王珍珍，王公平，張 偉，裴 哲

TTN、ALK、MUC2高頻變異位點與胃癌臨床病理特征的相關(guān)性

王珍珍，王公平，張 偉，裴 哲

目的 研究胃癌的高頻變異位點并探討其與胃癌臨床病理特征的關(guān)系。方法 通過二代測序平臺對26例胃癌組織進(jìn)行靶向深度測序，與人類基因組UCSC hg19數(shù)據(jù)庫比對，篩選出胃癌中的高頻變異位點，并對臨床病理特征進(jìn)行分析。結(jié)果 胃癌中突變率較高的基因位點有TTNrs12693166 (15/26) 、rs2627043 (22/26) ，ALKrs3795850 (19/26) 、rs1881420 (23/26) ，MUC2 rs2856111(20/26) 、rs56365200 (20/26)。高頻變異位點與胃癌的年齡、性別、分化程度、腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期以及勞倫斯分型等臨床病理特征之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論TTNrs12693166、rs2627043、ALKrs3795850、rs1881420、MUC2 rs2856111、rs56365200位點在胃癌中變異頻率較高，可能與胃癌的發(fā)生存在一定的相關(guān)性。未發(fā)現(xiàn)高頻變異位點與胃癌患者的臨床病理特征存在明顯的相關(guān)性。

胃癌；測序分析；高頻變異位點；臨床病理特征

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率居全球第四位，在癌癥引起的死亡中致死率居第二位[1]。在中國，男性胃癌發(fā)病率居第二位，死亡率居第三位；女性胃癌發(fā)病率居第四位，死亡率居第二位，嚴(yán)重影響人們的生命健康和生活質(zhì)量[2]。胃癌的發(fā)生是一個多因素、多環(huán)節(jié)、多個基因共同參與的復(fù)雜過程。其中，關(guān)于胃癌基因檢測的研究已成為國內(nèi)外胃癌研究的一個熱點，并且已取得了一定的進(jìn)展[3]。隨著二代測序技術(shù)的出現(xiàn)，可以對癌癥中基因組、轉(zhuǎn)錄組及外顯子組進(jìn)行更全面的深度測序，為對癌癥更精確地診斷和分類、進(jìn)行個體化治療、合理預(yù)后評估及靶向抗癌藥物的研發(fā)提供一定的參考[4]。

本研究通過二代測序平臺對26例胃癌組織進(jìn)行靶向深度測序，通過與人類基因組UCSC hg19數(shù)據(jù)庫的比對，篩選胃癌患者中變異基因，探討高頻變異位點在胃癌中的臨床病理意義，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 ―般資料 收集2013年4月至9月在河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院胃腸腫瘤外科住院進(jìn)行手術(shù)的胃癌患者術(shù)后標(biāo)本，-80 ℃超低溫冰箱保存。入選患者術(shù)前均未經(jīng)過放療或化療，術(shù)前由胃鏡及活檢組織病理診斷，并且術(shù)后病理檢驗確認(rèn)。胃癌臨床病理分期依據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會(American Joint Committee on Cancer，AJCC)胃癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)[5]進(jìn)行分期。26例胃癌患者的中位年齡為58.5歲(39～78歲)，其中男性19例(73.1%)，女性7例(26.9%)；高分化5例，中分化7例，低分化14例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者20例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者6例。本研究經(jīng)河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會許可，采樣患者均知情同意。

1.2 測序?qū)嶒灢襟E如下

1.2.1 樣本制備 冷凍的腫瘤組織用QIAGEN公司的基因組DNA提取試劑盒，按照說明書進(jìn)行DNA的提取后定量備用。

1.2.2 文庫構(gòu)建 將基因組DNA通過超聲波隨機(jī)打斷成長度為數(shù)十至數(shù)百堿基的片段，在這些片段的兩端添加上不同的接頭，通過變性得到單鏈模板文庫，然后再通過接頭固定在相應(yīng)的固定相上。

1.2.3 測序反應(yīng) DNA測序運(yùn)用Illumina公司Hiseq 2500進(jìn)行測序，向反應(yīng)體系中同時添加DNA聚合酶、接頭引物和帶有堿基特異熒光標(biāo)記的4種dNTP。這些dNTP的3’-OH被化學(xué)方法所保護(hù)，因而每次只能添加一個dNTP。在dNTP被添加到合成鏈上后，所有未使用的游離dNTP和DNA聚合酶會被洗脫掉。加入激發(fā)熒光所需的緩沖液后，激光激發(fā)熒光信號，并由光學(xué)設(shè)備完成熒光信號的記錄，利用計算機(jī)分析將光學(xué)信號轉(zhuǎn)化為測序堿基。熒光信號記錄完成后，淬滅熒光信號并去除dNTP 3’-OH保護(hù)基團(tuán)，以便進(jìn)行下一輪的測序反應(yīng)。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 首先將原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，過濾掉含有接頭及低質(zhì)量的讀長，得到有效數(shù)據(jù)。將有效數(shù)據(jù)通過伯羅斯—惠勒變換(Burrows-Wheeler Aligner，BWA)方法比對到參考基因組(UCSC hg19)，得到最初比對結(jié)果。再用Picard和GATK軟件進(jìn)行去重復(fù)、局部重對比、堿基質(zhì)量值校正等處理，得到最終的比對結(jié)果。用GATK的Unified Genotyper模塊進(jìn)行SNV/InDel檢測。臨床病理資料的統(tǒng)計分析：運(yùn)用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件，采用Fisher精確概率法對高頻變異位點與胃癌臨床病理特征進(jìn)行分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 測序發(fā)現(xiàn)的高頻變異位點 經(jīng)過篩選過濾發(fā)現(xiàn)，突變率較高的基因位點有TTNrs12693166 (15/26)、TTNrs2627043 (22/26)、ALKrs3795850 (19/26)、ALKrs1881420 (23/26)、MUC2 rs2856111(20/26)、MUC2 rs56365200 (20/26)，詳見圖1。

圖1 胃癌中的高頻變異位點分布

2.2 高頻變異位點與胃癌臨床病理特征的相關(guān)性TTNrs12693166、rs2627043，ALKrs3795850、rs1881420，MUC2 rs2856111、rs56365200位點的變異與胃癌患者的年齡、性別、分化程度、腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期以及勞倫斯分型之間均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，詳見表1。

表1 TTN、ALK、MUG2變異位點與胃癌臨床病理特征的關(guān)系(n=26) 例

(續(xù)表)

臨床特征TTNrs12693166TTNrs2627043ALKrs3795850ALKrs1881420MUC2rs2856111MUC2rs56365200變異未變異變異未變異變異未變異變異未變異變異未變異變異未變異性別 男127172145163154136 女345252705270分化程度 高分化233241503250 中分化527043706161 低分化8612211311311395浸潤深度 T1/T2526152704370 T3/T4109163145163163136淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 有119182155173164155 無424242604251TNM分期 Ⅰ/Ⅱ738264917391 Ⅲ/Ⅳ88142133142133115勞倫斯分型 彌散型104131122113122113 混合型223131402222 腸型356244806271

注：P<0.05，有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

目前，胃癌基因檢測的研究已成為國內(nèi)外胃癌研究的熱點之一，并且已取得了一定的進(jìn)展。與第一代測序技術(shù)相比，二代測序技術(shù)因其高通量、快速、低成本的優(yōu)點，保持了較高的準(zhǔn)確度，加快了測序速度，很大程度上降低了測序的成本，在基因組學(xué)研究中已得到廣泛應(yīng)用[6]。二代測序能夠系統(tǒng)地檢測腫瘤基因組中的基因變異，并發(fā)現(xiàn)新的基因變異[7]。運(yùn)用二代測序發(fā)現(xiàn)與腫瘤相關(guān)的基因變異能夠為腫瘤發(fā)病風(fēng)險預(yù)測、早期診斷、效果評估、個體化醫(yī)療的發(fā)展提供一定的理論基礎(chǔ)，為人們進(jìn)一步了解腫瘤發(fā)病機(jī)制、篩選有效的腫瘤標(biāo)記物以及對基因組學(xué)的深入研究提供了有效途徑[8]。

通過二代測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)本研究中的26例胃癌組織中，TTN基因、ALK基因以及MUC2基因突變率較高，而突變率較高的基因位點有TTNrs12693166 (15/26)、TTNrs2627043 (22/26)、ALKrs3795850 (19/26)、ALKrs1881420 (23/26)、MUC2 rs2856111(20/26)、MUC2 rs56365200 (20/26)。TTN基因編碼肌聯(lián)蛋白，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)肌肉的被動彈性，在心肌和骨骼肌的發(fā)育、結(jié)構(gòu)形成、功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，與肌動蛋白和肌球蛋白共同構(gòu)成了人體心肌和骨骼肌的重要組成部分[9]。Pf?hler等[10]研究發(fā)現(xiàn)TTN作為存在于黑色素瘤相關(guān)性視網(wǎng)膜病患者的血清抗體中的抗原，是黑色素瘤潛在的生物標(biāo)記，可能具有致癌作用。ALK基因編碼間變性淋巴瘤受體酪氨酸激酶，作為核仁磷酸蛋白的融合伴侶首次發(fā)現(xiàn)于間變性大細(xì)胞淋巴瘤[11]。Chou等[12]發(fā)現(xiàn)2.2%的乳頭狀甲狀腺癌中存在ALK基因的易位，并且ALK基因的重排可能與乳頭狀甲狀腺癌的彌漫性硬化相關(guān)。Demeure等[13]發(fā)現(xiàn)在乳頭狀甲狀腺癌中ALK和EML4的融合可導(dǎo)致ALK的連續(xù)性激活，形成腫瘤生長及存活的通路，是腫瘤發(fā)生過程中的驅(qū)動事件。

Lee等[14]運(yùn)用熒光原位雜交技術(shù)以及二代測序技術(shù)檢測了ALK在結(jié)直腸癌中的重排，發(fā)現(xiàn)ALK重排是結(jié)直腸癌中潛在的活化驅(qū)動變異。MUC2基因能夠編碼黏蛋白，其主要表達(dá)于黏膜上皮，屬于黏膜防御機(jī)制的一道屏障。MUC2基因水平的變化可能會導(dǎo)致黏蛋白表達(dá)的異常，從而導(dǎo)致一系列病理生理變化。Marín等[15]研究發(fā)現(xiàn)MUC2的基因變異與胃癌前病變，特別是攜帶有幽門螺桿菌感染的患者，存在明顯相關(guān)性。正常胃黏膜很少或不表達(dá)MUC2，當(dāng)腸化生或者胃癌時MUC2的表達(dá)水平明顯增加[16-17]。MUC2可能是在幽門螺桿菌感染后由促炎因子的表達(dá)所激活，從而導(dǎo)致MUC2的過量表達(dá)[18]。因此，TTN、ALK、MUC2可能存在與胃癌相關(guān)的基因變異，這些位點可能與胃癌的發(fā)生、發(fā)展存在一定的聯(lián)系。

然而，將這些高頻突變位點與胃癌臨床病理特征進(jìn)行分析，并未發(fā)現(xiàn)這些位點的變異與胃癌患者的年齡、性別、分化程度、腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期以及勞倫斯分型等臨床病理特征存在明顯的相關(guān)性。鑒于本研究樣本量較少，這些高頻變異與胃癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性有待于進(jìn)一步證實。

綜上，TTNrs12693166、rs2627043、ALKrs3795850、rs1881420、MUC2 rs2856111、rs56365200位點在胃癌中變異頻率較高，可能與胃癌的發(fā)生存在一定的相關(guān)性。本研究未發(fā)現(xiàn)這些變異位點與胃癌患者的臨床病理特征存在明顯的相關(guān)性，尚需進(jìn)一步大樣本研究證實。

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Correlation betweenTTN,ALK,MUC2 Recurrent Mutation Sites and Clinicopathologic Characteristics in Gastric Cancer

WANG Zhen-zhen, WANG Gong-ping, ZHANG Wei, PEI Zhe

(College of Clinical Medicine, First Affiliated Hospital,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China)

ObjectiveTo study the recurrent mutation sites in gastric cancer and explore its relation to clinicopathologic significance of gastric cancer.MethodsNew generation sequencing was applied to 26 cases of gastric cancer tissues by the targeted deep sequencing. The sequencing data were compared with UCSC hg19 database, and the recurrent mutation sites were screened and analyzed with the clinicopathologic features of gastric cancer.ResultsThe recurrent mutation sites in gastric cancer wereTTNrs12693166(15/26),TTNrs2627043(22/26),ALKrs3795850(19/26),ALKrs1881420(23/26),MUC2 rs2856111(20/26),MUC2 rs56365200(20/26). There were no statistical significance between these recurrent mutation sites and the clinicopathological features in patients with gastric cancer.ConclusionThe recurrent mutation sites (TTNrs12693166, rs2627043,ALKrs3795850, rs1881420,MUC2 rs2856111, rs56365200) might be correlated with the carcinogenesis of gastric cancer. No significant association were found between these recurrent mutation sites and the clinicopathological features in patients with gastric cancer.

gastric cancer；sequencing analysis；recurrent mutation sites； clinicopathological characteristics

1672-688X(2016)04-0255-04

10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2016.04.005

2016-05-17

河南科技大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南洛陽 471003

王珍珍(1989- )，女，河南平頂山人，從事胃癌的基礎(chǔ)研究與臨床治療工作。

王公平，男，博士，教授，E-mail：wgpnw@126.com

R735.2

A