趙琳琳，翟仙敦，張 振，呂 宙，夏志遠(yuǎn)，莫耀南

·法醫(yī)學(xué)·

洛陽(yáng)地區(qū)常見(jiàn)嗜尸性麗蠅的CO I序列分析

趙琳琳1，翟仙敦1，張 振1，呂 宙2，夏志遠(yuǎn)1，莫耀南1

目的 應(yīng)用多態(tài)性較高的線粒體細(xì)胞色素C氧化酶輔酶I(CO I)對(duì)洛陽(yáng)地區(qū)常見(jiàn)麗蠅科嗜尸性蠅類(lèi)大頭金蠅和絲光綠蠅進(jìn)行序列分析，以期為嗜尸性蠅類(lèi)的分子鑒定提供依據(jù)。方法 收集洛陽(yáng)地區(qū)常見(jiàn)大頭金蠅和絲光綠蠅標(biāo)本8只，經(jīng)形態(tài)學(xué)分類(lèi)鑒定后，Chelex-100法提取樣本DNA，擴(kuò)增目的片段后測(cè)序，使用相應(yīng)軟件對(duì)所得序列分析，建立種內(nèi)及種間進(jìn)化分歧率，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果 8個(gè)樣本擴(kuò)增獲得CO I的長(zhǎng)度為647 bp，CO I種間平均進(jìn)化分歧率0.116，種間范圍0.114～0.117，種內(nèi)范圍0～0.002。結(jié)論 CO I基因可以較好區(qū)分所涉及的蠅種，獲得的基因序列是蠅類(lèi)基因庫(kù)的有益補(bǔ)充。

輔酶I；嗜尸性蠅類(lèi)；雙翅目麗蠅科；序列分析；法醫(yī)昆蟲(chóng)學(xué)

利用嗜尸性蠅類(lèi)進(jìn)行死亡時(shí)間推斷，已被法醫(yī)學(xué)界廣泛認(rèn)可[1-2]。尸體上常見(jiàn)的雙翅目(Diptera)蠅類(lèi)一直是研究的熱點(diǎn)，尤其是麗蠅科[3-7]。成蟲(chóng)的形態(tài)學(xué)鑒定相對(duì)容易，卵和幼蟲(chóng)卻很難區(qū)分，且由于不同地區(qū)生活的嗜尸性蠅類(lèi)種類(lèi)有所不同，對(duì)于非昆蟲(chóng)專(zhuān)業(yè)的法醫(yī)工作者來(lái)說(shuō)，嗜尸性蠅類(lèi)種屬鑒定，始終有一定難度[2,7-8]。分子生物學(xué)技術(shù)不斷地發(fā)展，給這一研究領(lǐng)域開(kāi)辟了很多新途徑。作者選擇多態(tài)性較好的線粒體細(xì)胞色素C氧化酶輔酶I(coenzymeⅠ，CO I)基因?qū)β尻?yáng)地區(qū)常見(jiàn)麗蠅科嗜尸性蠅類(lèi)大頭金蠅和絲光綠蠅進(jìn)行序列分析和種屬鑒定，以期為嗜尸性蠅類(lèi)的分子鑒定基因庫(kù)提供有益補(bǔ)充，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 蠅類(lèi)樣本采集 誘捕采集放置于河南科技大學(xué)操場(chǎng)樹(shù)林下大鼠尸體上的大頭金蠅和絲光綠蠅各4只。EP管分類(lèi)單獨(dú)密封包裝置于-20 ℃冰箱中保存。

1.2 DNA提取 取樣本雙前腿，清洗、搗碎，用Chelex-蛋白酶K法提取腿部DNA，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴(kuò)增 采用線粒體CO I基因通用引物，目的片段長(zhǎng)度約為700 bp，引物序列[9]見(jiàn)表1?？傮w系10 μL，內(nèi)含10×PCR緩沖液(含Mg2+的)1 μL，dNTP混合物(2.5 mmol·L-1)1.2 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL，5 U·μL-1的TaKaRa Ex Taq?DNA聚合酶0.2 μL，DNA模板(含10～20 ng DNA)1.2 μL，ddH2O補(bǔ)足體系。PCR循環(huán)參數(shù)為94 ℃ 1 min；94 ℃ 1 min，45 ℃ 1.5 min，72 ℃ 1.5 min，共5次循環(huán)；94 ℃ 1 min，50 ℃ 1.5 min，72 ℃ 1 min，共35次循環(huán)；72 ℃ 8 min。

表1 線粒體CO I基因通用引物

1.4 電泳檢測(cè)及測(cè)序分析 PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳(120 V，30 min)，溴化乙錠染色，電泳后置于凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。測(cè)序引物為PCR擴(kuò)增引物，擴(kuò)增產(chǎn)物由上海立菲生物技術(shù)有限公司測(cè)序，正反鏈雙向測(cè)序以保證序列的準(zhǔn)確性。應(yīng)用Chromas Version 1.62序列分析軟件將所測(cè)8個(gè)樣本基因序列進(jìn)行整理，GenBank中作BLAST進(jìn)行序列比對(duì)搜索，然后用MEGA7.0軟件包按鄰近法(neighbor-joining，NJ)對(duì)序列進(jìn)行堿基組成、進(jìn)化分歧率和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析[10]。

2 結(jié)果

2.1 蠅種基因組提取及測(cè)序結(jié)果 本次實(shí)驗(yàn)共獲得麗蠅科金蠅屬大頭金蠅和綠蠅屬絲光綠蠅各4個(gè)樣本的DNA，擴(kuò)增片段核苷酸長(zhǎng)度在700 bp左右，經(jīng)過(guò)分析軟件去除雜帶和引物后，剩下的核苷酸片段長(zhǎng)度為647 bp。BLAST結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)樣品與GenBank中已知序列相似度大于99%，與形態(tài)鑒定結(jié)果相符合，見(jiàn)表2。

表2 8 個(gè)麗蠅科樣本線粒體CO I基因序列在線BLAST比對(duì)結(jié)果

注：Chrysomya：金蠅屬；C. Megacephala：大頭金蠅；L.sericata：絲光綠蠅。

2.2 堿基組成差異分析 對(duì)8例蠅類(lèi)成蟲(chóng)樣本的CO I基因進(jìn)行序列分析，結(jié)果顯示：保守位點(diǎn)593個(gè)，可變位點(diǎn)54個(gè)，其中簡(jiǎn)約性信息位點(diǎn)54個(gè)，自裔位點(diǎn)0個(gè)。堿基平均組成為：A=30.4%，G=15.9%，C=15.3%，T=38.4%，A+T =68.8%，具有明顯的A+T傾向性。

2.3 發(fā)育樹(shù)分析 運(yùn)用MEGA7.0軟件包對(duì)上述各種蠅類(lèi)線粒體CO I基因序列進(jìn)行分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果按照不同屬種分別聚類(lèi)，分子鑒定結(jié)果和形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致,見(jiàn)圖1。在麗蠅種的級(jí)別上，自上而下形成了鮮明的2個(gè)群聚，分別包括4只大頭金蠅和4只絲光綠蠅，支持率分別為100%和72%，效果較好；4只絲光綠蠅分聚為2小支，種間劃分清晰。

注：圖中右側(cè)依次顯示為蠅種名稱(chēng)、樣本編號(hào)，左側(cè)分支上的數(shù)字表示群聚的支持率(%)，圖左下方為標(biāo)尺，表示0.01進(jìn)化距離的長(zhǎng)度。C. Megacephala：大頭金蠅；L.sericata：絲光綠蠅。圖1 基于8 只樣本線粒體CO I基因序列構(gòu)建的NJ發(fā)育樹(shù)

2.4 種內(nèi)及種間進(jìn)化分歧 經(jīng)計(jì)算獲得麗蠅科大頭金蠅和絲光綠蠅共8個(gè)不同個(gè)體的遺傳距離，2蠅種平均進(jìn)化分歧率0.116，種間范圍0.114～0.117，種內(nèi)范圍0～0.002，種間差異和種內(nèi)差異沒(méi)有交叉，見(jiàn)表3。

表3 8個(gè)樣本線粒體CO I基因序列進(jìn)化分歧表

注：序號(hào)1～4：大頭金蠅；序號(hào)5～8：絲光綠蠅。

3 討論

只有對(duì)嗜尸性蠅類(lèi)種屬做出準(zhǔn)確鑒定，才能根據(jù)該種蠅類(lèi)的生活特性推斷個(gè)體死后間隔時(shí)間(postmortem interval,PMI)[11-12]。傳統(tǒng)的嗜尸性蠅類(lèi)形態(tài)學(xué)種屬鑒定要求具有豐富的昆蟲(chóng)學(xué)經(jīng)驗(yàn)，鑒于案發(fā)現(xiàn)場(chǎng)提取的樣本蠅類(lèi)多樣性和復(fù)雜性，對(duì)于非昆蟲(chóng)專(zhuān)業(yè)人員很難從嗜尸性蠅類(lèi)形態(tài)學(xué)鑒定其種屬。

本次實(shí)驗(yàn)共獲得麗蠅科大頭金蠅和絲光綠蠅8個(gè)蠅類(lèi)個(gè)體的DNA樣本，擴(kuò)增并測(cè)序后，經(jīng) BLAST在線比對(duì)表明實(shí)驗(yàn)樣品與GenBank中相應(yīng)蠅種已知序列相似度大于99%，分子鑒定結(jié)果與形態(tài)鑒定結(jié)果一致；對(duì)上述蠅類(lèi)mtDNA上CO I基因序列進(jìn)行分析，在麗蠅種的級(jí)別上形成大頭金蠅和絲光綠蠅2個(gè)群聚，支持率分別為100%和72%，種間劃分清晰，效果較好；本實(shí)驗(yàn)中2個(gè)蠅種平均進(jìn)化分歧率0.116，種間范圍0.114～0.117，種內(nèi)范圍0～0.002，種間差異和種內(nèi)差異沒(méi)有交叉。結(jié)果表明，洛陽(yáng)地區(qū)常見(jiàn)麗蠅科嗜尸性蠅類(lèi)大頭金蠅和絲光綠蠅的線粒體CO I(647 bp)序列能較好地對(duì)大頭金蠅和絲光綠蠅種類(lèi)進(jìn)行鑒別，且種內(nèi)差異小。因此，可以根據(jù)mtDNA中CO I基因序列的差異鑒定不同的蒼蠅個(gè)體是否同種，這與國(guó)內(nèi)相關(guān)研究結(jié)果一致[13-15]。但由于各研究采用了不同的目的基因，即便是相同的基因也分屬于不同的片段，這就對(duì)昆蟲(chóng)學(xué)分子鑒定的研究提出了更高的要求，可以考慮建立類(lèi)似人類(lèi)遺傳標(biāo)記的蠅類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)庫(kù)，便于共享和查詢(xún)相關(guān)的數(shù)據(jù)信息。

總之，本研究表明洛陽(yáng)地區(qū)常見(jiàn)麗蠅科嗜尸性蠅類(lèi)大頭金蠅和絲光綠蠅的線粒體CO I(647 bp)序列能較好地對(duì)大頭金蠅和絲光綠蠅種類(lèi)進(jìn)行鑒別，而且種內(nèi)差異小。因此，可以根據(jù)mtDNA中CO I基因序列的差異鑒定不同的蒼蠅個(gè)體是否同種，為法醫(yī)學(xué)實(shí)踐服務(wù)，而且獲得的基因序列也是嗜尸性蠅類(lèi)基因庫(kù)的有效補(bǔ)充。并且，還可與形態(tài)學(xué)鑒定互為補(bǔ)充，對(duì)死亡時(shí)間和死亡現(xiàn)場(chǎng)的推斷分析具有較高的實(shí)用價(jià)值。

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CO I Sequence Analysis of Common Calliphoridae Necrophagous Flies from Luoyang

ZHAO Lin-lin1, ZHAI Xian-dun1, ZHANG Zhen1, Lv Zhou2, XIA Zhi-yuan1, MO Yao-nan1

(1.School of Forensic Medicine,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China;2.School of criminal investigation, Southwest University of Political Science and Law, Chongqing 400031,China)

ObjectiveTo analyze the common Calliphoridae flies from Luoyang by high polymorphisms of mtDNA CO I gene for identifying the species of necrophagous flies.MethodsEight flies including C. Megacephala and L.sericata were collected and classified by entomologists with traditional morphological characteristics. The DNA of flies was extracted with Chelex-100 method. The fragments of CO I were amplified and sequenced. All the sequences were analyzed by related software packages for nucleotide composition, genetic distance computation and phylogenetic tree construction.ResultsThe result of amplification with 8 samples showed that length of the obtained CO I sequences were 647 bp. The interspecific difference in CO I ranged from 0.114 to 0.117 with an average of 0.116, while the intraspecific difference was 0 to 0.002.ConclusionThe results indicated that congeneric species could be separated by CO I gene, which could be a supplement of necrophagous flie gene pool.

coenzyme Ⅰ；necrophagous flies；Diptera Calliphoridae；sequence analysis；forensic entomology

1672-688X(2016)04-0286-03

10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2016.04.015

河南省基礎(chǔ)與前沿課題(112300410082) 河南科技大學(xué)基金(09001309，13000914，13000696)

2016-09-26

1.河南科技大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，河南洛陽(yáng) 471003 2.西南政法大學(xué)刑事偵查學(xué)院，重慶 400031

趙琳琳(1991-)，女，河南安陽(yáng)人，從事法醫(yī)物證和法醫(yī)昆蟲(chóng)學(xué)研究。

翟仙敦，女，博士，副教授，E-mail：xiandunzhai@163.com

Q969.453.2;D919.4

B