任國印，王晶晶，張瑞林，聶勝潔，李繼印，李樹華

探針藥物法評價黃草烏酒對大鼠肝臟CYP1A2、CYP3A1和CYP2E1的影響

任國印1，王晶晶2，張瑞林1，聶勝潔1，李繼印1，李樹華1

目的 探討黃草烏酒對大鼠CYP450亞型(CYP1A2、CYP3A1、CYP2E1)的代謝活性的影響。方法 采用Cocktail探針法(咖啡因、咪達唑侖和氯唑沙宗)，利用超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)測定黃草烏酒對大鼠CYP450亞型活性影響。將大鼠隨機分為5組，分別為空白對照組、白酒組、單草烏組、低草烏酒組和高草烏酒組，各組動物連續(xù)灌胃給藥14 d，于第15 d腹腔注射Cocktail探針藥液，并于腹腔注射探針藥液前后不同時間點斷尾采血。使用UPLC-MS/MS測定各探針藥物的血藥濃度，評價CYP450亞型的代謝活性。結(jié)果 氯唑沙宗的半衰期(T1/2)均低于空白對照組(P<0.05)，表明酒精、黃草烏和黃草烏酒對CYP2E1均有明顯的誘導(dǎo)作用。與空白對照組相比，酒精對CYP1A2和CYP3A1的誘導(dǎo)不明顯。與白酒組相比，黃草烏酒對CYP3A1和CYP2E1的誘導(dǎo)以及對CYP1A2的抑制作用均無顯著性差異。結(jié)論 黃草烏與酒精合用后可誘導(dǎo)CYP2E1的活性，發(fā)生藥物間相互作用，增加黃草烏對大鼠的肝毒性。

黃草烏；酒精；Cocktail探針藥物；CYP450；UPLC-MS/MS

黃草烏為毛茛科烏頭屬植物，主要分布在滇中及滇西部地區(qū)[1]。黃草烏的主要活性成分為滇烏堿、粗莖烏頭堿甲、麗烏堿等[2]，其中的主要毒性或活性成分多為雙酯型二萜生物堿。黃草烏的塊根味麻，具有鎮(zhèn)痛、抗風(fēng)濕、抗癲癇、抗腫瘤、提高免疫力等多種藥理作用[3]。云南草烏植物資源豐富，常被制成泡酒治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及其他疑難雜癥，但由于缺乏黃草烏酒的中毒機制及體內(nèi)代謝的研究資料，用藥不當(dāng)引起的中毒案(事)件日益增多。

CYP450是存在于人體肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的一類同工酶，廣泛參與內(nèi)源性和外源性化合物的代謝，介導(dǎo)藥物間的相互作用[4-5]。CYP1A2占人體肝臟P450的13%，大多數(shù)化學(xué)物質(zhì)和毒物均由其代謝[6]，咖啡因可以作為CYP1A2的底物和抑制劑。而CYP3A4在人體肝臟和小腸表達較高，占肝臟P450的30%，大鼠與人體CYP3A4對應(yīng)的是CYP3A1，參與50%以上的臨床藥物的代謝[7]，咪達唑侖為CYP3A1/2的底物和抑制劑。CYP2E1雖然占肝臟P450的7%，卻是許多小分子有機化合物及藥物的代謝酶[8]，如乙醇、對乙酰氨基酚等，氯唑沙宗為CYP2E1的特異性底物。因此，研究黃草烏酒對CYP450的影響，對研究黃草烏酒中毒機制，指導(dǎo)臨床用藥和法醫(yī)學(xué)鑒定均具有實際意義。本研究采用Cocktail探針藥物法評價黃草烏酒對大鼠肝臟CYP1A2、CYP3A1、CYP2E1活性的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 黃草烏，產(chǎn)自云南楚雄州南華縣，取樣時間為2014年10月23日，鑒定人為云南中醫(yī)學(xué)院楊躍文副教授，標本存放于昆明醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院毒物化學(xué)系。咖啡因 (caffeine，CAF)、咪達唑侖 (midazolam，MDZ)、氯唑沙宗 (chlorzoxazone，CLZ) 標準品(中國藥品食品檢定研究院，純度均≥98.9%)。52°紅星二鍋頭(北京紅星股份有限公司)，甲醇和乙腈(色譜純，美國SIGMA公司)，甲酸等試劑均為分析純，屈臣氏去離子水。

1.2 儀器 Agilent1290型超高效液相色譜儀(美國Agilent公司)和ABI SCIEX 4000Q TRAP 串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國AB SCIEX公司)。

1.3 實驗動物 雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量(280±10) g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。每籠5只群養(yǎng)，自由攝食飲水，室溫20～24 ℃，濕度40%～60%。動物在新飼養(yǎng)環(huán)境適應(yīng)1周后進行實驗。

1.4 藥物制備

1.4.1 黃草烏乙醇浸泡液的制備 取黃草烏塊根20 g，粉碎后用無水乙醇浸泡17 d，得到72 mL浸泡液，經(jīng)UPLC-MS/MS法測定，滇烏堿、粗莖烏頭堿甲、塔拉薩敏的含量分別為0.575 mg·g-1、0.730 mg·g-1、1.405 mg·g-1。浸泡液經(jīng)氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用法分析，未檢出敵敵畏、敵百蟲、樂果和甲胺磷等農(nóng)藥殘留(當(dāng)?shù)爻Ｓ棉r(nóng)藥)，經(jīng)掃描電鏡/能譜儀分析，砷、鉛、汞的含量均低于1 μg·g-1。

1.4.2 灌胃液的制備 空白對照組灌胃液：珍茗純凈水；白酒組灌胃液：52°紅星二鍋頭；單草烏組灌胃液：取1.4.1中草烏酒2.0 mL，氮氣吹干，用少量稀鹽酸溶解，氫氧化鈉調(diào)PH 7后，純凈水溶解定容至6.0 mL；低草烏酒組灌胃液：取1.4.1中草烏酒1.0 mL，氮氣吹干后，用6.0 mL紅星二鍋頭溶解；高草烏酒組灌胃液：取1.4.1中草烏酒3.0 mL，氮氣吹干后，用6.0 mL紅星二鍋頭溶解。

1.4.3 Cocktail 探針藥物的制備 準確稱取探針藥物咖啡因、咪達唑侖各200 mg，氯唑沙宗400 mg于100 mL容量瓶中，用無水乙醇定容至100 mL，混勻后得到3種混合探針藥物(咖啡因2 mg·mL-1，咪達唑侖2 mg·mL-1，氯唑沙宗4 mg·mL-1)置4 ℃冰箱保存、備用。按大鼠體質(zhì)量(咖啡因10 mg·kg-1，咪達唑侖10 mg·kg-1，氯唑沙宗20 mg·kg-1)量取適量的探針藥液，自然揮干后，以0.1 mL吐溫-20拌勻，再以3 mL滅菌生理鹽水充分溶解后，腹腔注射至大鼠體內(nèi)。

1.5 動物實驗 將健康雄性SD大鼠30只，隨機分為5組，每組6只。分別為空白對照組、白酒組、單草烏組、低草烏酒組和高草烏酒組，每組動物按照1.4.2對應(yīng)給灌胃液0.6 mL，共14 d；第15天，按照1.4.3腹腔注射混合探針藥物，分別在給藥前(0 min)和給藥后5 min、15 min、30 min、1 h、1.5 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h斷尾取血，肝素抗凝。

1.6 樣品處理 取5～20 μL大鼠全血于EP管中，加入適量甲醇沉淀蛋白(振蕩3 min，15 000 r·min-1離心3 min)后進樣分析。

1.7 檢測條件 液相條件：ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm×1.7 μm)；流動相：A為乙腈，B為0.1%甲酸水溶液。洗脫梯度：0～0.8 min，流動相A為1%；0.8～2.5 min，流動相A由1%升到99%；2.5～3.5 min，流動相A為99%；3.5～3.6 min，流動相A由99%降到1%；3.6～6 min，流動相A為到1%。進樣體積：5 μL，流速：0.3 mL·min-1，保留時間7 min，柱溫40 ℃。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源分別采用正離子(electrosprary positive ionization，ESI+)和負離子掃描(electrosprary negative ionization,ESI-)，多反應(yīng)監(jiān)測模式(multiple reaction monitoring,MRM)，三重四極桿檢測器。3種CYP450探針藥物定量離子對的質(zhì)譜參數(shù)詳見表1。

表1 3種CYP450探針藥物的質(zhì)譜參數(shù)

注：DP/V：錐孔電壓；EP/V：入口電壓；CE/V：碰撞電壓；CXP/V：碰撞室出口電壓。

2 結(jié)果

2.1 檢測方法驗證 UPLC-MS/MS檢測不同時間點大鼠全血中3種探針藥物的濃度，采用與標準品保留時間和兩對離子對比較進行探針藥物的定性分析，外標標準曲線法進行探針藥物的定量分析?？Х纫虻木€性范圍為5～100 ng·mL-1(檢出限為0.3 ng·mL-1，定量限為1.0 ng·mL-1)；咪達唑侖的線性范圍為1～100 ng·mL-1(檢出限為0.01 ng·mL-1，定量限為0.05 ng·mL-1)；氯唑沙宗的線性范圍為1～100 ng·mL-1(檢出限為0.05 ng·mL-1，定量限為0.1 ng·mL-1)。3種探針藥物的日內(nèi)、日間精密度(n=6)均小于10%，準確度均在98%～101%之間。

2.2 5組大鼠的藥代動力學(xué)實驗結(jié)果 用DAS 2.0計算藥代動力學(xué)參數(shù)，見表2。結(jié)果顯示：與空白對照組比較，白酒組咖啡因和咪達唑侖的T1/2縮短不明顯，氯唑沙宗的T1/2明顯縮短(P<0.05)，表明白酒對CYP1A2和CYP3A1無明顯誘導(dǎo)作用，但對CYP2E1的活性有明顯誘導(dǎo)作用。單草烏組、低草烏酒組和高草烏酒組中咖啡因的T1/2延長差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，表明黃草烏及黃草烏酒對CYP1A2的活性抑制不明顯。單草烏組、低草烏酒組和高草烏酒組中咪達唑侖的T1/2均縮短，但僅低草烏酒組咪達唑侖的T1/2差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明黃草烏及黃草烏酒對CYP3A1的活性無明顯誘導(dǎo)作用。單草烏組、低草烏酒組和高草烏酒組中氯唑沙宗的T1/2較空白對照組明顯縮短50%(P<0.05)，表明黃草烏和黃草烏酒對CYP2E1的活性均有誘導(dǎo)作用。此外，高草烏酒組咪達唑侖的藥峰濃度降低，藥峰時間延長，藥—時曲線下面積降低(P<0.05)。

與白酒組比較，單草烏組、低草烏酒組和高草烏酒組中咖啡因的T1/2延長不明顯；單草烏組、低草烏酒組和高草烏酒組中咪達唑侖的T1/2縮短，但僅低草烏酒組有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，表明黃草烏酒對CYP3A1的誘導(dǎo)作用主要由乙醇引起。單草烏組、低草烏酒組和高草烏酒組中氯唑沙宗的T1/2縮短無顯著性差異。綜合分析發(fā)現(xiàn)，黃草烏與白酒合用后對CYP2E1和CYP3A1的誘導(dǎo)，以及對CYP1A2的抑制效應(yīng)均強于白酒。

表2 各組探針藥物的主要藥代動力學(xué)參數(shù)±s，n=6)

(續(xù)表)

探針藥物組別Cmax/μg·mL-1Tmax/h-1T1/2/hAUC(0～24)/μg·h·mL-1AUMC(0～24)/μg·h·mL-1MRTPO/h咪達唑侖A0.52±0.100.33±0.132.97±1.550.91±0.201.28±0.251.41±0.07B0.67±0.240.50±0.00①1.84±0.031.21±0.19①2.45±0.671.93±0.35C0.61±0.390.25±0.001.64±0.091.53±0.962.09±1.411.37±1.60D0.60±0.020.46±0.00①1.42±0.26②0.93±0.07②1.33±0.131.44±0.17E0.24±0.09①②1.00±0.291.85±0.390.63±0.15①②1.06±0.16②1.72±0.14氯唑沙宗A10.57±1.590.25±0.004.37±1.9411.02±1.9611.54±4.891.05±0.45B12.58±2.850.50±0.00①2.50±0.78①17.52±5.87①21.95±8.50①1.23±0.11C17.47±1.78①0.25±0.002.14±0.35①13.85±1.60①11.15±1.410.81±0.01D11.10±1.420.25±0.00②1.78±0.56①12.71±0.7712.51±2.34②0.99±0.21E12.14±1.320.46±0.10①2.14±0.65①14.62±2.52①14.91±3.631.01±0.09

注：①與空白組比較：P<0.05 ；②與白酒組比較：P<0.05。A：空白對照組；B：白酒組；C：單草烏組；D：低草烏酒組；E：高草烏酒組。Cmax：藥峰濃度；Tmax：藥峰時間；T1/2：半衰期；AUC：藥-時曲線下面積；AUMC：一階距藥—時曲線下面積；MRTPO：平均駐留時間。

3 討論

人體肝臟CYP450酶參與大部分藥物代謝，同時由于CYP450的誘導(dǎo)或抑制可引起藥物間的相互作用增強或減弱。CYP1A2、CYP3A4(大鼠為CYP3A1)和CYP2E1是人體內(nèi)最重要的3種CYP450酶亞型，為大多數(shù)藥物毒物的代謝酶，并且對藥物的消除影響較大，與藥物相互作用的關(guān)聯(lián)性較強[8]。黃草烏作為云南常用的藥食兩用植物，常被泡制成藥酒治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及其他疑難雜癥，但黃草烏中的成分復(fù)雜，這些成分是否會與酒精發(fā)生相互作用，增強黃草烏的毒性，導(dǎo)致人體中毒或死亡，有待研究證實。

乙醇的代謝途徑主要有乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase,ADH)的乙醇氧化途徑和微粒體乙醇氧化體系。低濃度乙醇的代謝主要和ADH乙醇氧化途徑有關(guān)，長期飲酒導(dǎo)致高濃度乙醇的代謝則與微粒體乙醇氧化體系中的CYP2El相關(guān)，乙醇可誘導(dǎo)CYP2El的活性[9-10]。康曉琳等[11]的研究表明，酒精可增強大鼠肝臟CYP2El和CYP3A的活性，引起脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致肝損傷。本研究中白酒和黃草烏酒均能誘導(dǎo)CYP2E1的活性，對CYP3A1也呈現(xiàn)誘導(dǎo)趨勢[12-13]，且黃草烏酒的誘導(dǎo)趨勢強于白酒，更容易引起大鼠肝損傷。

本研究中白酒對大鼠肝臟CYP1A2的活性無明顯誘導(dǎo)，而黃草烏酒有抑制CYP1A2的趨勢。因此，黃草烏與白酒合用后，可能抑制CYP1A2的活性，引起黃草烏中毒性成分的代謝減慢而造成毒性成分蓄積，或者經(jīng)CYP1A2代謝產(chǎn)生的活性物質(zhì)毒性較強，從而引起黃草烏中毒[14]。對于黃草烏中的主要成分滇烏堿、粗莖烏頭堿甲、麗烏堿等的體內(nèi)代謝過程、相代謝產(chǎn)物的毒性以及白酒和黃草烏合用后發(fā)生相互作用的機制還有待于進一步研究。

此外，本研究采用腹腔注射混合探針藥液，由于肝臟和小腸均存在CYP3A1，因此，腹腔注射探針藥物可能是引起咪達唑侖藥峰濃度降低，藥峰時間延長，藥—時曲線下面積降低，導(dǎo)致黃草烏酒對CYP3A1誘導(dǎo)作用不顯著的原因。同時，動物模型的給藥量也可能是造成黃草烏酒對CYP3A1誘導(dǎo)和對CYP1A2抑制不明顯的另一個原因。雖然大鼠與人體存在種屬差異、個體差異和動物實驗?zāi)Ｐ偷牟町?，但本研究結(jié)果提示，黃草烏與白酒合用后對CYP2E1和CYP3A1的誘導(dǎo)，以及對CYP1A2的抑制趨勢均強于白酒，黃草烏與白酒合用后會發(fā)生藥物間的相互作用，造成大鼠肝損傷，本研究結(jié)果對黃草烏中毒的研究和法醫(yī)學(xué)鑒定具有實踐意義。

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Effect of Aconitum Vilmorimianum Kom Liquor on Rat Liver CYP1A2,CYP3A1 and CYP2E1 by Cocktail Probe Drugs Method

Ren Guo-yin1, Wang Jing-jing2, Zhang Rui-lin1, Nie Sheng-jie1, Li Ji-yin1, Li Shu-hua1

(1. School of Forensic Medicine,Kunming Medical University, Kunmig 650500,China;2. First Affiliated Hospital, Kunming Medical University, Kuning 650031, China)

ObjectiveThe impact of aconitum vilmorimianum kom liquor on rat liver CYP450 isoforms (CYP1A2,CYP3A1 and CYP2E1) were investigted by cocktail probe drugs method.MethodsThe activity of CYP450 isoforms in rats were detected by cocktail probe drugs (caffeine,midazolam and chlorzoxazone) method with UPLC-MS/MS. The rats were randomly divided into five groups: control group, white spirit group, separate aconitum vilmorimianum kom group, low-dose aconitum vilmorimianum kom liquor group and high-dose aconitum vilmorimianum kom liquor group, which were intragastrically administrated corresponding liqiud once a day for 14 days respectively. At 15th day, all rats were injected intraperitoneally with a cocktail solution, then blood samples were taken at different time points by cutting rat′s tail. The blood concentrations of probe drugs were detected by UPLC-MS/MS to evaluate the activity of CYP450 isoforms.ResultsCompared with the control group, the half-life (T1/2) of chlorzoxazone significantly decreased in other groups(P<0.05), therefore the results indicated that alcohol, aconitum vilmorimianum kom and aconitum vilmorimianum kom liquor could induce the activity of CYP2E1 obviously. However, the inductions of alcohol were not obvous on CYP1A2 and CYP3A1. Compared with the white spirit group, the inductions of aconitum vilmorimianum kom liquor on CYP3A1 and CYP2E1 were no significant, as well as the inhibition on CYP2E1.ConclusionAconitum vilmorimianum kom liquor could induce the activity of CYP2E1 ,which could cause drugs-drugs interaction and increase the hepatotoxicity of rat.

aconitum vilmorimianum kom；alcohol；cocktail probe drugs；CYP450；UPLC-MS/MS

1672-688X(2016)04-0289-05

10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2016.04.016

云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究基金資助項目(2013FB118)云南省教育廳科學(xué)研究基金(2014Y161)

2016-09-24

1.昆明醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，云南昆明 650500 2.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，云南昆明 650031

任國印(1986-)，男，河南鹿邑人，從事法醫(yī)學(xué)研究工作。

李樹華，女，高級實驗師，Email：2530428326@qq.com

R285.5

A