后用5 BV20%乙醇溶液，3 BV/h洗脫[4]，每5 mL收集一管流出液，備用檢測(cè)。

2.3.2樣品固形物含量的測(cè)定

精密量取純化前后的樣品液各5 mL，置于干燥恒重的蒸發(fā)皿中，70℃烘箱中蒸干至恒重，取出立即放入干燥器中，待至常溫后迅速稱量[5]。

式中：W1為培養(yǎng)皿烘干后恒重，mg；W2為培養(yǎng)皿+樣品液烘干后的恒重，mg；V1為樣品液體積，mL。

2.3.3葛根素的含量測(cè)定

色譜條件：AgilentC18柱，柱溫25℃，波長(zhǎng)250 nm，流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸（25∶75）（體積比），流速0.8 mL/min，進(jìn)樣量5μL，進(jìn)樣時(shí)間30 min/個(gè)。

葛根素標(biāo)準(zhǔn)品的配制：精密稱取葛根素5 mg，加30%乙醇5mL，充分溶解得到1 mg/mL葛根素標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

將葛根素標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液分別通過0.45μm濾膜過濾至1.5 mL樣品瓶中，進(jìn)行HPLC檢測(cè)，通過峰面積測(cè)定葛根素含量。

3　結(jié)果與分析

3.1葛根素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

用30%乙醇配制濃度為1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液，再用95%乙醇將其稀釋至濃度為0.1 mg/mL，從中精密吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，分別置于小試管中，并各加95%乙醇補(bǔ)充至1 mL，再分別加蒸餾水4 mL稀釋，搖勻。同時(shí)精密吸取95%乙醇1 mL，置小試管中，加水4 mL搖勻，作為空白對(duì)照溶液。250 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，見圖1。

圖1　葛根素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　Standard curve of puerarin

3.2雙頻超聲和單頻超聲輔助提取對(duì)葛根總黃酮含量的影響

雙頻超聲和單頻超聲輔助提取對(duì)葛根總黃酮含量的影響見圖2。

圖2　雙頻超聲和單頻超聲輔助提取對(duì)葛根超微粉中總黃酮含量的影響Fig.2　The influence of dual-frequency ultrasonic-assisted and single frequency ultrasonic-assisted extraction on the flavonoidscontent of the Pueraria submicron powder

由圖2可以看出，在雙頻超聲和單頻超聲處理下，葛根超微粉的4次提取過程中，第1次的黃酮提取效率均在80%以上。將4次提取的量相加得出，雙頻超聲提取中總黃酮含量為275.16 mg/g，明顯高于單頻超聲提取的190.8 mg/g，這說明雙頻超聲可以增大振幅，擴(kuò)大傳質(zhì)面積，使聲場(chǎng)比較均勻，產(chǎn)生比單頻超聲更強(qiáng)烈的空化效應(yīng)[1]。超微粉碎可以將葛根細(xì)胞壁破碎，細(xì)胞中的有效成分溶出快而且溶出率高，相應(yīng)提取的總黃酮含量就高?？梢?，將雙頻超聲技術(shù)與超微粉碎技術(shù)相結(jié)合可以促進(jìn)葛根有效成分的提取，更好地使

其功能成分得到有效利用。

3.3葛根素標(biāo)準(zhǔn)品和葛根樣品的HPLC圖譜

葛根素標(biāo)準(zhǔn)品和葛根樣品的HPLC圖譜見圖3、圖4、圖5。

圖3　葛根素標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖Fig.3　HPLC figure ofpuerarin standard substance

圖4　純化前樣品中葛根素液相色譜圖Fig.4　HPLC figure ofpuerarin in the sample before purification

圖5　純化后樣品中葛根素液相色譜圖Fig.5　HPLC figure of puerarin in the sample after purification

對(duì)葛根素標(biāo)準(zhǔn)品溶液和純化前后的樣品溶液進(jìn)行HPLC檢測(cè)。從圖3可以看出，在250 nm處，葛根素標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間為11.224 min，而且峰型陡峭、對(duì)稱，沒有雜峰。圖4和圖5在11.157 min和11.209 min均出現(xiàn)一個(gè)明顯的最大吸收峰，與標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間基本吻合，可以推斷出該峰為葛根素峰。從樣品溶液的HPLC圖譜來看，除了葛根素這個(gè)主峰之外，其余雜峰都非常小，這說明葛根素在葛根總黃酮中占有很大成分[6]。

3.4純化前后超微粉中葛根素含量的測(cè)定

以NKA-2樹脂為吸附劑，20%乙醇溶液為洗脫劑，以1 mL/min的流速進(jìn)樣，對(duì)葛根超微粉提取液進(jìn)行純化。純化前后葛根超微粉中葛根素含量的比較見表1。

表1　純化前后葛根超微粉中葛根素含量的比較Table 1　The comparison of the puerarin contentin the Pueraria submicron powder before and after purification

由表1可以看出，樣品中葛根素含量由純化前的11.15%提高到82.47%?？梢姡罂讟渲椒▽?duì)葛根黃酮的純化是可行有效的[7]，也是提取高純度葛根黃酮有效成分的較好的方法。

4　討論

1）本試驗(yàn)采用雙頻超聲技術(shù)與超微粉碎技術(shù)相結(jié)合的方法進(jìn)行葛根黃酮的提取，突破了傳統(tǒng)的萃取方法，大大提高了葛根黃酮含量。與單頻超聲相比，雙頻超聲會(huì)產(chǎn)生更強(qiáng)烈的空化效應(yīng)，提取效果更顯著。超微粉碎技術(shù)能夠提高植物細(xì)胞破壁率，顯著提高有效成分的釋放速度和釋放量，從而提高生物利用度[8]。

2）大孔樹脂吸附法是一種簡(jiǎn)單、安全、快速的分離純化方法[9]，避免了用有機(jī)溶劑純化而造成的成本高、回收難、損耗大、對(duì)環(huán)境污染等缺點(diǎn)。本研究采用的NKA-2型大孔樹脂對(duì)葛根黃酮具有良好的分離純化效果，其中葛根素含量由純化前的11.15%提高到82.47%。

3）試驗(yàn)采用HPLC法測(cè)定葛根中葛根素的含量，具有樣品用量小、分離效果好、操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點(diǎn)，可為葛根超微粉質(zhì)量控制和后續(xù)開發(fā)提供精確的檢測(cè)方法[10]。

[1]張曉燕,丘泰球,徐彥淵,等.雙頻超聲強(qiáng)化提取葛根有效部位的研究[J].食品工業(yè)科技,2006,27(3):51-54

[2] 賁永光,丘泰球.雙頻超聲對(duì)海金沙中黃酮提取率影響的研究[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào),2006,25(4):51-55

[3]張加梅,陳光芝,褚新紅.超微粉碎對(duì)提取葛根藥材中總黃酮、多糖的影響[J].中國(guó)藥業(yè),2008,17(10):45-46

[4]李適,岳明珠,李銀花,等.正交試驗(yàn)優(yōu)化葛根素的大孔樹脂純化工藝[J].食品科學(xué),2013,34(16):89-92

[5]楊欣欣,雷雪霏,曹愛民,等.葛根超微粉仿生提取條件的研究[J].遼寧化工,2008,37(3):148-149

[6]董華強(qiáng),劉福來,林麗超,等.合水粉葛異黃酮含量的紫外分光光度法和HPLC法分析研究[J].食品科學(xué),2008,29(10):477-479

[7]劉杏榮.葛根異黃酮的檢測(cè)方法與提取純化工藝研究[D].鎮(zhèn)江:江蘇大學(xué),2007:57

[8]任少偉,張文成,李兵,等.HPLC法測(cè)定葛根超細(xì)粉中葛根素含量[J].包裝與食品機(jī)械,2014,32(3):67-69

[9]肖衛(wèi)民.葛根總黃酮的微波輔助萃取與大孔樹脂純化[D].重慶:西南農(nóng)業(yè)大學(xué),2004:29

[10]夏虹,彭茂民,周有祥.葛根超微粉、葛粉中葛根素、大豆甙和大豆甙元的分析研究[J].應(yīng)用化工,2010,39(10):1601-1603

Dual-frequency Ultrasonic-assisted Extraction and Purification on Flavonoids of Pueraria Submicron Powder

YANG Li-wei，CHEN Ying，ZHANG Jun
（Tianjin Research Institution of Forestry and Pomology，Tianjin 300384，China）

Pueraria submicron powder was used as raw material.Pueraria flavonoids was extracted by dual-frequency ultrasonic strengthening methods，purified by macroporous resin adsorption method.And the content of puerarin was determined by the HPLC method.The results showed that，the flavonoids contentofdual-frequency ultrasonic-assisted extraction was 275.16 mg/g，significantly higher than 190.8 mg/g of single frequency ultra－sonic-assisted extraction，that was dual-frequency ultrasonic-assisted technology and the superfine grinding technology could promote the combination ofthe extraction ofeffective components.The content of puerarin increased from 11.15%to 82.47%by purification which was good purification effect.

Pueraria；submicron powder；flavonoids；dual-frequency ultrasonic-assisted extraction；purification

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.12.015

楊麗維（1981—），女（漢），助理研究員，碩士，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工方面的研究工作。

2016-03-21